专利名称：卡氮芥的超细纤维剂型的制备方法
技术领域：
本发明涉及卡氮芥的一种生物降解高分子超细纤维剂型的制备方法。
背景技术：
卡氮芥(BCNU)是临床常规应用的抗癌药物，尤其适用于治疗脑胶质瘤。其作用机制普遍认为是卡氮芥在体内与DNA结合，也有抑制DNA聚合酶作用，从而阻止DNA和RNA合成。它对G1-S过渡期作用最强，对S期有阻滞作用，对G2期作用又增强，对G0期也有作用，故为细胞周期非特异性药。卡氮芥的脂溶性高，血浆蛋白结合率低，相对容易透过血脑屏障。但是，它的熔点低(30-32℃)，半衰期短。遇水、见光容易分解。目前卡氮芥的临床给药多为静脉注射，用药量大，却在病灶部位作用效率低。同时，该药注射后迅速分布全身，会引起强烈的副反应，如迟发性骨髓抑制、肾毒性胃肠毒性及肝脏毒性等，严重时可能导致死亡。另外，用于注射化疗时，由于卡氮芥在体内半衰期仅有15分钟，疗效十分不理想。针对这些问题，许多学者从不同方面，就化疗方式、给药方法及途径等进行探索，以期提高治疗效果，改善患者生存质量。近年来脑瘤局部控缓释药物间质化疗(interstitial chemotherapy)的研究，开辟了脑胶质瘤治疗的又一新途径。中国专利CN 1524580 A公开了“卡氮芥缓释膜片及其制备方法”；中国专利CN 1520808 A公开了“卡莫司汀前体脂质体粉针制剂及制备方法”。但是，两者都存在载药量低、药物突释和体系不稳定等问题。
传统的全身化疗药物具有难以通过血脑屏障、全身反应严重、病灶部位药物局部浓度低等缺点。为此，多采取经预置导管向瘤腔内注射、皮下埋置泵持续给药、甘露醇开放血脑屏障、动脉或选择性动脉给药等方法，以增加化疗药物的局部浓度。但这些方法均存在着各种不足，临床效果不佳。所以，如果在肿瘤手术切除时将化疗药直接放在病灶部位，可避开血脑屏障；药物缓慢释放，直接增加局部药物浓度，从而延长化疗药物的作用时间。这样既达到了化疗的目的，又因为所需要的药物总量比全身化疗要低的多，从而减少了药物的全身毒副作用。总之，局部缓释化疗扬长避短，解决了上述方法的不足。
中国专利CN 03109880.0公开了“超细纤维药物剂型及其制备方法”。本发明在该专利的基础上，针对卡氮芥的具体特点，提出卡氮芥的生物降解高分子超细纤维剂型及其制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供卡氮芥的一种超细纤维剂型的制备方法。
本发明使用生物降解高分子作为药物的载体。除了聚合物的品种外，聚合物的分子量也是选择的重要参数，以便获得适宜的电纺丝液粘度。使用这些生物降解高分子作为药物的载体，它们在人体内发生降解，可以补偿因总药量下降造成的药物释放速度随时间的衰减，使药物释放行为更加平稳；并且在药物释放过程中，载体同步降解，最终被人体吸收或代谢，不残留在人体内，不造成对人体的危害。纺丝溶液为聚合物和卡氮芥的混合溶液，使用聚合物和卡氮芥的共同良溶剂，该溶剂具有电纺丝所要求的挥发性，无毒或低毒，易从纤维产品中除去，残留量低，使用适当比例的混合溶剂往往具有最好的电纺丝效果。电纺丝的基本设备在中国专利CN03109880.0、中国专利CN 1543929A和中国专利CN 1543972A均有详细的叙述。
本发明担载有卡氮芥的超细纤维无纺布或纤维毡的制备方法，包括以下步骤将卡氮芥加到载体高分子的溶液中，形成两者的混合溶液，其中载体高分子的质量浓度为1～20％，卡氮芥的质量为载体高分子的1～100％；高分子溶液是聚乳酸(PLA)、聚ε-己内酯(PCL)、聚乙交酯(PGA)，以及丙交酯、乙交酯、ε-己内酯和乙二醇之间的二元或三元的无规或嵌段共聚物，其中，乙二醇的嵌段共聚物中聚乙二醇段的分子量不宜超过5000，可以使用单一的聚合物，也可以使用两种或两种以上聚合物的混合物，纺丝溶液为聚合物和卡氮芥的混合溶液，使用聚合物和卡氮芥的共同良溶剂，它们是氯仿、丙酮、二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙醚或二氧六环其中的一种或两种以上；电纺丝参数喷丝口的直径为0.1～0.9mm？；喷丝口到接收屏之间的距离8～30cm，它们之间的电压1～80kV；高分子和卡氮芥的混合溶液从喷丝口流出的速度0.01～0.5ml/min，制得的纤维单位直径为0.1～2微米。
电纺丝与传统纺丝工艺的区别之一，在于所制备的纤维直径，在微米至纳米范围内，远小于普通纤维，从而避免了由于纤维的直径粗、壁厚而造成的降解速度慢，药物释放迟滞的现象，卡氮芥的释放速度较快。但又不像纳米颗粒、纳米胶囊和纳米胶束那样，比表面积太大，药物释放太快。它机械强度较高，可作为独立剂型使用，无须加工成其它常规剂型。它们的药物释放平稳、可控。这样的超细纤维毡外形与棉球或纱布相似，很容易在肿瘤切除后放置并保持在病灶部位，术后卡氮芥不断从纤维中扩散出来，发挥化疗的作用，因而特别适用于肿瘤手术后局部化疗。电纺丝工艺的另一个优点是，由于聚合物从溶液状态变成固体纳米纤维状态，仅需要不到1秒钟的时间，其中夹带的卡氮芥在如此短的时间内固化，来不及生长成很大的晶粒，也来不及扩散到纤维的表面上来，因而卡氮芥基本上被包裹在纤维内部，并且在纤维基体中的分散非常均匀，呈分子状态或纳米聚集状态，用电子显微镜观察不到纤维表面有卡氮芥的药物颗粒。可见，这种可生物降解超细纤维担载卡氮芥的药物剂型，可以避免药物的突释现象，减少药物的毒副作用。包裹在纤维内部的卡氮芥不易分解变性，增强了药物的稳定性，也在一定程度上解决了卡氮芥药物稳定性差的问题。
实验表明，电纺丝纤维中的卡氮芥的剂量，可以在很大的范围内调节，以适应不同病人的需要。以高分子的质量为基数，载药量可达到100％。这也是一般的纺丝工艺和其它的药物剂型所难以达到的。
图1是实施例1制备的超细纤维药的ESEM照片。
图2是实施例2制备的超细纤维药的SEM照片。
图3是实施例4制备的超细纤维药的ESEM照片。
图4是实施例4制备的超细纤维药的释放曲线。(○)在含3mg/l蛋白酶K的Tris-HCl缓冲溶液中；(■)在空白Tris-HCl缓冲溶液中。
图5是不同BCNU含量的载药纤维对大鼠C6脑胶质瘤细胞相对存活率-时间曲线。(A)空白PEG750-PLLA纤维毡；(B)担载5％BCNU的PEG750-PLLA纤维毡；(C)担载10％BCNU的PEG750-PLLA纤维毡；(D)担载20％BCNU的PEG750-PLLA纤维毡。
图6是不同BCNU纯药浓度对大鼠C6脑胶质瘤细胞相对存活率-时间曲线。1μg/ml(■)；10μg/ml(○)；25μg/ml(▲)；50μg/ml()；100μg/ml(★)。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明提供的卡氮芥的可生物降解高分子超细纤维药物剂型及其制备方法给予进一步说明，但本发明所适用的载体高分子和溶剂品种，以及纺丝溶液的组成和纺丝条件，并不仅限于实施例的范围。
实施例1.将左旋聚乳酸PLLA(数均分子量86400)0.7768g溶于4ml氯仿和1ml丙酮的混合溶剂中，充分溶解后，再加入39mg卡氮芥，搅拌使之充分溶解，形成均一的混合溶液。然后将混合溶液加入到10ml注射器中，采用8号针头制成的直角平口喷丝口，纺丝流速为2ml/h，所加电压为35kV，两极间的距离为24cm。
所得载药纤维的平均直径500nm，卡氮芥含量5％，见图1。
实施例2.将0.9616g丙交酯和乙交酯的无规共聚物PLGA(其中质量组成丙交酯80％，乙交酯20％，数均分子量79500)溶于5ml氯仿中，充分溶解后，再加入96mg卡氮芥，搅拌使之充分溶解，形成均一的混合溶液。然后将混合溶液进行电纺，采用8号针头制成的直角平口喷丝口，纺丝流速为1.5ml/h，所加电压为33kV，两极间的距离为18cm。
所得载药纤维的平均直径1.8μm，卡氮芥含量10％，见图2。
实施例3.将0.6874g PLLA-PEG嵌段共聚物(数均分子量为97600，其中PEG段数均分子量为5000)溶于5ml氯仿中，充分溶解后，再加入0.1375g卡氮芥，搅拌使之充分溶解，形成均一的混合溶液。然后将混合溶液进行电纺，采用8号针头制成的直角平口喷丝口，纺丝流速为1.8ml/h，所加电压为35kV，两极间的距离为24cm。
所得载药纤维的平均直径800nm，卡氮芥含量20％。
实施例4.将0.7319g PLLA-PEG嵌段共聚物(数均分子量为84800，其中PEG段数均分子量为750)溶于5ml氯仿中，充分溶解后，再加入73mg卡氮芥，搅拌使之充分溶解，形成均一的混合溶液。然后将混合溶液进行电纺，采用8号针头制成的直角平口喷丝口，纺丝流速为2ml/h，所加电压为35kV，两极间的距离为24cm。
所得载药纤维的平均直径500nm，卡氮芥含量10％，见图3。纤维表面光滑，无药物颗粒，说明药物均匀分散包裹在纤维内部。
实施例5.卡氮芥的超细纤维药的体外释放将一定数量大小、重量相近的担载卡氮芥的纤维片样品放在装有20mlTris-HCl缓冲液(0.05M，pH＝8.6)的广口瓶中，缓冲液中蛋白酶K浓度为3μg/ml。在对照实验中，缓冲液中不加酶。将上述样品置于振荡培养箱中，温度保持在37±0.1℃，振荡频率为90rpm。每隔一定时间，将待测纤维片取出，冷冻干燥12小时除水。然后将干燥的纤维片用适量的氯仿溶解，接着加入10ml乙腈-水的混合溶剂(32∶68v/v)，25℃下减压将氯仿除去。将得到的溶液用高压液相色谱检测。流动相是乙腈-水的混合溶剂(32∶68v/v)，流速为1.0ml/min.最后得到卡氮芥的累计释放量-释放时间的曲线，如图4所示。
因为卡氮芥在释放实验环境中不稳定，容易变性分解。如果直接通过检测释放出的卡氮芥来计算卡氮芥的累积释放量是不合理的。因此，我们采用高压液相色谱检测留在纤维片中的卡氮芥来计算卡氮芥的累积释放量。从释放曲线可以看出无论是在有酶存在的Tris-HCl缓冲液中还是在无酶存在的对照实验中，卡氮芥的释放速度随载药量的增加而增加。主要由扩散作用引起的最初的释放量也随着载药量的增加而增加。例如，在18分钟内，含有5％卡氮芥的PEG750-PLLA纤维毡释放了11.9％，而含有10％卡氮芥的PEG750-PLLA纤维毡释放了16.1％。
从释放曲线看出卡氮芥的释放行为稳定，既能在释放初期有较高的药物释放速度，又能在很长的时间内平稳释放。对于抗肿瘤药物的控制释放来说，卡氮芥的这种释放行为是很理想的。开始的适度快释有利于快速抑制肿瘤细胞的繁殖、生长。对于依然存活的少量肿瘤细胞来说，在很长的时间内平稳释放卡氮芥将进一步抑制它们的生长。因此，这种剂型特别适用于肿瘤手术后的局部化疗。
实施例6.卡氮芥的超细纤维药的抗癌活性研究将担载卡氮芥的超细纤维毡用钴-60的γ-射线辐照进行消毒，剂量5kGy。
将大鼠C6脑胶质瘤细胞株接种于含有10％小牛血清的RPMI 1640培养液中，并且在含有5％CO2的37℃孵箱中培养。每次均以0.25％胰酶(pH7.4的磷酸盐缓冲液)消化1分钟，吸弃胰蛋白酶后，将细胞转入50ml的离心管中，以1000r/min离心5分钟之后，用台盼蓝染色法对细胞进行计数。用培养液调整细胞密度到5×104/ml。将细胞悬液接种于96孔细胞培养板孔内，每孔加入细胞悬液200μL，然后将培养板置37℃，5％CO2孵箱中培养24h，让细胞贴壁生长。将下列样品加到96孔板中(1)培养对照组，肿瘤细胞株培养，不加任何药物，每组5孔；(2)卡氮芥纯药，浓度分别为1、10、25、50、100μg/ml，每组5孔；(3)载体对照组，即不含卡氮芥的空白载体，每组10孔；(4)担载有卡氮芥的纤维毡，卡氮芥在载药纤维中的含量分别为5、10、20％，每组10孔。相对于培养液的纤维中卡氮芥的含量分别为10、25、50μg/ml。继续细胞培养。在每个实验时间点，用酶标仪在492nm处检测OD值，计算细胞相对存活率。细胞相对存活率＝实验组OD值(均值)/培养对照组OD值(均值)×100％。然后做细胞相对存活率-时间曲线。卡氮芥纯药和担载卡氮芥超细纤维在不同时间点对C6肿瘤细胞的抑制作用的对比，如图5和图6所示。
实验的结果表明卡氮芥纯药在48小时后完全失效，对癌细胞生长的抑制作用完全消失，癌细胞开始重新生长繁殖，而担载卡氮芥的超细纤维则在整个测试时间内保持对癌细胞的良好抑制作用，不含卡氮芥的超细纤维几乎没有细胞毒性。因此超细纤维毡担载的卡氮芥对癌细胞的抑制和杀灭作用比卡氮芥纯药更加有效，这是由纤维药的缓释作用造成的。所以，本发明技术所制成的卡氮芥超细纤维剂型，成功实现了缓释、减小毒副作用、增强药效等目标，解决了卡氮芥纯药易变性和和体内半衰期短等问题。
权利要求
1.一种卡氮芥的超细纤维剂型的制备方法，将卡氮芥加到载体高分子的溶液中，形成两者的混合溶液，其中载体高分子的质量浓度为1～20％，卡氮芥的质量为载体高分子的1～100％；高分子溶液是聚乳酸(PLA)、聚ε-己内酯(PCL)、聚乙交酯(PGA)，以及丙交酯、乙交酯、ε-己内酯和乙二醇之间的二元或三元的无规或嵌段共聚物，其中，乙二醇的嵌段共聚物中聚乙二醇段的分子量不超过5000，可以使用单一的聚合物，也可以使用两种或两种以上聚合物的混合物，纺丝溶液为聚合物和卡氮芥的混合溶液，使用聚合物和卡氮芥的共同良溶剂，它们是氯仿、丙酮、二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙醚或二氧六环其中的一种或两种以上；电纺丝参数喷丝口的直径为0.1～0.9mm？；喷丝口到接收屏之间的距离8～30cm，它们之间的电压1～80kV；高分子和卡氮芥的混合溶液从喷丝口流出的速度0.01～0.5ml/min，制得的纤维单位直径为0.1～2微米。
全文摘要
本发明涉及一种卡氮芥可生物降解高分子超细纤维剂型的制备方法，即将卡氮芥溶解在可生物降解高分子的溶液中，进行静电纺丝，形成包裹有卡氮芥的超细纤维无纺布或纤维毡。该方法制备工艺简单，设备成本低，所得的载药纤维直径可控制在0.2～2μm，载药量可在0.1～100％的范围内调节。药物释放行为稳定，既能在释放初期有较高的药物释放速度，又能在很长的时间内平稳释放卡氮芥。纤维载体本身能完全生物降解，毒副作用很小。另外，由于卡氮芥被完全包裹在纤维内并逐步缓慢释放，克服了它在人体内半衰期很短的缺点，也降低了它对人体毒副作用。这种剂型特别适用于肿瘤手术后的局部化疗。
文档编号D01F1/10GK1687494SQ20051001668
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月5日 优先权日2005年4月5日
发明者景遐斌, 徐秀玲, 陈学思, 杨立新, 徐效义, 梁奇志, 卢天成 申请人:中国科学院长春应用化学研究所