一种复合凝胶三维肿瘤模型支架的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种复合凝胶三维肿瘤模型支架的制备方法，包括以下步骤：将壳聚糖研磨、烘干，然后溶于冰醋酸的水溶液，得到壳聚糖溶液；排除壳聚糖溶液中的气泡；在搅拌条件下，向丝素蛋白水溶液中加入处理过的壳聚糖溶液，再加入交联剂，得到混合溶液；在搅拌条件下，向混合溶液中加入正丁醇，得到凝胶；排除凝胶中的气泡，成型，冷冻干燥，得到复合凝胶三维肿瘤模型支架。本发明使用丝素蛋白作为主料，采用较少量的壳聚糖作为辅料，使用正丁醇作为变性剂，在水溶液体系下构建肿瘤组织工程支架材料，制备的复合凝胶三维肿瘤模型支架既能保留体内细胞微环境的物质结构基础，又能模拟更加真实的肿瘤细胞生长生理条件。
【专利说明】
一种复合凝胶三维肿瘤模型支架的制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及细胞生物学领域，尤其涉及一种复合凝胶三维肿瘤模型支架的制备方法。
【背景技术】
[0002]癌症是一种复杂的疾病，取决于原癌基因的激活、肿瘤抑制基因的功能缺失突变以及环境影响下的局部和系统因素。肿瘤组织环境十分复杂，除了瘤细胞外，还有很多其他类型的细胞，如上皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞等，癌症基因的变异促使在此复杂环境中肿瘤具有不同表现和特征。肿瘤细胞中不同类型的细胞内和细胞间存在着复杂的信号传导通路，此外，由不同细胞群形成的复杂网络结构会进一步被肿瘤细胞所处的不同的物理及化学环境影响。
[0003]传统的肿瘤治疗药物的体外试验多数局限在平面的二维(2D)细胞培养系统下，忽略了肿瘤细胞间的相互作用和它们所处特殊微环境的结构特征，无法了解细胞在组织内的功能和应答反应，结果可能导致以2D细胞培养为基础的药物或生物学研究出现偏颇，并且也难以预测药物在体内的效果。
[0004]三维(3D)细胞培养模型能在体外构建与体内相近的细胞所处的空间结构系统，克服了传统2D单层细胞培养系统所存在的许多限制。3D细胞培养系统细胞培养模型能更好地模拟细胞生长的微环境，体现肿瘤细胞和间质细胞的相互作用，还能重现人体肿瘤细胞局部黏附、侵袭以及远端转移的过程，以便于更好地研究肿瘤黏附、迀移和侵袭的分子作用机制。先进的3D细胞培养模型还能够由多种不同类型的细胞组成，它的应用和发展不仅为破解细胞内外信号传导途径提供了一种有效的方式，在不同癌细胞群的基因和表观遗传多样性的背景下也促进了非基因来源方面的研究。
[0005]目前在组织工程中使用的合成高分子材料，它们在降解性等方面基本能满足支架材料的要求，但在生物相容性和细胞粘附能力方面却远不如天然高分子。丝素蛋白和壳聚糖都是优良的生物大分子，具有独特的生物特性和机械性能，是近年来比较热门的研究对象。
[0006]丝素蛋白是一种高分子纤维蛋白，在湿润状态下有很好的透气和透氧性，能够支持细胞的粘附、增殖及分化，具有优良的生物相容性。但由于丝素蛋白经过溶解、成型、干燥后脆性变大，使其实际应用受到了一定程度的限制。因此，需要对丝素蛋白进行适度地改性，改善其力学性能，提高利用率。
[0007]壳聚糖作为甲壳素的脱乙酰衍生物，来源及应用十分广泛，且自身性能优异。其表面电荷密度高，毒副作用小，可生物降解，表面带有吸水基团，吸水性强，并且具有较强的生物粘附作用。然而，壳聚糖本身具有一定的缺陷:由于溶菌酶的作用，壳聚糖降解很快，很容易失去其机械性能而造成结构上的失效。
[0008]现有技术公布的丝素蛋白-壳聚糖复合多孔支架稳定性相对较低，难以满足实际应用的需求，且制备过程繁琐，周期较长，需要先初制三维支架材料，然后在加入致孔剂，经过处理得到最终的多孔三维支架材料，所制备的支架材料孔径均匀度较差，形貌不好，不利于肿瘤细胞的粘附。
[0009]本发明利用丝素蛋白作为主体材料，将壳聚糖作为辅料与丝素蛋白共混，通过交联剂和变性剂综合作用，制备复合凝胶三维肿瘤模型支架，通过化学键作用、氢键作用、离子键作用和疏水作用等大分子间的相互作用，以改善支架的稳定性和降解性。
[0010]鉴于上述缺陷，本设计人积极加以研究创新，以期创设一种复合凝胶三维肿瘤模型支架的制备方法，使其更具有产业上的利用价值。
【发明内容】
[0011]为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种复合凝胶三维肿瘤模型支架的制备方法，该制备方法结合丝素蛋白优异的力学性能和壳聚糖丰富的活性基团，利用正丁醇作为变性剂，简化了合成步骤，缩短了制备时间，在水溶液体系下构建组织工程支架材料，探索出简单工艺，将两者复合，在保持其原有良好的生物相容性的同时，改善成型性和降解性能。该制备方法制备的复合凝胶三维肿瘤模型支架能更好地模拟细胞生长的微环境，以便于对肿瘤黏附、迀移和侵袭的分子作用机制更好地研究。
[0012]本发明的复合凝胶三维肿瘤模型支架的制备方法，包括以下步骤:
[0013](I)将壳聚糖研磨、烘干，然后溶于冰醋酸的水溶液，得到壳聚糖溶液；
[0014](2)排除步骤(I)中的壳聚糖溶液中的气泡；
[0015](3)在搅拌条件下，向丝素蛋白水溶液中加入经步骤(2)处理过的壳聚糖溶液，再加入交联剂，得到混合溶液；
[0016](4)在搅拌条件下，向步骤(3)中的混合溶液中加入正丁醇，得到变性丝素蛋白凝胶；
[0017](5)排除步骤(4)得到的变性丝素蛋白凝胶中的气泡，成型，冷冻干燥，得到复合凝胶三维肿瘤模型支架。
[0018]进一步的，在步骤(I)中，壳聚糖的分子量为8500Da。
[0019]进一步的，在步骤(2)和步骤(5)中，在4_8°C下排除气泡，以提高肿瘤细胞支架的均一性，使得支架孔径均匀，保证在凝胶三维肿瘤支架上生长的细胞处于相对均匀的培养环境中。
[0020]进一步的，在步骤(3)中，丝素蛋白与壳聚糖的质量比为10:1?50:1。
[0021]进一步的，在步骤(3)中，丝素蛋白水溶液的浓度为75_150g/L。
[0022]进一步的，在步骤(3)中，交联剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)。
[0023]进一步的，在步骤(3)中，交联剂与壳聚糖的摩尔比为50:1?1:1。
[0024]进一步的，正丁醇的体积为壳聚糖溶液和丝素蛋白水溶液总体积的1/2?1/4。
[0025]进一步的，在步骤(5)中，在-200C下预冻，然后在-80 V下冷冻成型。
[0026]进一步的，在步骤(5)中，在-200C下预冻20分钟。
[0027]进一步的，改变辅料壳聚糖的用量、变性剂正丁醇的用量或丝素蛋白溶液的浓度可以调节复合凝胶三维肿瘤模型支架的孔径和相应孔径的标准差大小。
[0028]丝素蛋白的提取方法如下:首先在碱中使蚕茧脱胶，然后清洗、干燥，得到脱胶丝素蛋白；然后将脱胶丝素蛋白溶于氯化钙、水和乙醇的三元溶液，得到水溶性丝素蛋白，然后过滤、透析，制备丝素蛋白母液;稀释丝素蛋白母液，得到不同浓度的丝素蛋白溶液。
[0029]本专利采用梯度冷冻的方式，先在-20°C下预冻，然后在-80°C下冷冻成型，由于溶剂冷冻形成的冰晶直接决定着三维支架的孔径大小，在这个过程中，先在较低温度下冷冻，缩短了冰晶形成的时间，最后形成的冰晶粒径较小，从而使制备的三维支架的孔径大小和均一性适宜，更好地满足肿瘤细胞的生长需要。
[0030]本专利使用少量的壳聚糖，起到改善混合液粘度的作用，不仅可以改善凝胶三维肿瘤模型的丝素蛋白支架主体的力学性能，提高丝素蛋白的利用率，还能够发挥壳聚糖本身的吸水性，维持肿瘤细胞生长的水性介质环境，促进细胞在凝胶三维肿瘤支架上的附着，对于培养介质要求不同的细胞可以添加不同量的壳聚糖来适应不同细胞生长对于培养接触介质的粘度需求。
[0031]本专利使用正丁醇作为变性剂，可以使得支架材料成型性好，具有开孔式、互穿网络结构，这将有利于细胞的粘附与增殖以及培养介质在支架中的流动。正丁醇使得丝素蛋白分子链受迫而互相贯穿、缠结，有利于形成规整的晶核结构，因而加速了冷冻过程中冰晶的形成速度，从而缩短了制备时间。在冰晶形成过程中变性剂正丁醇体积的膨胀也有可能产生相应的剪切力，从而促进丝素蛋白的构象变化并使之完善，使得该种凝胶支架更易于培养肿瘤细胞。
[0032]借由上述方案，本发明具有以下优点:
[0033]本发明采用天然生物材料，原料易得，生物相容性好，易于在水溶液体系下构建；本发明采用较少的壳聚糖作为改善粘度的辅料，制备出孔径均一并且形貌较好的多孔复合凝胶三维肿瘤模型支架;本发明使用正丁醇作为变性剂，代替传统的甲醇或乙醇等变性剂，改善了所制备三维支架的孔径均一性及形貌，简化了合成步骤，缩短了制备时间;本发明结合丝素蛋白优异的力学性能和壳聚糖丰富的活性基团，在水溶液体系下构建肺肿瘤组织工程支架材料，对于模拟真实的实体瘤肿瘤生长环境具有独特的优势;工艺简单，将丝素蛋白作为主要材料，将少量的壳聚糖作为辅料，保持了二者的生物相容性，改善成型性和降解性;构建的复合凝胶三维肿瘤模型支架的孔径可通过改变壳聚糖溶液和变性剂的用量以及丝素蛋白溶液的浓度进行调节;构建的复合凝胶三维肿瘤模型支架，为肿瘤细胞提供生长基质，细胞通过紧密连接或缝隙连接等连接方式建立细胞间及细胞与胞外基质间的联系，形成一定的三维结构，生长速度更快，能够更加准确地模拟更加真实的肿瘤细胞生长生理条件。
[0034]上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下为本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
【附图说明】
[0035]图1是本发明实施例1中制备的丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架上7天后A549细胞生长的SEM图；
[0036]图2是不同支架的红外吸收谱图；
[0037]图3是不同支架的XRD谱图；
[0038]图4是本发明实施例2制备的丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架SEM图；
[0039]图5是本发明的丝素蛋白溶液浓度对所制备的丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架孔径的影响图；
[0040]图6是本发明正丁醇加入体积对所制备的丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架孔径的影响图；
[0041]图7是本发明壳聚糖溶液的加入量对所制备的丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架孔径的影响图；
[0042]图8是本发明所制备的丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架与二维支架培养细胞蛋白含量的比较图；
[0043]图9是本发明所制备的丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架上生长的细胞状态的激光共聚焦显微镜照片。
【具体实施方式】
[0044]下面结合附图和实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0045]提取丝素蛋白的步骤如下:
[0046](I)配制21^农度为0.005g/mL的碳酸钠水溶液，取1g蚕茧，加入IL上述碳酸钠水溶液，100°C下反应lh，将溶液倒出，换上余下的碳酸钠水溶液，100°C下继续反应lh，然后用去离子水清洗3次，放入50 V烘箱中烘干，得到脱胶蚕丝。
[0047](2)将脱胶蚕丝剪碎，并溶解在CaCl2 = H2O = C2H5OH(摩尔比为1:8:2)的三元溶液中，78°C下恒温搅拌溶解4h，得到水溶性丝素蛋白溶液，然后用医用八层纱布过滤2遍，在透析袋(截留分子量=8000-14000Da)中双蒸水透析12h，每隔I h换液一次。
[0048](3)继续用10%的聚乙二醇(分子量为20000g/mol)透析12h，得到丝素蛋白母液，将丝素蛋白母液储存在4 V下的冰箱中备用。
[0049](4)通过称重法测定丝素蛋白母液的浓度，其它浓度的溶液由母液稀释得到。
[0050]透析好的样品要尽量避免强烈搅拌和震荡以及接触有机溶剂等，以防引起构象的变化，而在稀释过程中也要尽量避免过于剧烈的搅拌。
[0051 ] 实施例1
[0052]1.丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架的制备
[0053]取适量壳聚糖(分子量为8500Da)放入研钵研细，并在50°C烘箱烘干，然后称取Ig粉末，加入到I OOmL浓度为I %的冰乙酸水溶液中，搅拌使其溶解，得到浓度为0.0I g/mL的壳聚糖溶液。将壳聚糖溶液放在4 0C的冰箱中过夜，使溶液中的气泡排出。将1mL浓度为150g/L的丝素蛋白溶液装入塑料容器中，边搅拌边缓慢加入7mL浓度为0.01g/mL的壳聚糖溶液，然后加入96mg的EDC和57.5mg的NHS，搅拌均匀后，逐滴加入5mL正丁醇，5分钟后，溶液呈凝胶状。停止搅拌，将凝胶放入4 V的冰箱中3分钟，以除掉凝胶中的气泡，然后再放入-20 V的冰箱中预冻20分钟，最后放入-80°C的冰箱中成型，24h后取出，冷冻干燥，得到丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架。
[0054]2.细胞模型的构建
[0055]将丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架经Co-60辐照灭菌后，用培养基浸润一天，接种A549细胞，培养7天后取出，用固定液(0.2M磷酸缓冲液50ml，25%戊二醛1ml，10 %多聚甲醛水溶液20ml，双蒸水加至10ml)固定，冷冻干燥后放入扫描电镜下观察。如图1所示，细胞保持正常形态，且局部聚集成团，图1(A)表示细胞分布在孔内，图1(B)表示细胞聚集成球，图1(C)表示细胞分布在嵴上。说明使用少量的壳聚糖，可以提高丝素蛋白的利用率，促进细胞在凝胶三维肿瘤支架上的附着，满足了细胞生长对于培养接触介质的粘度需求。
[0056]分别取丝素蛋白支架、壳聚糖支架、丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架和丝素蛋白-壳聚糖物理混合物，测得红外吸收谱图，如图2所示。其中a代表壳聚糖支架，b代表丝素蛋白支架，c代表丝素蛋白-壳聚糖物理混合物，d代表丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架。
[0057]从图2中可以看出，纯壳聚糖支架的羟基伸缩振动在3317cm—S纯丝素蛋白样品中的羟基伸缩振动在3537cm—S对比丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架和丝素蛋白-壳聚糖物理混合物的红外吸收，可以看出丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架的游离酰胺的振动峰在1729cm—I明显增强，说明交联剂可以使丝素蛋白和壳聚糖以化学键结合在一起。
[0058]分别取丝素蛋白支架、壳聚糖支架和丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架，测得XRD谱图，如图3所示。a代表壳聚糖支架，b代表本实施例中制备的丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架，c代表丝素蛋白支架。丝素蛋白的结晶形态主要分为两种，I型丝素和Π型丝素，I型丝素的结构中包括无规线团、螺旋构象等非β折叠构象，而Π型丝素的结构则呈反平行β折叠。从图3中可以看出，丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架的2Θ峰出现在20.7°，对应丝素蛋白的β折叠，且该峰的强度增加，说明少量壳聚糖的加入，可以促进丝素蛋白的晶体结构由无规卷曲向更加稳定的β折叠转变，表明丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架里丝素蛋白的结晶度显著高于纯丝素蛋白支架。
[0059]实施例2
[0060]取适量壳聚糖放入研钵中研细，并在50°C的烘箱中烘干，然后称取Ig粉末，加入到10mL浓度为I %的冰乙酸水溶液中，搅拌使其溶解，得到浓度为0.01g/mL的壳聚糖溶液。将壳聚糖溶液放在4°C的冰箱中过夜，使溶液中的气泡排出。将1mL浓度为75g/L的丝素蛋白溶液装入塑料容器中，边搅拌边缓慢加入7mL浓度为0.0I g/mL的壳聚糖溶液，然后加入134.4mg的EDC和80.5mg的NHS，搅拌均匀后，逐滴加入4.25mL正丁醇变性，5分钟后，溶液呈凝胶状。停止搅拌，将凝胶放入8 V的冰箱中3分钟，以除掉凝胶中的气泡，然后再放入-20 V的冰箱中预冻20分钟，最后放入-80°C的冰箱中成型，24h后取出，冷冻干燥，得到丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架。图4为所制备的丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架不同截面的SEM图，图4(A)为该支架的表面，图4(B)为该支架的横断面，图4(C)为该支架的冠状面，从图中可以看出所制备丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架的多孔结构，并且该支架的多孔结构更加均一，形貌更加完整，能够促进细胞的粘附，更准确模拟真实的肿瘤生长环境，更好的满足了肿瘤细胞的生长需要。
[0061 ] 实施例3
[0062]取适量壳聚糖放入研钵中研细，并在50°C的烘箱中烘干，然后称取Ig粉末，加入到10mL浓度为I %的冰乙酸水溶液中，搅拌使其溶解，得到浓度为0.01g/mL的壳聚糖溶液。将壳聚糖溶液放在6°C的冰箱中过夜，使溶液中的气泡排出。将1mL浓度为75g/L的丝素蛋白溶液装入塑料容器中，边搅拌边缓慢加入3mL浓度为0.0I g/mL的壳聚糖溶液，然后加入57.6mg的EDC和34.5mg的NHS，搅拌均匀后，逐滴加入3.25mL正丁醇，5分钟后，溶液呈凝胶状。停止搅拌，将凝胶放入4°C的冰箱中3分钟，以除掉凝胶中的气泡，然后再放入-20°C的冰箱中预冻20分钟，最后放入-80°C的冰箱中成型，24h后取出，冷冻干燥，得到丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架。
[0063]实施例4
[0064]取适量壳聚糖放入研钵中研细，并在50°C的烘箱中烘干，然后称取Ig粉末，加入到10mL浓度为I %的冰乙酸水溶液中，搅拌使其溶解，得到浓度为0.01g/mL的壳聚糖溶液。将壳聚糖溶液放在6 0C的冰箱中过夜，使溶液中的气泡排出。将1mL浓度为150g/L的丝素蛋白溶液装入塑料容器中，边搅拌边缓慢加入4mL浓度为0.0I g/mL的壳聚糖溶液，然后加入134.4mg的EDC和80.5mg的NHS，搅拌均匀后，逐滴加入8.5mL正丁醇，5分钟后，溶液呈凝胶状。停止搅拌，将凝胶放入6°C的冰箱中3分钟，以除掉凝胶中的气泡，然后再放入-20°C的冰箱中预冻20分钟，最后放入-80°C的冰箱中成型，24h后取出，冷冻干燥，得到丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架。
[0065]实施例5
[0066]取适量壳聚糖放入研钵中研细，并在50°C的烘箱中烘干，然后称取Ig粉末，加入到10mL浓度为I %的冰乙酸水溶液中，搅拌使其溶解，得到浓度为0.0lg/mL的壳聚糖溶液。将壳聚糖溶液放在6 0C的冰箱中过夜，使溶液中的气泡排出。将1mL浓度为100g/L的丝素蛋白溶液装入塑料容器中，边搅拌边缓慢加入5mL浓度为0.0I g/mL的壳聚糖溶液，然后加入134.4mg的EDC和80.5mg的NHS，搅拌均匀后，逐滴加入8.5mL正丁醇，5分钟后，溶液呈凝胶状。停止搅拌，将凝胶放入6°C的冰箱中3分钟，以除掉凝胶中的气泡，然后再放入-20°C的冰箱中预冻20分钟，最后放入-80°C的冰箱中成型，24h后取出，冷冻干燥，得到丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架。
[0067]实施例6
[0068]取适量壳聚糖放入研钵中研细，并在50°C的烘箱中烘干，然后称取Ig粉末，加入到10mL浓度为I %的冰乙酸水溶液中，搅拌使其溶解，得到浓度为0.01g/mL的壳聚糖溶液。将壳聚糖溶液放在6 0C的冰箱中过夜，使溶液中的气泡排出。将1mL浓度为125g/L的丝素蛋白溶液装入塑料容器中，边搅拌边缓慢加入6mL浓度为0.01 g/mL的壳聚糖溶液，然后加入134.4mg的EDC和80.5mg的NHS，搅拌均匀后，逐滴加入8.5mL正丁醇，5分钟后，溶液呈凝胶状。停止搅拌，将凝胶放入6°C的冰箱中3分钟，以除掉凝胶中的气泡，然后再放入-20°C的冰箱中预冻20分钟，最后放入-80°C的冰箱中成型，24h后取出，冷冻干燥，得到丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架。
[0069]图5为加入体积为1mL的不同浓度丝素蛋白溶液对所制备的丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架孔径的影响图。从图5可以看出，改变丝素蛋白溶液的浓度，支架的孔径随之改变，孔的分布比较均一。
[0070]正丁醇是一种相对比较温和的蛋白质变性剂，本发明将正丁醇添加到丝素蛋白溶液中，搅拌后形成乳液状混合物，这种混合物具有较好的流动性，能够在模具中均匀分散，混合溶液在冷冻时，短时间内即可冻结，阻止了丝素蛋白聚集成团，使混合体系发生均匀的宏观相分离。在冷冻过程中，水和正丁醇从混合溶液中分离出来形成冰核，冰核逐渐形成大的冰晶。由于液态水的减少，而使周围的丝素蛋白分子链受迫，进一步互相贯穿、缠结，使原来在水溶液下呈无规线团分布的蛋白质分子链间的距离缩短，同时正丁醇的存在破坏了蛋白质分子的水化层，丝素蛋白部分构象转变。由于分子链内和分子间强烈的氢键作用使蛋白质分子链凝聚而紧密堆砌，部分形成规整的晶区结构，因此使得本发明制备的支架具有完整的形貌和均一的孔径。
[0071]图6为加入不同体积的正丁醇对所制备的丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架孔径的影响图，从图中可以看出，改变变性剂的加入体积，可以改变丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架的孔径和孔的均一度。
[0072]图7为加入浓度为0.0I g/mL的不同体积的壳聚糖溶液对所制备的丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架孔径的影响图。从图7中可以看出，改变壳聚糖溶液的加入量，可以改变支架的孔径和孔的均一度。
[0073]图8是本发明实施例6制得的丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架上和普通培养皿上培养初始细胞数相同时，经历48h后，RIPA裂解液裂解Ih，3D扣除纯丝素蛋白空白后所得到的三维支架上纯细胞总蛋白含量和普通培养皿上总细胞蛋白含量的比较，从图中可以看出，本发明的三维支架上蛋白总量是二维普通培养皿上细胞蛋白总含量的7倍以上，说明三维肿瘤模型支架上细胞数目明显比二维普通培养皿细胞多，三维肿瘤模型支架更能模拟生物体真实的肿瘤生长条件。
[0074]目前制备的很多生物支架上细胞生长状况难以直接观察，采用常规的荧光染料染色方法会使染料在支架上产生吸附，使得细胞和支架串色而无法区分。本发明利用发光质粒特异性转染到细胞中表达绿色荧光蛋白，而丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架本身无绿色荧光的方法，解决了支架染色的难题。图9是本发明实施例6制得的丝素蛋白-壳聚糖复合凝胶三维肿瘤模型支架上接种初始浓度6 X 15个/mL处于对数生长期的A549细胞24h后，用EGFP质粒转染细胞。待EGFP表达绿色荧光蛋白后，加入LysoTracker? Red红色荧光染料染色lOmin，直接放于激光共聚焦显微镜下观察细胞在支架上生长状况。其中A代表生长一段时间后A549细胞形成大量细胞球聚集成团的状态;B代表一个A549细胞球状态图。C代表细胞球形成初期状态图。从图中可以看出三维支架上的细胞与二维肿瘤细胞生长状态有明显差异，三维肿瘤模型支架上单个细胞呈现圆球状，生长密集，有些成团或者成葡萄串形聚集，而二维普通培养皿上细胞呈成纺锤形，单层贴壁生长;三维肿瘤模型支架上多个细胞聚集成细胞球，细胞球会进一步发生团聚现象，形成更大的“细胞团”，说明在三维肿瘤模型支架上肿瘤细胞生长状况与人体内实质瘤更加接近。
[0075]本发明采用较少的壳聚糖作为改善粘度的辅料，制备出孔径均一且形貌较好的多孔复合凝胶三维肿瘤模型支架;本发明使用正丁醇作为变性剂，代替传统的甲醇或乙醇等变性剂，改善了所制备三维支架的孔径均一度及形貌;本发明结合丝素蛋白优异的力学性能和壳聚糖丰富的活性基团，在水溶液体系下构建肿瘤组织工程支架材料，对于更加准确地模拟更加真实的肿瘤细胞生长生理条件具有独到的优势。
[0076]以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种复合凝胶三维肿瘤模型支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将壳聚糖研磨、烘干，然后溶于冰醋酸的水溶液，得到壳聚糖溶液； (2)排除步骤(I)中所述壳聚糖溶液中的气泡； (3)在搅拌条件下，向丝素蛋白水溶液中加入经步骤(2)处理过的壳聚糖溶液，再加入交联剂，得到混合溶液； (4)在搅拌条件下，向步骤(3)中的所述混合溶液中加入正丁醇，得到变性丝素蛋白凝胶； (5)排除步骤(4)得到的变性丝素蛋白凝胶中的气泡，成型，冷冻干燥，得到复合凝胶三维肿瘤模型支架。2.根据权利要求1所述的复合凝胶三维肿瘤模型支架的制备方法，其特征在于:在步骤(1)中，所述壳聚糖的分子量为8500Da。3.根据权利要求1所述的复合凝胶三维肿瘤模型支架的制备方法，其特征在于:在步骤(2)和步骤(5)中，在4-80C下排除气泡。4.根据权利要求1所述的复合凝胶三维肿瘤模型支架的制备方法，其特征在于:在步骤(3)中，丝素蛋白与壳聚糖的质量比为10:1?50:1。5.根据权利要求1所述的复合凝胶三维肿瘤模型支架的制备方法，其特征在于:在步骤(3)中，所述丝素蛋白水溶液的浓度为75-150g/L。6.根据权利要求1所述的复合凝胶三维肿瘤模型支架的制备方法，其特征在于:在步骤(3)中，所述交联剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺。7.根据权利要求1所述的复合凝胶三维肿瘤模型支架的制备方法，其特征在于:在步骤(3)中，所述交联剂与壳聚糖的摩尔比为50:1?1:1。8.根据权利要求1所述的复合凝胶三维肿瘤模型支架的制备方法，其特征在于:所述正丁醇的体积为所述壳聚糖溶液和所述丝素蛋白水溶液总体积的1/2?1/4。9.根据权利要求1所述的复合凝胶三维肿瘤模型支架的制备方法，其特征在于:在步骤(5)中，在-20°C下预冻，然后在_80°C下冷冻成型。10.根据权利要求1所述的复合凝胶三维肿瘤模型支架的制备方法，其特征在于:在步骤(5)中，在-20 0C下预冻20分钟。
【文档编号】A61L27/48GK105963790SQ201610292544
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月5日
【发明人】张学农, 李继昭, 周烨娟
【申请人】苏州大学