专利名称：：一类雷帕霉素碳酸酯类似物、其药物组合物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于药物化学领域，更具体而言，涉及一类结构新颖的雷帕霉素碳酸酯类似物(Rapalogs)或其药学上可接受的盐以及包含该类化合物的药物组合物，本发明还涉及该类化合物的制备方法和它们在制备抗胂瘤和/或抗癌药物或是免疫抑制剂药物研究中的用途。
背景技术：
：癌症是以细胞异常增殖及转移为特点的一大类疾病，已经成为严重危害人类健康的疾病之一，根据世界卫生组织统计，全球每年新增癌症病例6百万。在中国，癌症已经成为仅次于心脑血管疾病的第二大致死病因。目前临床上常用的抗肿瘤药物主要是细胞毒素类药物，具有选择性差，毒副作用强，易产生耐药性等缺点。随着近年来生物基因工程技术、分子肿瘤学和分子药理学研究的飞速发展，人们逐渐认识到细胞癌变的本质是细胞信号转导的失调，大部分肿瘤的信号转导通路活性过高导致细胞无限增殖。细胞信号转导分子是寻找新型抗肿瘤药物的重要切入点，以一些与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路的关键酶作用药物筛选靶点，发现选择性作用于耙位点的高效低毒、特异性强的新型抗肿瘤药物，已成为当前抗肿瘤药物研究开发的新方向。PI3K-mTOR信号通路是最主要的酪氨酸激酶信号转导途径之一。磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)通过磷酰化激活蛋白激酶B(PKB),后者使哺乳动物雷帕霉素耙体(mTOR)磷酰化而激活。mTOR直接或间接地参与了多个与细胞增殖和生长有关的环节的调控，被认为是一个细胞增殖的中心调控者。许多的研究结果表明PI3K-mTOR信号通路在肿瘤细胞中有异常的表达，在肿瘤的发生发展中扮演了重要的角色。因此阻断该通路，特别是抑制了mTOR的活性，就有可能特异性地抑制肿瘤细胞的生长，PI3K-mTOR信号传导通路已成为一个有希望的抗肿瘤治疗耙点。雷帕霉素(Rapamycin)是一种大环三烯内酯类抗生素，也叫西罗莫司(sirolimus)，是1975年首次由WyethAyerst实验室在Rapanui海岛分离出的吸水链霉菌发酵产生得到的，具有抗菌活性，同时作为强效免疫抑制剂已应用于临床治疗。新近的研究证明，雷帕霉素作为mTOR的特异性抑制剂，具有明显的抗肿瘤活性。体外约lng/ml雷帕霉素即可明显抑制横紋肌肉瘤细胞的生长。世界上许多实验室的研究也支持Rapamycin是一个很好的肿瘤治疗候选药物。对横紋肌肉瘤、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经管母细胞瘤、小细胞性肺癌等等肿瘤细胞均有很强的抑制作用，并且其抑制肿瘤细胞生长已很清楚地被认为是与mTOR结合的结果。尽管雷帕霉素已显示出良好的临床前抗癌活性，但因其大环内酯的低水溶性和化学稳定性，其临床开发受到限制。近年来，各大公司先后开发出多种mTOR肺瘤靶向治疗的雷帕霉素同系物。其中代表性的有由Wyeth公司开发的CCI-779(TemRapamycin)和由这些类似物具有与雷帕霉素相似的抗肿瘤作用，且药理学性质都有改善，同样也无明显的毒副作用。CCI-779适用于静注，已用于晚期肾癌患者的临床治疗。RAD-001适用于口服，对小细胞肺癌等的治疗正处于临床II期。AP23576目前对血液癌和实体瘤的治疗都正处于临床m期，显示了良好的成药前景，所以以雷帕霉素为母体进行结构改造，期望能发现一种高效低毒、特异性强的抗肿瘤药物，具有^艮高的应用价值。
发明内容本发明通过对雷帕霉素31和42位上羟基进行结构修饰和改造，合成得到一系列具有体内外抗肿瘤和/或癌症活性或是免疫抑制活性的结构新颖的雷帕霉素碳酸酯类类似物，通过水溶性、体内外药效、口服生物利用度、药物代谢等方面的考察，发现其具有进一步研究价值，可用于抗肺瘤制剂，或是作为免疫抑制剂的候选药物研发。因此，本发明的一个目的在于提供一类结构新颖的雷帕霉素碳酸酯类似物或其药学上可接受的盐。本发明的再一目的在于提供一种上述雷帕霉素碳酸酯类似物或其药学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物。本发明的又一目的在于提供上述雷帕霉素碳酸酯类似物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤和/或抗癌药物或是免疫抑制剂中的用途。本发明提供的雷帕霉素碳酸酯类似物具有如I所示结构力4式中，R,和R2各自独立地为H或o,且R,、R2不同时为H;,5.oh其中，n为1~6的整数，R3为R4或r6々7S.0&R4、Rs和R6各自独立地为H、Cl-C6羟烷基、Cl-C6烷基或C2-C6烯基，R7和Rg各自独立为H或C1-C6烷基。在本发明的优选实施方案中，所述Ri和R2各自独立地为H或
formulaseeoriginaldocumentpage9樣。&，o,且RpR2不同时为H，其中n为1~4的整数，Rs为
formulaseeoriginaldocumentpage9或
formulaseeoriginaldocumentpage9'R4,R4、R5和R^各自独立地为H或C1-C4羟烷基；R7和Rg各自独立为Cl-C4烷基。在本发明进一步优选的实施方案中，所述R,和112各自独立地为H或R3o且R,、R2不同时为H，其中n为1~2的整数,113优选为OR7或ZR8,R和Rg优选为Cl-C4烷基。更进一步，本发明有代表性的化合物为如下化合物之一:o《orrOHOHOHOHY23010
formulaseeoriginaldocumentpage11Y31-1本发明的雷帕霉素碳酸酯类似物或其药学上可接受的盐，当所述的R3中包含手性中心时，所述的雷帕霉素碳酸酯类似物或其药学上可接受的盐可以为各种旋光异构体或旋光异构体的混合物。本发明提供结构式I所示的雷帕霉素碳酸酯类似物的制备方法，当R,、'。HTn3fV^nHR《、R2相同，均为6，R3为—^或时，按如下方法制得具有如结构式l所示的醇，在对曱恭璜酸的催化作用下，与羰基化合物R7COR^或其二醇缩羰基化合物(如丙酮、2，2-二曱氧基丙烷等)在DMSO、DMF等溶剂中反应，得到如结构式2所示的醇；在碱的作用下，三光气与结构式2所示的醇反应，形成酰氯3;该酰氯3再与雷帕霉素，在碱的作用
formulaseeoriginaldocumentpage11下反应得到31，42位双取代的尺3为R4的雷帕霉素碳酸酯类似物;该雷帕霉素碳酸酯类似物进一步通过水解得到R3为&的雷帕霉素碳酸酯类似物，反应式如下
formulaseeoriginaldocumentpage12延长，上述双取代产物在反应条件下进一步转化为雷帕霉素31位单取代产物和部分雷帕霉素产物。通过TLC跟踪反应进程，控制反应时间，就可以实现雷帕霉素31位单取代产物的制备。本发明人采用适当比例的咪唑和三曱基氯硅烷，并以二氯曱烷、二氯乙烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙腈或DMF等为溶剂，雷帕霉素在室温条件下就可以快速高效的得到31位单保护产物Rapamycin-31-OTMS。在此基础上，又经过42位羟基TBS保护后再脱除稳定性较差的31位硅基保护基的方法，可以得到42位单保护产物Rapamycin-42-OTBS。反应式如下其中，在Rapamycin-31-OTMS的制备中，该反应溶剂为二氯曱烷、二氯乙烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙腈、N,N-二曱基甲酰胺；反应温度0。C40°C，反应时间248小时；反应中雷帕霉素:咪唑三曱基氯硅烷的合适当量比为1:5-30:2-6。最优选当量比为1:10-15:2-4。42位酯化产物，再脱除31位保护基后，得到相应42位单酯基化的雷帕霉素碳酸酯类似物。而后，Rapamycin-31陽OTMS可直接与酰氯反应，得到42位单保护产物Rapamycin-42-OTBS与酰氯33反应，得到31位酯化产物，再脱除42位保护基后，得到相应31位单酯基化的雷帕霉素碳酸酯类似物。本发明的雷帕霉素碳酸酯类似物药学上可接受的盐为本发明的雷帕霉素碳酸酯类似物按常规方法制备得到。本发明的药物组合物可含有治疗有效量的本发明所述雷帕霉素碳酸酯类似物或其药学上可接受的盐中的一种或多种作为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。另外，本发明人通过试验发现，本发明雷帕霉素碳酸酯类似物或其药学上可接受的盐有明显的高于雷帕霉素的抗肿瘤和癌症的活性，并且药理学和药代学性质较好，可应用于制备治疗人横紋肌肉瘤、前列腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肺腺癌、宫颈癌或白血病的药物。同时，本发明雷帕霉素碳酸酯类似物或其药学上可接受的盐，改善了雷帕霉素的水溶性，并同时保持了与雷帕霉素相当及更优的免疫抑制活性。本发明提供的抗肿瘤化合物，能有效对抗各种肿瘤细胞和/或癌细胞，并且与雷帕霉素相比，通过引入羟基等水溶性、极性基团使其水溶性增强，药理学性质得到改善。体外试验中通过在不同肿瘤林上的试验表明其抗肿瘤活性显著优于雷帕霉素(如表l-5和图3-9所示)。细胞水平研究表明Y50对Rh30、PC-3、MCF-7和CAKI-1和HL-60肺瘤细胞的生长均具有与雷帕霉素相当的抑制作用(如图l所示)；Y50能够浓度依赖地抑制Rh30、PC-3、MCF-7和CAKI-1细胞中mTOR催化其下游底物磷酸化的能力，在同等浓度下，其抑制能力与雷帕霉素相当(如图2所示)；SPR(表面等离子共振)结果表明(如表1和图9所示)1)雷帕霉素，CCI-779，Y50和Y31均能浓度依赖性地与FKBP12结合。Y50和Y31与Rapamycin相比，相同浓度14下的RU(ResponseUnit)要比Rapamycin高，说明相同浓度的Y50和Y31和FKBP-12的结合要比Rapamycin强；2)Y50和Y31与FKBP12的结合达到饱和所需要的浓度比Rapamycin低；3)Y50和Y31与FKBP12的解离速度要小于Rapamycin,同样也小于CCI-779。Y50和Y31的解离常数低于Rapamycin和CCI-779。动物实验研究表明:Y50口服给药对人横紋肌肉瘤RH-30棵小鼠移植瘤具有明显的优于雷帕霉素的生长抑制作用(表2和图3-4)。Y50口服给药对人前列腺癌PC-3棵小鼠移植瘤的生长抑制作用都显著优于雷帕霉素(如表3和图5-6所示)。其T/C分别为10.0%和40.2%,而阳性对照雷帕霉素相同剂量组对应的T/C分别为30.9%和46.5%;Y31口服给药对人骨肉癌U2SO棵小鼠移植瘤的生长具有明显的生长抑制作用。在低剂量组(2.5mg/kg)时CCI-779与雷帕霉素对人骨肉癌U2SO棵小鼠移植瘤的生长无明显抑制作用，其T/C值分别为69.0%、60.0%。而化合物Y31在低剂量(2.5mg/kg)时对该肿瘤生长的抑制作用显著优于雷帕霉素和CCI-779(如表5和图8所示)。在进一步研究本发明所提供的化合物的抗肿瘤实验中，发现该类化合物与雷帕霉素和已上市的雷帕霉素类似物CCI-779相比，Y31显示了更好的药代动力学参数(如表6-9和图10-12所示)，这可能和引入羟基等水溶性、极性基团有关。尤其需要指出的是，在使用Y31给药后，药物在肿瘤组织中的选择性吸收情况最好(如表9和图12所示)。实验发现棵鼠给予Y31后，在体内迅速转化为代谢物雷帕霉素(Rapamycin)，血浆和组织中原形药物的浓度低，最大浓度不足20ng/ml或ng/g，给药后5h检测不到原形药物。给予Y31后，血浆、肝以及肿瘤中Rapamycin的暴露量与Rapamycin给药组的比值分别为1.22、1.32和1.93。本发明雷帕霉素多友酸酯类似物或其药学上可接受的盐，不仅显示了如上所述的抗肿瘤活性和良好的药代动力学参数，同时还保持了与雷帕霉素相当及更优的免疫抑制活性。以雷帕霉素作为对照，我们以化合物Y31为例进行了系统的免疫抑制生物活性实验(结果如表10-12和图13-16所示)(1)Rapamycin及Y31对丝裂原/同种异体抗原诱导的正常小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性的影响。结果显示，Rapamycin及其衍生物Y31对明显抑制丝裂原/同种异体抗原诱导的淋巴细胞增殖反应，具有强的体外免疫抑制活性(如表ll和图13所示)。(2)Rapamycin及Y31对小鼠迟发型超敏反应的影响。DNFB诱导的DTH反应是Thl细胞介导的、包括T细胞活化和多种细胞因子产生在内的病变反应。我们检测了化合物在BALB/c小鼠DTH应答中的作用，试验结果如图14所示。DNFB诱导产生迟发型超敏反应小鼠为模型对照组，其两耳的平均耳片肿胀度为0.175mm;阳性药物Dex2mg/kg组小鼠耳片的平均肿力长度为0.13mm,与模型组比较，有显著差异；Rapamycin组小鼠的平均耳片肿胀度为0.076mm，与模型组相比，差异显著；Y31组小鼠的平均耳片肿胀度为0.129mm，与模型组相比，差异显著。实验结果显示Rapamycin和Y31能显著地抑制DNFB诱导产生的小鼠迟发型超敏反应(如图14所示)。(3)Rapamycin及Y31对SRBC诱导的小鼠脾淋巴细胞中特异性抗体生成细胞的影响。腹腔给药Rapamycin(1.5mg/kg)和其衍生物Y31(1.5mg/kg)都能显著地抑制小鼠脾脏中抗SRBC特异性抗体产生细胞的生成数量，其抑制作用强于阳性药物CsA，它们对小鼠的体液免疫功能具有明显的抑制作用(如表12所示)。(4)Rapamycin及Y31对小鼠急性移植物抗宿主病(aGVHD)的药效学研究。本试-睑结果证实，Rapamycin及衍生物Y31对于急性移植物抗宿主病(aGVHD)动物模型具有良好的治疗作用(如图15所示)。(5)Y31对牛II型胶原诱导的DBA/1小鼠关节炎的治疗作用。16皮下2次注射牛II型胶原可诱导DBA/1小鼠关节炎。关节肿胀在攻击后第四天便开始出现，一周后100%的小鼠发生了关节炎，且关节肿胀呈进行性加重，到第14天开始给药。Y31用药后显著降低CIA的发病严重程度，表现为小鼠四肢足爪肿胀明显减轻。Y31口服给药能抑制胶原诱导的DBAA小鼠关节炎发病(如图16所示)。本发明提供的雷帕霉素碳酸酯类似物具有很好的抑制肿瘤活性和免疫抑制活性，药代动力学参数较好，其制备方法简单，可操作性强，产率较高，具有很好的药物开发前景。图1为不同浓度化合物Y50对Rh30(人横纹肌肉瘤，A)、PC-3(人前列腺癌，B)、MCF(人乳腺癌，C)、CAK-1(人肾细胞癌，D)和HL-60(人白血病，E)细胞生长抑制图2为Y50对Rh30、PC-3、MCF-7和CAK-1细胞中p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平评价图3为化合物Y50对人横紋肌肉瘤Rh30棵小鼠移植瘤的生长抑制曲线图4为化合物Y50对人横紋肌肉瘤Rh30棵小鼠移植瘤的生长抑制图5为化合物Y50对人前列腺癌PC-3棵小鼠的生长抑制曲线图6为化合物Y50对人前列腺癌PC-3棵小鼠的生长抑制图。图7为化合物Y50、Y31、Y31-l、rapamycin(雷帕霉素)对人横紋肌肉瘤Rh30棵小鼠移植瘤的生长抑制曲线图。图8为化合物Y31、CCI-779、rapamycin(雷帕霉素)对人骨肉癌U2SO棵小鼠移植瘤的实验治疗作用。图9为SPR(表面等离子共振)的方法测定小分子化合物和蛋白FKBP-12的结合活性图。图10为棵鼠分别给予Y31、CCI-779和Rapamycin(雷帕霉素)后血浆中Rapamycin(雷帕霉素)的浓度-时间曲线。图11为棵鼠分别给予Y31、CCI-779和Rapamycin(雷帕霉素)后肝脏中Rapamycin(雷帕霉素)的浓度-时间曲线。图12为棵鼠分别给予Y31、CCI-779和Rapamycin(雷帕霉素)后肿瘤中Rapamycin(雷帕霉素)的浓度-时间曲线。图13为Rapamycin(雷帕霉素)及Y31对丝裂原/同种异体抗原诱导的正常小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性的影响。图14为Rapamycin(雷帕霉素)及Y31对小鼠迟发型超敏反应的影响。图15为Rapamycin(雷帕霉素)及Y31对小鼠急性移植物抗宿主病(aGVHD)的药效学研究。图16为Y31对牛II型胶原诱导的DBA/1小鼠关节炎的治疗作用具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明不局限于这些实施例。雷帕霉素碳酸酯类化合物制备实施例下述实施例中，常规后处理方法是反应完成后，在反应液中加入适量的水，分离有才M目和水相，水相在经过有机溶剂充分萃取之后，合并有机相。如有需要，依次使用5。/。HCl溶液和/或饱和NaHC03溶液，水以及饱和食盐水洗涤。有机相再用无水Na2S04或者无水MgS04干燥，过滤之后减压旋干，得到粗产物，再经过柱层析分离纯化之后得到最终产物。下述制备实施例中，NMR用Varian生产的Mercury-Vx600M仪器测定，NMR定标5H/C7.26/77.0ppm(CDC13);试剂主要由上海化学试剂公司提供，产品纯化主要用柱色谱法，硅胶(200-300目)，柱色谱法所用的硅胶型号为粗空型(ZLX-II)，由青岛海洋化工厂分厂生产。制备实施例1:化合物Y230、Y72和Y50的制备Y72取276mg(3mmo1)丙三醇溶于2mlDMSO中，氮气保护下，注入0.44ml2,2-二曱氧基丙烷，加入催化量的对曱苯磺酸。室温下搅拌数小时，TLC跟踪监测直到反应完全，经常规后处理，得液状产品2i共173mg。在50ml圆底烧瓶里加入173mg化合物2i(1.31mmo1)、130mg(0.44mmo1)三光气，氮气保护下注入25ml重蒸CH2Cl2溶液，冰水浴下逐滴滴加170jil(1.31mmol)干燥吡啶，滴加完毕后，自然升至室温下反应两小时，再加入雷帕霉素200mg(0.22mmol)，补加吡啶0.2ml,TLC跟踪监测直到反应完全；而后，向圓底烧瓶中加入1NHC1中和至弱酸性，用二氯曱烷萃取，对二氯曱烷萃取液水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸镁千燥，浓缩，以石油醚/丙酮(体积比5/1)柱层析分离得到化合物Y230共240mg，Y72作为副产物得到20mg。取化合物Y230共240mg溶于3mlTHF中，0-5。C下滴加1.7ml2NH2S04,TLC跟踪监测直到反应完全，加入5%NaHC03中和至弱碱性，用乙酸乙酯19浓缩，以石油醚/丙酮(体积比1/1)快速柱层析得到化合物Y50共120mg(总产率380/())。编号化合物结构'HNMR(CDC13，600MHz)数据Y230,、^Y23055.12-5.18(m，lH)，S4.52(m，lH),S4.26-4.34(m，2H)，S4.02-4.20(m，6H),S3.72-3.82(m，2H)，S1.36(s，3H)，S1.37(s,3H),S1.40(s,3H)，S1.38(s，3H).Y72、,、i!^Lo/、^Y72S4.50-4.56(m，1H)，S4.35-4.40(m，1H)，S4.15-4.23(m，2H)，S4.08-4.13(m，lH)，S3.78-3.82(m，lH)，S1.37(s,3H),S1.43(s,3H)Y50一HOfH,f、.^^'。rr。HY5055.12-5.16(m，1H)，S4.42-4.54(m，1H)，S4.17-4.24(m，3H)，S4.08-4.13(m，1H)，S3.85-3.96(m,2H)，S3.50-3.76(m，4H)制备实施例2:化合物Y31的制备Rapmycin-31-OTMSRapamycin取雷帕霉素400mg(0.44mmo1)、咪唑449mg(6.6mmol)溶于20ml重蒸CH2Cl2t,逐滴加入三曱基氯硅烷(TMSCl)0,22ml(1.76mmo1)，滴毕，TLC跟踪监测，反应6小时左右，减压浓缩，以石油醚/丙酮(体积比4/1)柱层析得化合物Rapamycin-31-OTMS共277mg。在50ml圓底烧瓶里加入573mg化合物3i(4.34mmol)、453mg(1.53mmo1)三光气，氮气保护下注入30ml重蒸CH2C12溶液，冰水浴下逐滴滴加377Hl(4.67mmol)干燥吡啶，滴加完毕后，自然升至室温下反应两小时，再加入277mg(0.28mmol)Rapamycin-31-OTMS;四小时后TLC监测反应完全，加入INHC1中和至弱酸性，二氯甲烷萃取，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，浓缩，以石油醚/丙酮(体积比4/1)柱层析分离得到化合物Y44共240mg。取该化合物Y44240mg溶于4mlTHF中，0-5。C下滴加1.7ml2N21H2S04,TLC跟踪监测直到反应完全，加入5。/oNaHC03中和至弱碱性，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水疏酸镁干燥，减压浓缩，以石油醚/丙酮(体积比1.5/1)柱层析得到化合物Y31共120mg。
tableseeoriginaldocumentpage22化合物Rapamycin-31-OTMS的制备见制备实施例2。在25ml圆底烧瓶里加入化合物Rapamycin-31-OTMS200mg(0.2tnmo1)、咪唑206mg(3mmo1),注入7mlDMF，再加入二曱基叔丁基氯硅烷(TBSC1)184mg(1.22mmo1)。TLC跟踪监测，室温下反应48小时后加水稀释，乙酸乙酯萃取，水洗，饱和食盐水洗，硫酸镁干燥，以石油醚/乙酸乙酯(体积比3/1)柱层析洗脱，得产物Y028共120mg。在50ml圆底烧瓶里加入173mg化合物3i(1.31mmo1)、130mg(0.44mmol)三光气，氮气保护下注入25ml重蒸CH2C12溶液，冰水浴下逐滴滴加170inl(1.31mmol)干燥吡啶，滴加完毕后，自然升至室温下反应两小时，再加入Y028共120mg(0.12mmo1)，补加吡咬0.2ml，TLC跟踪监测直到反应完全；而后，向圓底烧瓶中加入1NHC1中和至弱酸性，二氯曱烷萃取，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，浓缩，以石油醚/丙酮(体积比3/1)柱层析分离得到化合物Y86共100mg。取Y86化合物100mg溶于1.5mlTHF中，0-5。C下滴加0.8ml2NH2S04，TLC跟踪监测直到反应完全，加入5。/oNaHC03中和至弱碱性，乙酸乙酯萃tableseeoriginaldocumentpage23取，饱和食盐水洗，无水疏酸镁干燥，减压浓缩，以石油醚/丙酮(体积比快速柱层析得到化合物Y31-l共80mg。tableseeoriginaldocumentpage23生物试验实施例实施例1:细胞水平抗肺瘤活性测试实验I、Y50抑制Rh30、PC-3、MCF-7和CAKI-1和HL-60细胞的生长.用不同浓度的化合物处理Rh30细胞72小时，用SRB法检测细胞存活率。将处于对数生长期的以上各种肿瘤细胞以901/孔接种于96孔培养板，贴壁生长24小时再加药101/孔。每个浓度设三复孔。并设相应浓度的生理盐水溶媒对照及无细胞调零孔。肿瘤细胞在37。C、5。/。C02条件下培养72小时，然后倾去培养液，用10。/。冷TCA(三氯乙酸)固定细胞，4'C放置1小时后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然千燥。然后加入由1%水醋酸配制的SRB(Sigma)4mg/ml溶液1001/孔，室温中染色15分钟，去上清液，用1%醋酸洗涤5次，空气干燥。最后加入1501/孔的Tris溶液，酶标仪520nm波长下测定A值。以下列公式计算肿瘤细胞生长的抑制率4中弗iJ(a520对照孔一a520给药孔)/a52o对照孔x100Q/o结果如图1所示，证明Y50对以上各种肿瘤细胞生长均具有与雷帕霉素相当的抑制作用。II、Y50抑制Rh30、PC-3、MCF-7和CAKI-1细胞中p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平。将细胞按照一定的密度接种于12孔板中，细胞贴壁过夜后，换成新鲜的无血清培液，々几饿24小时后，加上相应浓度的药作用lh，再用IGF剌激lOmin.收样，Western,blot检测细胞中p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平。结果如图2所示，实验结果表明Y50能够浓度依赖地抑制各种肿瘤细胞中mTOR催化其下游底物磷酸化的能力。在同等浓度下，其抑制能力与雷帕霉素相当。ffl、Y50、Y31化合物与靶蛋白FKBP-12的结合活性测定实验1.材料和仪器(1)FKBP-12蛋白购于sigma公司。(2)HBS-EP緩冲液(IOmMHepes,150mMNaCl,3.4mMEDTA，0.005%(v/v)surfactantP20,pH7.4)(3)活化试剂EDC、NHS和封闭试剂Ethanolamine等，购自BIACOREAB公司(Uppsala,Sweden)(4)BIAcore3000、CM5芯片购于BIACOREAB公司(Uppsala,Sweden)2.实-险方法(1)FKBP-12蛋白的偶联用Biacore3000控制软件中氨基偶联的Wizard将Tubulin蛋白偶联到CM5芯片的FC2通道上。3.3g/L的FKBP-12蛋白用pH4.6，10mMNaAC稀释至终浓度为66pg/ml。芯片表面用0.1Ml-(3-二曱基M丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDCI)和O.lMN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)1:1混合以20|aL/min的流速进样7分钟，然后注射蛋白溶液，以pH8.5，lM乙醇胺进样7分钟，以封闭活化的芯片表面。化合物的初筛和动力学测试用SPR(表面等离子共振)的方法测定小分子化合物和蛋白FKBP-12的结合活性。化合物母液浓度为10mM，用HBS-EP緩冲液按一定比例进行稀释，用Biacore3000控制软件中的动力学分析Wizard进行动力学实验。得到的数据根据Biacore3000分析软件中的l:1Langmuir结合模型或稳态模型进行拟合，得到确切的动力学和热力学常数。SPR实验结果(如下表1和图8所示)1Rapamycin(雷帕霉素)，CCI-779,Y50和Y31均能浓度依赖性地与FKBP12结合。Y50和Y31与Rapamycin相比，相同浓度下的RU(ResponseUnit)要比Rapamycin高，说明相同浓度的Y50和Y31和FKBP-12的结合要比Rapmycin强。2.Y50和Y31与FKBP12的结合达到饱和所需要的浓度比Rapamycin低；3.Y50和Y31与FKBP12的解离速度要小于Rapamycin,同样也小于CCI-779。Y50和Y31的解离常数低于rapamycin和CCI-779。表1.SPR(表面等离子共振)的方法测定小分子化合物和蛋白FKBP-12的结合活性分析物FKBP12koff[S-1]Kd[M〗Rapamycin2.93x10*5.73xl(T31.96x10"0.438Y505.24xl050.14xl(T30.26x10-92.33Y311.05xl06O.llxl(T3o.飼o-92.41CCI-7794.26x1064.3510-31.02xl(T90.982实施例2:动物水平抗肿瘤活性测试实验实验目的观察Y50对人横紋肌肉瘤RH-30棵小鼠移植瘤的生长抑制作用。受试物Y50用5。/。吐温80、5%PEG400和DDW作为溶剂配成口服制剂。阳性对照药物雷帕霉素用5%吐温80、5。/。PEG400和DDW作为溶剂配成口服制剂。剂量设置设Y50的口服剂量为5、10mg/kg两个剂量组，每日一次口服给药；雷帕霉素设相同剂量口服给药。动物BALB/cA棵小鼠，雄性，40-45日龄，体重21:fc2g，由中国科学院上海药物研究所提供。生产许可证SCXK(沪)2004-0002。每组动物数阴性对照组6只，给药组6只。移植瘤人横紋肌肉瘤RH-30棵小鼠移植瘤，由人横紋肌肉瘤RH-30细胞林接种于棵小鼠皮下而建立。细胞接种量为5x106，接种形成移植瘤后，在棵小鼠体内传3代后使用。实验方法取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mmS左右，在无菌条件下，接种于棵小鼠右侧腋窝皮下。棵小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mmS后将动物随机分组。实验组口服给药，每天给药一次，连续给药三周。阳性对照药雷帕霉素以同样方法、同样剂量给药，共三周。阴性对照组给口服溶剂0.2ml/只。每周2次测量肿瘤直径，同时称小鼠体重。肿瘤体积(tumorvolume,TV)的计算公式为TV=1/2xax1)2其中a、b分别表示长、宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relativetumorvolume,RTV)，计算公式为RTV=Vt/V0。其中Vo为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肺瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(%)。计算公式如下T/C(%)=(TRTV/CRTV)xioo,TRTV:治疗组RTV;CRTV:阴性对照组RTV。疗效评价标准丁/(:(%)>60%为无效，T/C(%)<=60,并经统计学处理p<0.05为有效。结果Y50对人横紋肌肉瘤RH-30棵小鼠移植瘤的生长抑制作用见表2和图3、4。实验结果表明Y50每日5、10mg/kg每日口服给药一次，连续给药3周，两个剂量组对人横紋肌肉瘤RH-30棵小鼠移植瘤的生长具有明显的抑制作用，其T/C分别为32.5%和32.9%;与阳性对照雷帕霉素的高剂量U0mg/kg)组的作用相当，而雷帕霉素的低剂量(5mg/kg)组则对人橫紋肌肉瘤RH-30棵小鼠移植瘤的生长无明显抑制作用，其丁/(2值为61.8%。实验组棵小鼠无死亡现象。结论Y50口服给药对人橫紋肌肉瘤RH-30棵小鼠移植瘤具有明显的优于雷帕霉素的生长抑制作用。如下列表2和图3和图4所示。表2.Y50人横纹肌肉瘤RH-30棵小鼠移植瘤的实验治疗作用组别剂量、给药方式动物数体重(g)TV(mm3)RTVT/CP值开始最后开始最后do(%)溶剂对照0.2ml/只p.o6622.025.2134±491099±4628.9±4.2Y505mg/kg，1-5X3wp.o6622.225.8132±47380±1462.9±0.532.5<0.05Y5010mg/kg,l-5X3wp.o6623.026.0130±50415±713.5±1.132.9<0.05雷帕霉素5mg/kg,卜5X3wp.o6623.727.0124±6565013265.5±1.861.8>0.05雷帕霉素10mg/kg,l-5X3wp.o6623.325.7136±57410±1423.1±0.735.7<0.05实验同上，观察Y50对人前列腺癌PC-3棵小鼠移植瘤的生长抑制作用。结果显示，在不同的剂量组，Y50口服给药对人前列腺癌PC-3棵小鼠移植瘤的生长抑制作用都显著优于雷帕霉素。其T/C分别为10.0%和40.2%;而阳性对照雷帕霉素相同剂量组对应的T/C分别为30.9%和46.5%。如下表3和图5、图6所示。表3.Y50对人前列腺癌棵小鼠移植瘤的实验治疗作用组别剂量、给药方式动物数体重(g)TV(mm3)RTVT/CP值开始最后开始最后dod2|(%)溶剂对照0.2ml/只，卜5X3.5wp.o6622.318.2109±47629±1516.5±2.7Y505mg/kg，l-5X3.5wp.o6622.722.398±4270±590.65±0.410.0<0.01Y502.5mg/kg,l-5X3.5wp.o6619.717.7103±35273±1632.6±1.140.2<0.01Rapamycin5mg/kg，l-5X3.5wp.o6622.222.296±38170±882.0±1.230.9<0.01Rap細ycin2.5mg/kg,l-5X3.5wp.o6619.821.8100±39277±983.03±1.546.5<0.05表4.Y50、Y31、Y31-l、Rapamycin对横紋肌瘤RH-30棵小鼠移植瘤的实验治疗作用组别剂量、给药方式动物数体重(g)TV(mm3)RTVT/CP值开始最后开始最后dod14(o/o)Control0.2ml/只卜5/2w6619.721.0163±74701±3664.4±1.5溶剂对照0.2ml/只l-5/2wpo6619.221.7159±59718±1885.1±2.3116.8>0.05Y505mg/kg,1-5/2wPO6620.021.5160±47323±1242.0±0.546.6<0.05Y315mg/kg，卜5/2wPO6620.821.7160±53316±1532.0±0.545.5<0.05Y312.5mg/kg，卜5/2wpo6619.221.2159±3625911301.6±0.637.1<0.05Y31-15mg/kg，l-5/2wpo6620.221.2164±44381±1582.4±1.055.7<0.05Rapamycin5mg/kg，l-5/2wpo6619.820.3159132362±1002.4±1.054.4<0.05Rapamycin2.5mg/kg,l-5/2wP。6620.221.8164±67440±1572.8±0,863.7>0.05实验同上，观察Y50、Y31、Y31-l、Rapamycin对人横紋肌肉瘤RH-30棵小鼠移植瘤的生长抑制作用。Y31、Y50、Y31-l口服给药对人橫紋肌肉瘤RH-30棵小鼠移植瘤的生长具有明显的生长抑制作用。Y31、Y50对该肿瘤生长的抑制作用优于雷帕霉素，其中，雷帕霉素在低剂量组(2.5mg/kg)时对人横紋肌肉瘤RH-30棵小鼠移植瘤的生长无明显抑制作用，其T/C值为63.7%。而Y31在低剂量(2.5mg/kg)时就能达到较高的抑制作用，显著优于Y50及雷帕霉素高剂量组(5mg/kg)。如列表4和图7所示。28表5化合物Y31、CCI-779、Rapamycin对人骨肉癌U2SO棵小鼠移植瘤的实验治疗作用tableseeoriginaldocumentpage29实验同上，观察Y31、CCI-779、Rapamycin对人骨肉癌U2SO棵小鼠移植瘤的实验治疗作用。结果表明Y31口服给药对人骨肉癌U2SO棵小鼠移植瘤的生长具有明显的生长抑制作用。在低剂量组(2.5mg/kg)时CCI-779与雷帕霉素对人骨肉癌U2SO棵小鼠移植瘤的生长无明显抑制作用，其T/C值分别为69.0%、60.0%。而化合物Y31在低剂量(2.5mg/kg)时对该肺瘤生长的抑制作用显著优于雷帕霉素和CCI-779。实施例3:Y31、Rapamycin和CCI-779给药后Rapamycin在棵鼠体内分布研究试验本试验初步研究了棵鼠分别给予Y31、Rapamycin和CCI-779后，Rapamycin在棵鼠体内分布特征。棵鼠给药后，采集不同时间点的血浆、肝脏和肿瘤组织，以液相色语-串联质谱法测定血浆和组织中原形药物和Rapamycin的浓度。棵鼠给予Y31、Rapamycin和CCI-779后，血浆和组织中原形药物和Rapamycin的浓度见表6-8，主要的药动学参数见表9。表6棵鼠给予Y31后血浆及组织中Y31和Rapamycin的浓度动物时间Y31(ng/mloi「ng/g)Sirolimus(ng/mlorng/g)编号(h)血浆肝脏肿瘤血浆肝脏肿瘤10.53.038.61BLQ21554421.820.51,7014.3BLQ13834125.730,52.476.24BLQ17223316.3均值2.409.7217537321.3标准差0.674.14391584.742.00.7012.4BLQ13125750.752.00.5813.4BLQ16521260.362.00.2017.4BLQ40.717542.1均值0.4914.411221551.0标准差0.272.664419.175.00.180.88BLQ川10584.885.0BLQ0.91BLQ97.1"397.295.0BLQ2.16BLQ74.9163102均值1.3294.314494.7标准差0.7318.2338.91012BUJBLQBLQ7.6410460.51112BLQBU)BLQ46,168.295.81212BLQBLQBLQ60.612374.9均值38.198.477.1标准差27.427.817.71348BLQBLQBLQ3.0529.634.71448BIXBLQ3.7318.939.71548BLQBLX33.538.4039.2均值3.4419.037.9标准差0.3510.62.8BLQ:低于定量下限，0.2ng/ml(血浆)；1.0ng/g(组织)。表7棵鼠给予Rapamycin后血浆及组织中Rapamycin的浓度动物时间Sirolimus(ng/mlorng/g)编号(h)血浆肝脏肿瘤10.522050714.620.529143633.530.562.647713.7均值19147320.6标准差1173611.242.063.320675.452.01881392.9662.011123473.9均值12119350.8标准差634941.4"75.018110631.685.045.621341.095.027.699.052.5均值84.713941.7标准差83.96410.5101217.671.142.4111229.347.327.9121222.344.129.3均值23.154.233.2标准差5.914.88,013487.4023.514.114480.8010.715.615483.9213.148.1均值標15.825.9标准差3.306.819.231表8棵鼠给予CCI-779后血浆及组织中CCI-779和Rapamycin的浓度动物时间CCI-779(ng/mlorng/g)Sirolimus(ng/mlorng/g)编号(h)血浆肝脏肿瘤血浆肝脏肿瘤10.539.554922.174.414614.120.520.53924.5913883.04.3930.532.648210.61581978.59均值30.947412.41231429.03标准差9.6798.944574.8742.06,9710331.13666.740.452.011.615728.418575.634.262.016.419426.920815334.4均值11.715128.814398.436.3标准差4.7462.19347.53.575.04.1845.512.511183.930.985.04.9463.014.414.270.622.995.01.8964.422.949.597.137,0均值3.6757.616.658.283.930.3标准差1.5910.55.549.013.37.110121.3043.69.3720.940.213.011121.6118.412.94,6127.223.81212O.卯23.79.3117.232.220.6均值1.2728.610.514.233.219.1标准差0.3613.32.18.56.65.513480.164.976.483.079.7914.014480.20l.卯5.604.8610.320.615480.132.467,481.317.2615.5均值0.1643.116,523.089.1216.7标准差0.0351.630.941.781.633.532表9棵鼠给药后各待测物在血浆和组织中的主要药动学参数tableseeoriginaldocumentpage33结果表明，人横紋肌肉瘤RH-30棵小鼠移植瘤动物分别给予Y31、Rapamycin和CCI-779后，棵鼠给予Y31后，在体内迅速转化为代谢物Rapamycin,血浆和组织中原形药物的浓度低，最大浓度不足20ng/ml或ng/g,给药后5h检测不到原形药物。给予Y31后，血浆、肝以及肿瘤中Rapamycin的暴露量与Rapamycin给药组的比值分别为1.22、1.32和1.93。棵鼠给予CCI-779后，血浆和组织中可以同时对企测到原形药物CCI-779和代谢物Rapamycin,代谢物Rapamycin和原形药物在血浆、肝以及肿瘤组织中的暴露量比值分别为10.4、0.94和1.89。给予CCI-779后，血浆、肝以及肿瘤中Rapamycin的暴露量与Rapamycin给药组的比值分别为0.75、0.54和0.63。棵鼠分别给予Rapamycin后，Rapamycin在血浆中吸收迅速，达峰时间为0.52h，在肝脏中的达峰时间为0.5h,与血浆中接近，在肿瘤中的达峰时间较晚，为25h。Rapamycin在血浆和肝脏中消除较快。在三个给药组，给药后48h血浆和肝脏中的浓度为达峰浓度的1.96%~6.42%;Rapamycin在肿瘤中消除较慢，给药后48h，肿瘤中的浓度为达峰浓度的40%~51%。在三个给药组，Rapamycin在肝中的暴露量分别为血浆中的暴露量的2.26、2.01和1.51倍，在肿瘤中的暴露量分别为浆中的暴露量的1.66、1.05和0.87倍。Y31与阳性药物Rapamycin和CCI779相比，共同的有效成分Rapamycin在肝中的暴露量分别为血浆中的暴露量的2.26、2.01和1.51倍，在肿瘤中的暴露量分别为浆中的暴露量的1.66、1.05和0.87倍，表明Y31具有明显的肿瘤组织特异性。实施例4:细胞水平免疫抑制活性测试实验表10Y50、Y31、Y230、Rapamycin免疫抑制活性测试~化合物细胞毒性CC5o~T细胞抑制活性IC50安全指数CC5。/ICsoRapamycin〉100^M(3604,4.2pM>23.8Y3193nM0.05nM1860.0Y50>100|jM(7589pM)9.1pM>10.9Y230>100|^iM(39812nM)5.3pM>18.9化合物Y50、Y31、Y230的免疫抑制活性实验结果显示化合物Y31的ICso值达到50nM，显著优于母体雷帕霉素及化合物Y50，同时化合物Y31具有较高安全指数，化合物Y50、Y230免疫抑制活性与雷帕霉素相当。实施例5:Y31的免疫抑制活性测试系统实验I、Rapamycin及Y31对丝裂原/同种异体抗原诱导的正常小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性的影响试验目的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-thymidine)掺入法检测化合物体外用药对丝裂原/同种异型小鼠脾脏淋巴细胞混合培养引起的正常小鼠脾脏淋巴细胞增殖功能的影响，评价其体外免疫抑制活性。四曱基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测化合物体外用药对正常小鼠脾脏淋巴细胞活性的影响，评价其细胞毒性作用。34受试药物名称Rapamycin，Y31;性状、含量白色粉末配制方法4"C保存备用；试一验前溶于DMSO，配制母液，使用时用培养液稀释至所需浓度后使用。细胞培养时DMSO终浓度<0.02%，该浓度DMSO对细胞生长无影响。试验动物来源，种系，品系BALB/c纯系小鼠，雌性，18-20克，购自中国科学院上海实验动物中心，动物生产许可证号SCXK(沪)2002-0010号。动物饲养于上海药物研究所SPF级动物房，实验动物使用许可证号SYXK(沪)2003-0029号，动物至少飼养一周后使用。温度22土1。C,湿度55±5%,12h光暗循环。饲料和水均在消毒后由动物自由摄取。所有实验均严格按照实验动物有关条例进行。H睑方法及评《介MTT法检测化合物对小鼠脾脏淋巴细胞活性的影响小鼠脾脏淋巴细胞悬液100nU(4><105/孔)接种于96孔板，同时加入不同浓度化合物，另设相应的溶媒对照及培养液本底对照，总体积为200jil。37°C,5。/。C02培养箱中培养48小时。结束培养前6-7小时加入MTT溶液20jliK5mg/ml)。培养结束时，每孔吸出培养上清100ju1,再加入100/i1MTT溶解液，在培养箱中放置6-7小时后，用酶标仪于570nM处测定OD值。3H-TdR掺入法检测化合物对丝裂原诱导的小鼠脾脏淋巴细胞增殖功能的影响小鼠脾脏淋巴细胞悬液100pl(4xl0V孔)接种于96孔板，加入50jalConA(终浓度5ng/ml)或者50u1LPS(终浓度10jig/ml)，不同浓度化合物50jul，总体积为200jul。每个浓度三复孔，并设相应的无ConA/LPS对照孔以及无药物对照孔。37°C，5%0)2培养箱中培养48小时。培养结束前8小时，每孔加入25ia卩H-胸腺嘧咬核苷酸(10uCi/ml)。继续培养至实验结束。将细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入闪烁液后于Beta记数仪(MicroBetaTrilux，PerkinElmer储取摻入细胞DNA的3H-TdR量，以cpm值代表细胞增殖的情况。3H-TdR掺入法检测化合物对异基因抗原诱导的小鼠脾脏淋巴细胞增殖功能的影响刺激细胞的准备BALB/c小鼠脾淋巴细胞悬液，运用Gamma照射仪(Gammacell3000)进行铯137射线照射(3000Rads)使其失去增殖能力，用RPMI1640清洗2次，调细胞浓度至5xl06/ml。反应细胞的准备C57BL/6小鼠脾淋巴细胞作为反应细胞，细胞浓度5xl06/ml。混合淋巴细胞培养C57BL/6小鼠脾脏淋巴细胞悬液50接种于96孔板，加入铯137~射线处理后的BALB/C小鼠脾淋巴细胞悬液50jil,加入不同浓度化合物50|lU,总体积为200jlU。总体积不足200Ml的用RMPI-1640培养液补足。实验共设3组，BALB/C小鼠组，C57BL/6小鼠组以及BALB/C和C57BL/6混合培养组。每个浓度三复孔，并设相应的无药物对照孔，刺激细胞对照孔及反应细胞对照孔。37°C，5。/。C02培养箱中培养3-5天。培养结束前8小时，每孔加入25|il3^胸腺嘧啶核苷酸(10pCi/ml)。继续培养至实验结束。将细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入闪烁液后于Beta记数仪(MicroBetaTrilux，PerkinElmer)读取掺入细胞DNA的3H-TdR量，以cpm值代表细胞增殖的情况。结果处理及统计方法所有数据均以均数±标准差方式表示，所有各项指标检查结果经Excel2000和SPSSll.O统计软件包处理。根据实验结果绘制剂量-反应曲线，计算出CCso值(50%Cytotoxicconcentration),即对50%的细胞致死毒性浓度；IC50值(50%inhibitoryconcentration)，即指具有50%抑制效应时的化合物浓度。试验结果试验结果如图13和表11所示。Rapamycin对正常小鼠脾脏淋巴细胞的细胞毒性CC5Q=45.51jliM;浓度依赖地抑制ConA/LPS诱导的正常小鼠脾脏T/B淋巴细胞增殖反应，其IC5036分别为196.4nM和48.8nM。Y31对正常小鼠脾脏淋巴细胞的细胞毒性CC50=36.9iaM;浓度依赖地抑制ConA/LPS诱导的正常小鼠脾脏T/B淋巴细胞增殖反应，其IC5o分别为330.7nM和97.8nM。Rapamycin及Y31对同种异体抗原诱导的正常小鼠脾脏淋巴细胞的增殖反应均表现出抑制活性，Y31的免疫抑制活性更加强烈。表ll混合淋巴细胞培养样品名测定浓度(nM)CPM平均值SD抑制率BALB/C一2827—CS7-51631一混合对照-7354717—0.13424788816-35%0.33553157219-57%0.83891955250-73%2.09721638368-78%5.24291218239-83%13.1071250303-83%Rapa32.76895650-87%81.91012270-86%204.8848216-88o/0512106845-85%128096785-87%3200840132-89%8000780104-89%2000036254-95%0.1342133861-82%0.3355129649-82%0.83891202176-84%2.09721137345-85%5.24291131214-85%13.1071137321-85%Y3132.7681189325-84%81.91314231-82%204.81090130-85%512"36138-80%12801209252-84%3200113272-85%80001190591-84%20,815689-89%结果显示，Rapamycin及其衍生物Y31对明显抑制丝裂原/同种异体抗原37诱导的淋巴细胞增殖反应，具有强的体外免疫抑制活性。n、Rapamycin及Y31对小鼠迟发型超敏反应的影响试验目的应用DNFB诱发小鼠的迟发型超敏反应(DTH),观察化合物体内作用对DTH的抑制作用。小鼠经过诱导产生迟发型超敏反应，即小鼠受DNFB致敏再受DNFB攻击后，小鼠会产生耳肿胀反应。通过观察化合物对小鼠耳肿胀反应程度的影响，反映其对小鼠DTH的影响作用，探讨其对机体细胞免疫反应的影响作用。受试药物名称Rapamycin,Y31性状、含量白色粉末配制方法溶于无水乙醇，配制50mg/ml储存液；临用时配制5%PEG400+5%Tween-80无菌水作为溶剂，稀释储存液至所需浓度。试-验动物来源，种系，品系BALB/c纯系小鼠，雌性，18-20克，购自中国科学院上海实验动物中心，动物生产许可证号SCXK(沪)2002-0010号。动物伺养于上海药物研究所SPF级动物房，实验动物使用许可证号SYXK(沪)2003-0029号，动物至少饲养一周后使用。温度22土1。C,湿度55±5%,12h光暗循环。伺料和水均在消毒后由动物自由摄取。所有实验均严格按照实验动物有关条例进行。试验方法2,4-二硝基氟苯(DNFB)是一种半抗原，DNFB致敏小鼠足部后，与皮肤蛋白结合成完全抗原，一周后再次用DNFB攻击小鼠耳朵，使局部产生迟发型变态反应，引起耳肿胀的迟发型超敏反应，而未受攻击的耳朵不产生耳肿胀的迟发型超敏反应，通过耳片肺胀度反映小鼠对二硝基氟苯诱导的迟发型超敏反应的程度。(1)丙酮橄榄油(4:1)作溶剂、0.5%的DNFB溶液20M1，涂抹在小鼠的每只后腿上致敏。(2)第一次致敏后的第5天，用0.2。/。DNFB溶液涂抹到小鼠左耳两侧进行免疫攻击。右耳单涂以丙酮橄榄油(4:1)溶剂，作为对照。(3)小鼠随机分为4组模型组，Dex组(2mg/kg/d，口服给药)Rapamycin组(1.5mg/kg/d,腹腔注射给药)，Y-31组(1.5mg/kg/d,腹腔注射给药)。(4)用螺旋测微仪分别测每只小鼠左右耳厚度，将右耳厚度减去左耳厚度所得差值做为肿胀值。试验结果如图14所示DNFB诱导的DTH反应是Thl细胞介导的、包括T细胞活化和多种细胞因子产生在内的病变反应。我们检测了化合物在BALB/c小鼠DTH应答中的作用，试验结果如下图所示。DNFB诱导产生迟发型超敏反应小鼠为模型对照组，其两耳的平均耳片肿胀度为0.175mm;阳性药物Dex2mg/kg组小鼠耳片的平均肿胀度为0.13mm，与模型组比较，有显著差异；Rapamycin组小鼠的平均耳片肿胀度为0.076mm，与模型组相比，差异显著；Y31组小鼠的平均耳片肿胀度为0,129mm，与模型组相比，差异显著。实验结果显示Rapamycin和Y31能显著地抑制DNFB诱导产生的小鼠迟发型超敏反应。ffl、Rapamycin及Y31对SRBC诱导的小鼠脾淋巴细胞中特异性抗体生成细胞的影响作用试验目的小鼠经过绵羊红细胞免疫后，小鼠脾淋巴细胞中将有产生特异性抗体的细胞出现。通过^r测rapamycin及其衍生物用药后小鼠脾淋巴细胞中特异性抗体产生细胞数目变化，观察rapamycin及其衍生物对小鼠体液免疫的影响作用。受试药物名称Rapamycin，Y31性状、含量白色粉末配制方法溶于无水乙醇，配制50mg/ml储存液；临用时配制5%PEG400+5%Tween-80无菌水作为溶剂，稀释储存液至所需浓度。试-睑动物来源，种系，品系BALB/c纯系小鼠，雌性，18-20克,购自中国科学院上海实验动物中心，动物生产许可证号SCXK(沪)2002-0010号。动物饲养于上海药物研究所SPF级动物房，实验动物使用许可证号SYXK(沪)2003-0029号，动物至少饲养一周后使用。温度22士rC，湿度55±5%，12h光暗循环。伺料和水均在消毒后由动物自由摄取。所有实验均严格按照实验动物有关条例进行。豚鼠购自中国科学院上海实验动物中心，取血清(补体)用。其它试验材料绵羊红细胞(SRBC)购自上海江南生物技术工程有限公司。试-验原理在SRBC诱导的小鼠体液免疫反应模型中，用SRBC溶血反应来检测抗原特异性抗体产生情况是一种经典实验方法。绵羊红细胞定量溶血分光光度测定法(Quantitativehemolysisofshe印redbloodcells,QHS)是基于B淋巴细胞(浆细胞)产生抗SRBC特异性抗体裂解绵羊红细胞，释放血球蛋白来反映抗体生成情况的一种实验方法。绵羊红细胞(SRBC)致敏小鼠后，小鼠脾淋巴细胞中将有能产生特异性抗体的细胞出现。此类细胞产生的抗体与SRBC在补体协同作用下产生溶血反应，用分光光度法测定溶血程度，来反映产生特异性抗体的细胞数目水平。试验方法1.BALB/c小鼠随机分为五组，每组6只小鼠。40正常对照组模型对照组阳性对照组CsA10mg/kg;Rapamycin组(1.5mg/kg/d，腹腔注射给药)Y31组(1.5mg/kg/d，腹腔注射给药)各组小鼠在免疫时开始腹腔给药，每天给药l次，直至免疫后第5天。模型对照组每天给予溶剂对照。2.新鲜的绵羊红细胞(SRBC)用PBS洗涤3次后，1:5(v/v)稀释，每只小鼠腹腔注射0.2ml稀释后的SRBC进行致敏。3.免疫后第5天进行QHS检测取小鼠脾脏，制备脾淋巴细胞。分光光度法测定溶血程度脾淋巴细胞5x106，0.2%SRBC，最佳稀释比率豚鼠血清补体，混匀，37。C恒温l小时，3000rpm,IO分钟离心，取上清。在540nm处测OD值，反映产生特异性抗体的细胞数目水平。试验结果(如表12所示)绵羊红细胞定量溶血分光光度测定法(QHS)用体外B细胞分泌的抗体裂解红细胞所释放的血红蛋白量(OD值)表示，其结果可反映机体体液免疫功能。特异抗体生成细胞抑制％=(模型对照组OD-给药组OD)/(模型对照组OD-正常对照组)表12tableseeoriginaldocumentpage41试-险结论腹腔给药rapamycin(1.5mg/kg)和其衍生物Y31(1.5mg/kg)都能显著地抑制小鼠脾脏中抗SRBC特异性抗体产生细胞的生成数量，其抑制作用强于阳性药物CsA，它们对小鼠的体液免疫功能具有明显的抑制作用。IV、Rapamycin及Y31对小鼠急性移植物抗宿主病(aGVHD)的药效学研究试验目的以BABL/C小鼠为供体，C57B/6小鼠为受体，将BABL/C小鼠骨髓细胞和淋巴细胞移植入致死剂量Y射线照射后的C57B/6小鼠体内，建立急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型，考察Rapamycin及衍生物对小鼠aGVHD的药效学作用。受试药物名称Rapamycin，Y31;性状、含量白色粉末配制方法溶于无水乙醇，配制50mg/ml储存液；临用时配制5%PEG400+5%Tween-80无菌水作为溶剂，稀释储存液至所需浓度。试验动物来源，种系，品系BALB/c纯系小鼠，雌性，4周龄，C57B/6小鼠，雌性，7-8周龄，购自中国科学院上海实验动物中心，动物生产许可证号SCXK(沪)2002-0010号。动物饲养于上海药物研究所SPF级动物房，实验动物使用许可证号SYXK(沪)2003-0029号，动物至少饲养一周后使用。温度22士rC,湿度55±5%，12h光暗循环。饲料和水均在消毒后由动物自由摄取。所有实验均严格按照实验动物有关条例进行。试-睑方法1.全身照射(TBI):以C57B/6(H-2b)，雌性，7周龄小鼠为受体小鼠。Gammacell全身照射8.5Gy。2.骨髓移植受体小鼠照射4-6小时后，进行异源骨髓移植。以BABL/C(H-2d),雌性，4周龄小鼠为供体小鼠。取小鼠四肢长骨骨42髓细胞和脾脏淋巴细胞。将两种细胞浓度均调至1xio8，悬于PBS緩冲液中。等比例混合两种细胞，每只受体小鼠尾静脉注射0.5ml混合细胞悬液。3.分组及给药随机分为3组，每组样本数n-lO，骨髓移植当天开始给药，每天一次。模型组(溶剂对照)Rapamycin组(1.5mg/kg/d，腹腔注射给药)Y-31组(1.5mg/kg/d，腹腔注射给药)4.观测指标(1)体重每天称重一次。(2)记录BMT后小鼠生存时间。试验结果本试验建立急性移植物抗宿主病(aGVHD)小鼠模型，C57BL/6小鼠接受亚致死剂量8.5Gy全身照射后，注入BALB/C小鼠骨髓细胞和脾细胞，复制aGVHD模型，观察化合物对aGVHD小鼠存活和体重变化的影响。试验结果见图15，骨髓移植后，aGVHD模型小鼠体重明显降低，并出现死亡。Rapamycin及衍生物Y31对异体移植aGVHD引起的小鼠体重减轻有明显緩解作用，明显增加aGVHD小鼠的生存率，疗效明显。结果证实，Rapamycin及衍生物Y31对于急性移植物抗宿主病(aGVHD)动物模型具有良好的治疗作用。V、Y31对牛II型胶原诱导的DBA/1小鼠关节炎的治疗作用试验目的本试验用牛型胶原诱发DBA/1小鼠关节炎，体内给予Y31，通过观察小鼠关节炎发病指数的变化，观察评价Y31对小鼠关节炎的治疗作用。受试药物名称Y31;性状、含量白色粉末配制方法溶于无水乙醇，配制50mg/ml储存液；临用时配制5°/0PEG400+5%Tween-80无菌7JC作为溶剂，稀释储存液至所需浓度。试验动物及材料DBA/1小鼠，7-8周龄，体重20-22g，由日本大阪大学医学部HiromiFujiwara教授友情提供。动物饲养于上海药物研究所SPF级动物房，至少饲养一周后使用。温度22士1。C,湿度55±5%,12h光暗循环。饲料和水均在消毒后由动物自由摄取。所有实验均严格按照实验动物有关条列进行。弗氏咒全佐剂含Afyco6ac/er/wwf"6eww/os/sstrainH37Rv购自WakoPureChemicalIndustriesLtd(Osaka,Japan)试验方法关节炎才莫型牛II型胶原加入0.1M的醋酸，浓度20mg/ml,4。C冰箱过夜溶解。胶原与等体积的弗氏完全佐剂(含结核杆菌H37Rv抹)充分乳化，待雄性DBA/1小鼠麻醉后，于其尾部进行致敏，25pl/只(即250(ig/只)。3周后以相同剂量进行攻击。肉眼观察小鼠四肢，对关节炎的严重程度进行0-4级评分0=正常；l-l个或多个趾关节红或肿；2=踝关节以下中度红肿；3=包括膝关节在内的严重红肿；4=包括膝关节在内的完全红肺，关节变形、僵硬、残废。每只小鼠最高评分为16分。药物治疗小鼠随^L分成两组模型对照组Y31给药组(lmg/kg)，于攻击后第14天开始给药，连续给药三周。试验结果皮下2次注射牛II型胶原可诱导DBA/1小鼠关节炎。关节肿胀在攻击后第四天便开始出现，一周后100%的小鼠发生了关节炎，且关节肿胀呈进行性加重，到第14天开始给药。Y31用药后显著降低CIA的发病严重程度，表现为小鼠四肢足爪肿^:明显减轻(如图16，P<0.05)。Y31口服给药能抑制胶原诱导的DBA/1小鼠关节炎发病。4权利要求1、一类如结构式I所示的雷帕霉素碳酸酯类似物或其药学上可接受的盐式中，R1和R2各自独立地为H或id="icf0002"file="A2008102000730002C2.tif"wi="26"he="15"top="109"left="96"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>且R1、R2不同时为H；其中，n为1～6的整数，R3为id="icf0003"file="A2008102000730002C3.tif"wi="50"he="19"top="132"left="83"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>R4、R5和R6各自独立地为H、C1-C6羟烷基、C1-C6烷基或C2-C6烯基，R7和R8各自独立为H或C1-C6烷基。2、如权利要求1所述的如结构式I所示的雷帕霉素碳酸酯类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于，n为l-4的整数，R3为^或RsA尸8Rg'A，其中Rj、R5和R6各自独立地为H或C1-C4羟烷基；R7和Rs各自独立为Cl-C4烷基。3、如权利要求2所述的如结构式I所示的雷帕霉素碳酸酯类似物或其formulaseeoriginaldocumentpage3药学上可接受的盐，其特征在于，n为l2的整数，R3为^、OH或Rs,其中R7和Rg各自独立地为Cl-C4烷基,4、如权利要求3所述的如结构式I所示的雷帕霉素碳酸酯类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物选自如下化合物之一formulaseeoriginaldocumentpage35、如权利要求1所述的如结构式I所示的雷帕霉素碳酸酯类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于，当所述的R3中包含手性中心时，所述的雷帕霉素碳酸酯类似物或其药学上可接受的盐为旋光异构体或旋光异构体的混合物。6、如权利要求1~5中任一项所述的雷帕霉素碳酸酯类似物的制备方法，其特征在于，当R,、R2相同，均为o，&为^"r4或时，按如下方法制得具有如结构式l所示的醇，在对曱苯磺酸的催化作用下，与羰基化合物R7CORg或其二醇缩羰基化合物在DMSO或DMF溶剂中反应，得到如结构式2所示的醇；在碱的作用下，三光气与结构式2所示的醇反应，形成酰氯3;该酰氯3再与雷帕霉素，在碱的作用下反应得到31和42位双取代的R3formulaseeoriginaldocumentpage4为R4的雷帕霉素碳酸酯类似物；该雷帕霉素碳酸酯类似物进一步通formulaseeoriginaldocumentpage4过水解得到R3为R4的雷帕霉素>友酸酯类似物，反应式如下:formulaseeoriginaldocumentpage4其中，Rt、R5、R6、R7和R^的定义如所引用的权利要求所述;或者，丫ofnR3R6当Rt和R2不相同时，分别为H或O,R3为R4时，按如下方法制得R.5,OHOHR4或在适当比例的咪唑和三曱基氯硅烷存在下，以二氯甲烷、二氯乙烷、四氢呋喃、乙腈或DMF为溶剂，雷帕霉素和三甲基氯硅烷反应得到31位单保护产物Rapamycin-31-OTMS;Rapamycin-31-OTMS又经42位羟基TBS保护后再脱除稳定性较差的31位保护基，得到42位单保护产物formulaseeoriginaldocumentpage5Rapamycin-31-OTMS直接与酰氯33反应，得到42位酯化产物，再脱除31位硅基保护基后，得到相应42位单酯基化的雷帕霉素碳酸酯类似物；formulaseeoriginaldocumentpage5或者，42位单保护产物Rapamydn-42-OTBS与酰氯:应，得到31位酯化产物，再脱除42位硅基保护基后，得到相应31位单酯基化的雷帕霉素-友酸酯类似物。7、一种具有抗肿瘤和癌症活性或免疫抑制活性的药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的雷帕霉素碳酸酯类似物或其药学上可接受的盐中的一种或多种作为活性成分，并含有一种或多种药学上可接受的载体。8、权利要求1~5中任一项所述的雷帕霉素碳酸酯类似物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤和/或抗癌药物或免疫抑制剂中的用途。9、权利要求1~5中任一项所述的雷帕霉素碳酸酯类似物或其药学上可接受的盐在制备治疗人横紋肌肉瘤、前列腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肺腺癌、宫颈癌或白血病药物中的用途。全文摘要本发明属于药物化学领域，公开了结构式I所示的雷帕霉素碳酸酯类似物或其药学上可接受的盐、其药物组合物及其制备方法和用途。同雷帕霉素相比，本发明的雷帕霉素碳酸酯类似物通过引入如羟基等水溶性、极性基团使其水溶性增强，药理学和药代学性质都得到了改善。在不同肿瘤株上的生物试验表明其抗肿瘤活性优于雷帕霉素；该类化合物同雷帕霉素和已上市雷帕霉素类似物CCI-779相比，具有更好的药代动力学参数，药物更容易在肿瘤组织中吸收分布；系统的免疫抑制生物活性实验表明该类化合物具有比雷帕霉素更高的免疫抑制活性。本发明提供的雷帕霉素碳酸酯类似物制备方法简单，可操作性强，产率较高，具有很好的药物开发前景。文档编号A61P35/00GK101676291SQ20081020007公开日2010年3月24日申请日期2008年9月18日优先权日2008年9月18日发明者健丁,余琳千,南发俊,左建平,张仰明,娜杨,蒙凌华,民顾申请人:中国科学院上海药物研究所