一种重组人血管内皮抑素显像剂及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及重组人血管内皮抑素制备分子靶向显像剂【技术领域】。具体为提供一种新型的正电子放射性核素或钆标记重组人血管内皮抑素显像剂及其在对多种肿瘤新生血管状况进行的无创性、动态观测，进行抗血管生成治疗的疗效评价及疗效预测中的应用。本发明还提供了该显像剂的制备方法，通过双功能螯合剂将正电子放射性核素或钆与重组人血管内皮抑素结合。
【专利说明】一种重组人血管内皮抑素显像剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医学领域，具体涉及一种重组人血管内皮抑素制备新型血管生成显像剂及其在肿瘤血管生成显像诊断中的用途。
【背景技术】
[0002]肿瘤血管生成在肿瘤生长和转移过程中起着重要的作用。早在上个世纪70年代，Folkman教授就提出“肿瘤生长和转移有赖于新生血管形成”的理论。根据这一理论所建立
的抗肿瘤血管生成治疗-休眠疗法(dormancy therapy)已成为当今肿瘤治疗的热门研究领域之一。一些抗血管生成靶向药物已应用于临床，例如贝伐单抗、恩度等。大量的临床研究证实这些药物联合化疗或放疗给患者带来了更高的治疗有效率。根据药物作用机理，抗血管生成治疗并非直接杀死肿瘤细胞，其治疗并不能使肿瘤迅速缩小，而是抑制其生长和转移。目前用于评价化疗疗效的RECIST标准及WHO标准均是根据传统影像学观测治疗前后肿瘤大小变化来判定疗效。这样的疗效评价标准显然不能及时、准确地评价抗血管生成的治疗。随着越来越多的肿瘤抗血管生成治疗在临床的推广应用，临床上迫切需要一种新的方法来预测及评价抗血管生成治疗。
[0003]正电子发射体层显像(Positron Emission Tomography, PET)以正电子放射性核素标记的药物为显像剂，可以显示和测定所标记的显像剂在活体的分布。其可通过标记不同的生物分子显示不同的生理和病理代谢变化，例如葡萄糖、蛋白质、脂肪及核酸在活体的代谢，在疾病的早期诊断、疗效监测、病因学探讨及药物研发等方面起到了重要作用。PET/CT的发明，更是将PET高灵敏度的代谢图像与CT高分辨率的解剖图像相融合，使其在疾病的诊断中具有更高的准确性。利用正电子放射性核素进行肿瘤血管生成通路相关分子的标记，就可以通过PET或PET/CT在活体直接反映肿瘤新生血管状况，使得肿瘤血管生成分子显像成为可能。
[0004]磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)是基于核磁共振原理的成像技术，已广泛应用于多种疾病的诊断。MR显像具有无创、无害性，特别是其对软组织具有极高的分辨率。钆(Gd)络合物作为MR造影剂在上世纪80年代就已应用于临床。目前临床常用的 Gd 造影剂有:gadopentetate dimeglu-mine (gadoliniumdiethylenetriaminopenta-acetic acid-Gd-DTPA), gadoteridol(Gd-HP-D03A), gadoterate meglumine(gadolinium tetra-azacy-clododecanetetre-aceticacid-Gd-DOTA)和 gadodiamide(Gd-DTPA-bismethylamide)。应用这些Gd造影剂，可以增加肿瘤病灶的检出率。但目前应用于临床的Gd造影剂无肿瘤和器官特异性，利用Gd标记某种抗体或生物分子进行特异性的靶向MR分子显像已成为一个新的研究方向。最近，Tan等报道了利用一种特异性靶向肿瘤基质中的纤维蛋白-纤维链接蛋白复合物的MR分子显像剂，CLT1-G2-(Gd-DOTA)，进行人前列腺癌荷瘤裸鼠MR显像的研究(Pharm Res.2012; 29 (4):953-60.)。这证明利用Gd络合物标记生物分子进行靶向MR分子显像是科学可行的。
[0005]1997年，O’ Reilly等从小鼠的血管内皮瘤细胞(EOMA)的培养血清中分离出的不同于血管抑素的血管生成抑制剂，命名为Endostatin (血管内皮抑素)。对Endostatin的氨基酸序列分析显示它是胶原XVDI的C末端非胶原区的氨基酸片段，分子量为20kD，包含有184个氨基酸。Endostatin作用的直接靶点为新生血管的内皮细胞，对其它细胞及正常静止的内皮细胞没有抑制作用。2005年,重组人血管内皮抑制素(Endostar,恩度)在我国上市，联合化疗药物用于治疗II1、IV期非小细胞肺癌，具有靶向明确、无耐药性、毒副作用小、潜在抗肿瘤转移的优势。恩度在原始Endostatin序列N端基础上添加了 9个氨基酸，使其性状更稳定，保持了其在体内的活性。张金赫等应用mI对Endostatin进行标记，结果显示对Endostatin可以成功进行131I标记，并且产物对内皮细胞的抑制率还高于单纯Endostatin,在体外也具有一定的稳定性。但mI仅能用于SPECT显像,其显像分辨率较低，限制了其临床应用。
[0006]因此，鉴于传统影像学观测治疗肿瘤疗效评价和目前131I标记Endostatin作为显像剂存在的缺陷以及临床上对于预测及评价抗血管生成治疗效果的迫切需要，研制新型重组人血管内皮抑素分子靶向显像剂进行PET、PET/CT显像或MR显像是非常有必要的。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于，为进行活体无创性、动态观测肿瘤新生血管状况提供一种新型的分子靶向显像剂，可用于PET、PET/CT和MR显像。本发明的另一目的是提供该显像剂的制备方法及用途，应用正电子放射性核素或钆通过双功能螯合剂与重组人血管内皮抑素结合，制成可以供PET、PET/CT显像或者MR显像的分子靶向显像剂，用于人类或其他哺乳动物进行活体无创性、动态观测肿瘤新生血管状况。
[0008]本发明提供了一种重组人血管内皮抑制素显像剂，其特征在于，所述显像剂具有下式的通式结构:
[0009]R-双功能螯合剂-X，
`[0010]其中R为正电子放射性核素或礼，X为重组人血管内皮抑制素。
[0011]本发明所述重组人血管内皮抑制素显像剂中，所述R选自正电子放射性核素或钆(Gd)，其中正电子放射性核素选自:18F、55Co、6°Cu、61Cu、62Cu、64Cu、66Ga、68Ga、82Rb 和 86Y ;所述R-双功能螯合剂选自:[18F]SFB、[18F] SFBS, [18F] SFMB, [18F] FPA、[18F]FPPD, [18F]FBEM、[18F]FBBO, [18F]NPFP、R-DOTA-NHS、R-NOTA-NHS ;所述重组人血管内皮抑制素优选为 Endostar。
[0012]上述R-DOTA-NHS 选自:[55Co]D0TA_NHS、[60Cu] DOTA-NHS, [61Cu] DOTA-NHS,[62Cu] DOTA-NHS、[64Cu] DOTA-NHS、[66Ga] DOTA-NHS, [68GajDOTA-NHS, [86Y] DOTA-NHS, [Gd]DOTA-NHS ;所述 R-NOTA-NHS 选自:[Al18F] NOTA-NHS、[66GajNOTA-NHS, [68GajNOTA-NHS, [Gd]NOTA-NHS。
[0013]本发明还提供了一种制备重组人血管内皮抑制素显像剂的制备方法，包括如下步骤:将R-双功能螯合剂用乙腈洗脱，用氮气吹干，再与重组人血管内皮抑制素缓冲溶液反应，反应完毕后对反应产物进行洗脱分离，获得目标产物。其中R-双功能螯合剂选自:[18F]SFB、[18F]SFBS, [18F]SFMB, [18F]FPA、[18F]FPPD, [18F]FBEM, [18F]FBB0、[18F]NPFP。
[0014]本发明还提供了另一种制备重组人血管内皮抑制素显像剂的制备方法，包括如下步骤:先将双功能螯合剂与重组人血管内皮抑制素缓冲溶液反应，制备双功能螯合剂-重组人血管内皮抑制素，再应用R与双功能螯合剂-重组人血管内皮抑制素结合，反应完毕后对反应产物进行洗脱分离，获得目标产物。此处R-双功能螯合剂选自:R-DOTA-NHS、R-NOTA-NHS，其中所述 R-DOTA-NHS 选自:[55Co]D0TA_NHS、[60Cu] DOTA-NHS, [61Cu] DOTA-NHS,[62Cu] DOTA-NHS、[64Cu] DOTA-NHS、[66Ga] DOTA-NHS, [68GajDOTA-NHS, [86Y] DOTA-NHS, [Gd]DOTA-NHS ；所述 R-NOTA-NHS 选自:[Al18F] NOTA-NHS、[66GajNOTA-NHS, [68GajNOTA-NHS,[Gd]NOTA-NHS。
[0015]上述两种标记制备方法中双功能螯合剂与重组人血管内皮抑制素的摩尔比为10~40: 1，优选20: 1，反应温度为30~45°C，反应时间为10mirT60min，优选反应温度为37°C，优选反应时间为30min。反应完毕后用脱盐柱对反应产物进行洗脱分离。其中所述重组人血管内皮抑制素优选为Endostar。
[0016]本发明还提供了重组人血管内皮抑制素显像剂应用于观测肿瘤新生血管状况的活体显像中，其中正电子放射性核素标记的显像剂应用于PET或PET/CT显像，钆标记的显像剂应用于MR显像。所述肿瘤包括:肺癌、脑胶质瘤、子宫内膜异位症、血管生成性眼底病变、神经内分泌瘤、结肠癌、骨癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、食道癌、鼻咽癌、肉瘤、肾癌、胆癌、恶性黑色素肿瘤。 [0017]本发明所述靶向显像剂经静脉进入正常小鼠体内后，很快从血液向各脏器分布，主要分布于肾脏，并通过肾脏进行代谢。
[0018]本发明所述靶向显像剂经静脉进入荷瘤裸鼠体内后，除上述正常小鼠生理分布外，肿瘤对靶向显像剂也有明显摄取。
[0019]本发明的优点和积极效果在于，首次提出并证明，可以应用18F等正电子放射性核素标记重组人血管内皮抑素作为靶向分子显像剂，用于PET或PET/CT进行分子成像；可以应用Gd标记重组人血管内皮抑素作为靶向分子显像剂，用于MR分子成像，在活体无创性、动态观测肿瘤新生血管状况，有望用于肿瘤抗血管生成治疗的疗效评价及疗效预测。
[0020]此外，将重组人血管内皮抑素通过双功能螯合剂用正电子放射性核素或钆进行标记，形成靶向显像剂，在不同PH值标记条件下所获得的靶向显像剂，生物学活性与重组人血管内皮抑素原液无明显差异。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1 18F-SFB 标记 Endostar 路线图。
[0022]图2R-TLC分析图谱。
[0023]图3不同pH条件下祀向显像剂与Endostar原药活性比较。(Pl峰为19F-FB-Endostar) ο
[0024]图4 18F-FB-Endostar正常小鼠体内时间一生物分布曲线。
[0025]图5 常小鼠 18F-FB-Endostar 小动物 PET/CT 显像。
[0026]图6荷人肺腺癌A549细胞裸鼠18F-FB-Endostar显像典型图片(图中“十”所示为肿瘤部位)。
[0027]图7荷人脑恶性胶质瘤U87-MG细胞裸鼠18F-FB-Endostar显像典型图片(图中“十”所示为肿瘤部位)。
[0028]图8荷人肺腺癌A549细胞裸鼠抑制实验结果。
[0029]图9荷人脑恶性胶质瘤U87-MG细胞裸鼠抑制实验结果。【具体实施方式】
[0030]具体实施案例是进一步说明本发明但是不构成对本发明保护范围的限制。
[0031]材料:重组人血管内皮抑制素注射液一恩度(Endostar)由山东先声麦得津生物制药有限公司提供，15mg/支。18F离子为RDSlll加速器(美国CTI公司)生产。其他所有材料均为市售可得。
[0032]实施例1: 18F-FB-Endostar标记合成实验
[0033]合成步骤如下:[0034]1.加速器合成的800mCi18F离子和20mg K2.2.2、5mg K2CO3与5mg 4-三甲基胺苯甲酸乙酯三氟甲基磺酸盐在120°C加热下反应20min，然后先加入1ml0.5mmol/LNa0H溶液水解，再加入15ml 0.1mmoI/LHCL溶液，生成4-[18F]氟苯甲酸(18F-FBA)；
[0035]2.前述18F-FBA与17mg TSTU (2_琥珀酰亚胺基_1，I, 3，3-四甲基脲四氟硼酸酯)加热15min,再加入由3ml 5%的乙酸和IOmlH2O混合而得的乙酸溶液酸化,经过C-18柱纯化后得到18F-SFB (18F-N-琥珀酰亚胺-4-氟苯甲酸酯)。
[0036]3.将上述反应得到的18F-SFB用乙腈洗脱,用氮气吹干,再将Img Endostar溶于
0.5ml磷酸盐缓冲液(PH8.2)加入反应管，37°C反应30min。将最终反应产物用中性磷酸盐缓冲液(PH7.0)做流动相，经过P-1O凝胶柱(GE公司)分离，获得产物18F-FB-Endostar。
[0037]实施例2.标记物在人血清中的稳定性
[0038]将获得的500 μ Ci18F-FB-Endostar与Iml正常人血清混合后置于37°C，分别于lh、2h取样进行R-TLC分析(放射性层析分析)，观测标记物在人血清中的稳定性。
[0039]结果见图2分析，在与正常人血清混合I小时和2小时时，标记物放射峰位置未发生变化，也未出现其他放射性杂峰出现。说明标记物在血清中具有良好的稳定性，在37°C血清中2小时仍未出现明显的降解。
[0040]实施例3.不同PH值进行19F-SFB标记Endostar实验及标记后Endostar活性检测
[0041]为了验证Endostar标记后是否仍具有活性，我们进行了不同PH值条件下进行19F-SFB标记Endostar实验及标记后Endostar活性检测。为了避免在检测活性时发生放射性污染，应用无放射性的19F代替18F进行标记，而19F与18F具有完全相同的化学性质。19F-SFB由常熟华益化工有限公司合成。
[0042]分别在PH值6.5，7.0和8.0条件下，进行19F-SFB与Endostar的标记，19F-SFB与Endostar的摩尔比为20:1，反应温度为37°C，反应时间为30min。反应完毕后应用脱盐柱对反应产物进行洗脱分离，洗脱分离时获得2个峰。第I个峰(pi)为目标产物19F-FB-Endostar，第2个峰(p2)为排除项蛋白，因为峰2蛋白中标记强度较高，导致表位损失，故舍弃。将分离后的目标产物19F-FB-Endostar应用ELISA法检测与Endostar抗体的结合能力，同时与Endostar原药进行对比。结果见图3。从图3中结果可以看出，19F-FB-Endostar与Endostar原药的具有相同的Endostar抗体结合能力，而峰2不能与Endostar抗体结合。结果说明目标产物19F-FB-Endostar与Endostar原药具有相同的活性。
[0043]实施例4 =18F-FB-Endostar正常小鼠体内分布实验[0044]取正常昆明小白鼠20只，随机分为5组，每组4只，自尾静脉注射纯化的80Ci18F-FB-Endostar,于注射后15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟分别断头处死解剖，测量心、肝、脾、肾、肺、脑、血液、肌肉等组织器官每克组织的百分注射剂量，并绘制时间-生物分布曲线。观测18F-FB-Endostar在小鼠的正常生物分布数据。
[0045]18F-FB-Endostar在小鼠的正常生物分布如图4所示。18F-FB-Endostar经静脉注射进入小鼠体内后，迅速向各器官分布，主要分布于肾脏，在脑中摄取最低，考虑与血脑屏障有关，在肺中摄取也较低。基于这些数据，考虑该显像剂将来应用于脑及肺部肿瘤可能会获得更清晰的图像。
[0046]取同批次正常昆明小白鼠I只，经尾静脉注射ImCi18F-FB-End0Starl小时后，腹腔注射100mg/kg氯胺酮麻醉，小鼠俯卧位，四肢伸展，保温固定，进行小动物PET/CT显像(美国GE Explore VISTA Micro PET / CT)，共两个床位，每个床位采集约lOmin。正常小鼠18F-FB-Endostar 显像图见图 5.[0047]实施例5:荷瘤裸鼠显像实验
[0048]按常规培养肿瘤细胞(肺腺癌A-549细胞，人脑恶性胶质瘤U87-MG细胞)，细胞购自美国细胞收藏中心(American Type Culture Collection, ATCC),由山东省肿瘤医院中心实验室培养和保藏。BALB/c裸小鼠10只，雌性，鼠龄5~6周，体重15~20g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。取对数生长期上述肿瘤细胞，分别调整细胞浓度为IXlO6个/mL。每只裸鼠用Iml的注射器抽取细胞悬液100 μ 1，接种于裸鼠右前肢背部皮下。每种细胞各接种5只裸鼠。裸鼠肿瘤接种后，连续置恒温(25° C±2° C)、恒湿(45%~50%)、无菌净化屏障系统内饲养，定期观察裸鼠精神、饮食和排便，以及肿瘤的生长。待肿瘤直径长至Icm以上时开始显像实验。每只荷瘤裸鼠经尾静脉注射显像剂lmCi，注射后I小时进行小动物PET/CT显像(显像条件同正常小鼠显像条件)。
[0049]典型的荷瘤裸鼠18F-FB-Endostar显像图像见图6和图7。图6为荷人肺腺癌A549细胞裸鼠18F-FB-Endostar显像典型图片。图7为荷人脑恶性胶质瘤U87-MG细胞裸鼠18F-FB-Endostar显像典型图片。从图中可以看出，肿瘤对18F-FB-Endostar有明显的摄取。同时，富血管生成的人脑恶性胶质瘤U87-MG细胞移植瘤摄取明显高于肺腺癌A-549细胞移植瘤。肺腺癌A-549细胞移植瘤`中央有较明显坏死，显像剂主要分布于肿瘤周边。以上结果说明，18F-FB-Endostar显像剂可以进行肿瘤血管显像。
[0050]实施例6:荷瘤裸鼠“竞争抑制”显像实验
[0051]取前述荷瘤裸鼠2只，肺腺癌A-549细胞和人脑恶性胶质瘤U87-MG细胞移植瘤各I只。每只裸鼠进行两次显像，第I天显像条件同实施例4。第2天，在注射18F-FB-Endostar显像剂之前I小时，每只裸鼠通过尾静脉注射Img Endostar原药,注射显像剂后显像时间及条件与第I天显像完全相同。
[0052]图8为荷人肺腺癌A549细胞裸鼠抑制实验结果。图9为荷人脑恶性胶质瘤U87-MG细胞裸鼠抑制实验结果。从图8和图9结果可以看出，注射Endostar原药后，18F-FB-Endostar显像剂在荷瘤裸鼠肿瘤的摄取明显受到了抑制。说明18F-FB-Endostar显像剂与Endostar原药在体内具有相同的祀点，可以如实的反映Endostar原药在荷瘤裸鼠体内的分布。
【权利要求】
1.一种重组人血管内皮抑制素显像剂，其特征在于，所述显像剂具有下式的通式结构: R-双功能螯合剂-X， 其中R为正电子放射性核素或礼，X为重组人血管内皮抑制素。
2.根据权利要求1所述显像剂，其特征在于，所述R选自:18F、55C0、6°Cu、61Cu、62Cu、64Cu、66Ga、68Ga、82Rb 和 86Y。
3.根据权利要求1所述显像剂，其特征在于，所述R也可为:钆(Gd)。
4.根据权利要求1所述显像剂，其特征在于，所述R-双功能螯合剂选自:[18F]SFB、[18F] SFBS, [18F] SFMB, [18F] FPA、[18F] FPPD, [18F] FBEM, [18F]FBB0、[18F] NPFP0
5.根据权利要求1所述显像剂，其特征在于，所述R-双功能螯合剂也可选自R-DOTA-NHS、R-NOTA-NHS，其中所述 R-D0TA-NHS 选自:[55Co]D0TA_NHS、[60Cu] DOTA-NHS,[61Cu] DOTA-NHS、[62Cu] DOTA-NHS、[64Cu] DOTA-NHS, [66GajDOTA-NHS, [68GajDOTA-NHS, [86Y]DOTA-NHS, [Gd] DOTA-NHS ;所述 R-N0TA-NHS 选自:[Al18F] NOTA-NHS、[66GajNOTA-NHS, [68Ga]NOTA-NHS、 [Gd]NOTA-NHS。
6.一种如权利要求4所述显像剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 将R-双功能螯合剂用乙腈洗脱，用氮气吹干，再与重组人血管内皮抑制素缓冲溶液反应，反应完毕后对反应产物进行洗脱分离，获得目标产物。
7.—种如权利要求5所述`显像剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 先将双功能螯合剂与重组人血管内皮抑制素缓冲溶液反应，制备双功能螯合剂-重组人血管内皮抑制素，再应用R与双功能螯合剂-重组人血管内皮抑制素结合，反应完毕后对反应产物进行洗脱分离，获得目标产物。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述双功能螯合剂与重组人血管内皮抑制素的摩尔比为10-40:1。
9.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述双功能螯合剂与重组人血管内皮抑制素的摩尔比为20:1。
10.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，双功能螯合剂与重组人血管内皮抑制素结合的反应温度为3(T45°C，反应时间为10mirT60min。
11.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，双功能螯合剂与重组人血管内皮抑制素结合的反应温度为37°C，反应时间为30min。
12.权利要求1所述的重组人血管内皮抑制素显像剂应用于观测肿瘤新生血管状况的活体显像中，其中正电子放射性核素标记的显像剂应用于PET或PET/CT显像，钆标记的显像剂应用于MR显像；所述肿瘤包括:肺癌、脑胶质瘤、子宫内膜异位症、血管生成性眼底病变、神经内分泌瘤、结肠癌、骨癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、食道癌、鼻咽癌、肉瘤、肾癌、胆癌、恶性黑色素肿瘤。
13.根据权利要求1所述显像剂、权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述重组人血管内皮抑制素为Endostar。
【文档编号】A61K49/14GK103861129SQ201210532923
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月11日 优先权日:2012年12月11日
【发明者】于金明, 胡旭东, 邢力刚, 岳德胜, 张弢, 林欢 申请人:山东省肿瘤防治研究院, 江苏先声药物研究有限公司, 江苏先声药业有限公司