杜松烷型倍半萜Salicifoliusin A及其制备方法和应用
【专利说明】杜松烧型倍半瞄Sa I i c i fo I i US i η A及其制备方法和应用 (-)技术领域
[0001 ]本发明设及一种杜松烧型倍半祗Salicifoliusin A及其制备方法和应用。 (二)【背景技术】
[0002] 蜡梅在我国已有1000多年的栽培历史，作为一种香花植物，其叶和花具有挥发性 的芳香油，香气怡人，常作为花弁盆景和鲜切花来观赏，因此是我国著名观赏植物之一。作 为观赏植物，蜡梅不仅可W在公园、花地等地方孤植或者丛植，也可W栽培在建筑物前、草 坪中或者道路两旁，还可作为盆景，栽培于室内。
[0003] 蜡梅属植物除了观赏价值外还具有药用价值。《贵阳民间药草》中记载，显示蜡梅 花可冲泡为茶，作为一种治疗咳嗽的药茶，因此蜡梅也是一种中药材，广泛被人们利用，在 苏南民间就是用蜡梅花来治疗感冒咳嗽。蜡梅不仅可治疗感冒咳嗽，还可W治疗因风寒引 起的腹痛、腹胀、消化不良，也可W治疗伤食引起的胃炎、胃痛、泛酸。
[0004] 柳叶蜡梅(学名：化imonanthus salicifolius S.Y.化)又名山蜡梅、亮叶蜡梅、毛 山茶、岩马桑、香风茶、石凉茶等，为蜡梅科蜡梅属常绿灌木，是中国特有的属、种，主要产于 安徽、江西、浙江。柳叶蜡梅也被应用于医药研究，表明其具有抗病毒、止咳化疲、抗菌等疗 效。其提取物对人宫颈癌皿LA和人胃癌SGC-7901的生长有抑制作用。柳叶蜡梅叶具有浓郁 的香味，其精油成分不仅有镇痛、镇咳、桂疲作用，还能抑制食欲，明显减缓小鼠体重增长， 起到减肥作用。该药使用历史悠久、疗效确切、副作用较少，是值得研究开发的药茶多用品 种。经国家有关科研单位测定，柳叶蜡梅含挥发油、搬皮素、碱、黄酬类等多种有效性成分， 铁、巧、锋、儀、砸等微量元素及维生素 B1、维生素 B2、维生素 C等含量丰富，并含18种氨基酸。
[0005] 本发明W柳叶蜡梅枝干等器官为研究对象，进行提取、分离、纯化、结构鉴定得到8 α-径基-T-muurolol(命名为：Salicifoliusin A)，属于倍半祗类化合物，该化合物具有明 显的免疫活性。 (Ξ)
【发明内容】
[0006] 本发明旨在提供一种杜松烧型倍半祗Salicifoliusin A及其制备方法和应用。
[0007] 本发明的技术方案为：
[000引一种式（I)所示的杜松烧型倍半祗Salicifoliusin A:
[0009]
[0010] 一种式（I)所示的杜松烧型倍半祗Salicifoliusin A的制备方法，所述的制备方 法按如下步骤进行：
[0011] (1)将柳叶蜡梅的枝干进行粉碎干燥后，用乙醇浸提提取，之后过滤除去不溶物， 取滤液减压浓缩得到乙醇浸膏；
[0012] (2)将步骤（1)所得乙醇浸膏分散于水中，得到悬浮液，再将所得悬浮液用石油酸 进行萃取，得到石油酸萃取液，减压浓缩后得到石油酸浸膏；
[0013] (3)脱00~300目柱层析硅胶对步骤(2)所得石油酸浸膏进行柱层析分离，W石油 酸/乙酸乙醋体积比为9:1~1:9的混合液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集含目标化合物的洗 脱液，减压浓缩后合并得粗品，所得粗品依次经洗涂、重结晶，得到所述的杜松烧型倍半祗 Salicifoliusin A;所述粗品的洗涂采用石油酸、乙酸乙醋中的一种或两者W任意比例的 混合液;所述粗品的重结晶采用甲醇作为重结晶溶剂。
[0014] 本发明所述的制备方法，步骤(1)中，推荐用于浸提提取的乙醇为体积分数95%的 乙醇;所述乙醇浸提提取的具体操作方法为:将粉碎干燥后的柳叶蜡梅枝干与乙醇W料液 质量比1:0.8~1混合，常溫(20~30°C)浸提5~10天，过滤得到乙醇浸提提取液，重复浸提2 ~4次，合并每次所得乙醇浸提提取液，50°C减压旋蒸回收乙醇，得到乙醇浸膏(粘稠状，无 醇味）。
[0015] 步骤(2)中，将所述乙醇浸膏分散于水中时，推荐所述乙醇浸膏与水的质量比为1: 2~4;所述悬浮液用石油酸进行萃取时，推荐所述悬浮液用等体积的石油酸萃取3次。
[0016] 步骤(3)中，用200~300目柱层析硅胶对石油酸浸膏进行柱层析分离时，所述梯度 洗脱的具体操作方法为：W石油酸/乙酸乙醋体积比分别为9:1、7:1、5:1、3.5:1、2:1、1:1、 1:2、1:3.5、1:5、1:7、1:9的混合液为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为5~7mL/min (优选6mL/min)，每种不同比例洗脱剂的洗脱时间为300min~400min，收集含目标化合物的 洗脱液，减压浓缩后合并得粗品。
[0017] 本发明中，所述的目标化合物(杜松烧型倍半祗Salicifoliusin A)进行薄层层析 (TLC)时，通常W石油酸：乙酸乙醋= 1:1为展开剂，其Rf值为0.5。所述的制备方法步骤(3) 中，可通过化C检测收集含目标化合物的洗脱液。
[001引本发明所述杜松烧型倍半祗Salicifoliusin A在制备免疫活性药物中具有应用 前景。根据免疫活性测试实验，本发明杜松烧型倍半祗Salicifoliusin A与Con A对照组相 比较，对小鼠脾细胞的增值表现出了明确的抑制作用，且具有剂量依赖性，显示了该化合物 是潜在的降低免疫活性的药物。
[0019] 本发明的有益效果在于：
[0020] 本发明所述杜松烧型倍半祗Salicifoliusin A的提取、分离、纯化方法简单，免疫 活性明确，具有潜在的工业化制备和开发为免疫调节药物的价值，该化合物化学结构及其 绝对构型经过波谱学数据和X-射线单晶衍射分析得到确认，不存在光学异构体，可W避免 光学异构体潜在的风险。 (四）
【附图说明】
[0021] 图1是实施例1得到的杜松烧型倍半祗Salicifoliusin A的单晶衍射图。 (五)
【具体实施方式】
[0022] 下面通过具体实施例对本发明进行进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限 于此。
[0023] 实施例 1 :Salicifoliusin A的制备：
[0024] 提取:将柳叶蜡梅的枝干进行粉碎干燥后，得到干燥的柳叶蜡梅枝干粉末879g，用 1.化95 %乙醇常溫浸提一周，过滤得到浸提液，重复浸提3次，合并每次所得浸提液，减压蒸 馈得到乙醇浸膏765g，将所得乙醇浸膏分散于3000mL水中，得到悬浮液，再将所得悬浮液用 等体积的石油酸萃取3次，合并得到石油酸萃取液，减压浓缩后得到石油酸浸膏187g。
[0025] 分离：用200~300目柱层析硅胶(500g)对石油酸浸膏进行柱层析分离，W石油酸/ 乙酸乙醋体积比分别为9:1、7:1、5:1、3.5:1、2:1、1:1、1:2、1:3.5、1:5、1:7、1:9 的混合液为 洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为6mL/min，每种不同比例洗脱剂的洗脱时间为 350min，收集含目标化合物的洗脱液，减压浓缩后得到粗品38.6g。
[0026] 提纯：所得粗品用石油酸洗去杂质，然后用甲醇进行重结晶，得到无色晶体 0.603g，即为所述的杜松烧型倍半祗Salicifoliusin A。
[0027] 实施例2:Salicifoliusin A的制备：
[0028] 提取:将柳叶蜡梅的枝干进行粉碎干燥后，得到干燥的柳叶蜡梅枝干粉末856g，用 0. 化95 %乙醇常溫浸提一周，过滤得到浸提液，重复浸提3次，合并每次所得浸提液，减压蒸 馈得到乙醇浸膏648g，将所得乙醇浸膏分散于2500M^水中，得到悬浮液，再将所得悬浮液用 等体积的石油酸萃取3次，合并得到石油酸萃取液，减压浓缩后得到石油酸浸膏159g。
[0029] 分离：用200~300目柱层析硅胶(500g)对石油酸浸膏进行柱层析分离，W石油酸/ 乙酸乙醋体积比分别为9:1、6:1、4:1、1:1、1:4、1:6、1:9的混合液为洗脱剂，进行梯度洗脱， 洗脱剂的流速为5mL/min，每种不同比例洗脱剂的洗脱时间为400min，收集含目标化合物的 洗脱液，减压浓缩后得到粗品33.5g。
[0030] 提纯:所得粗品用石油酸：乙酸乙醋体积比1:1的混合液洗去杂质，然后用甲醇进 行重结晶，得到无色晶体〇.421g，即为所述的杜松烧型倍半祗Salicifoliusin A。
[0031] 实施例3:Salicifoliusin A的制备：
[0032] 提取:将柳叶蜡梅的枝干进行粉碎干燥后，得到干燥的柳叶蜡梅枝干粉末867g，用 1. 化95 %乙醇常溫浸提一周，过滤得到浸提液，重复浸提3次，合并每次所得浸提液，减压蒸 馈得到乙醇浸膏699g，将所得乙醇浸膏分散于3000M^水中，得到悬浮液，再将所得悬浮液用 等体积的石油酸萃取3次，合并得到石油酸萃取液，减压浓缩后得到石油酸浸膏165g。
[0033] 分离：用200~300目柱层析硅胶(400g)对石油酸浸膏进行柱层析分离，W石油酸/ 乙酸乙醋体积比分别为9:1、7:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5、1:7、1:9的混合液为洗脱剂，进行 梯度洗脱，洗脱剂的流速为7mL/min，每种不同比例洗脱剂的洗脱时间为300min，收集含目 标化合物的洗脱液，减压浓缩后得到粗品36.5g。
[0034] 提纯：所得粗品用乙酸乙醋洗去杂质，然后用甲醇进行重结晶，得到无色晶体 0.071g，即为所述的杜松烧型倍半祗Salicifoliusin A。
[0035] 实施例4:化合物测试
[0036] 表1:实验所用仪器
[0037]
[0038] 试剂:溶剂均为分析纯试剂，未进行处理。
[0039] 对实施例1，实施例2或实施例3制得的杜松烧型倍半祗Salicifoliusin A进行理 化和波谱学分析，m.P. 113-114°C，ESI-MS测定值m/z: 239[M+扣％237[M-H]-，HR-ESI-MS测定 值m/z : 261.1833[M+Na]%计算值261.1825[打5此602化?，确定其分子式为Ci5出602,分子量为 238，不饱和度为3，比旋光度为[a]D2D-81.5(c 0.22，CHCb)。
[0040] 表2:Salicifoliusin A的NMR数据（DMS0-d6)
[0041]
[0042] 实施例5:免疫活性测试
[0043] 对实施例1制得的杜松烧型倍半祗Salicifoliusin A进行了体外抗肿瘤活性测 试。
[0044] 方法：用淋己细胞增殖的方法，来检测制得的Salicifoliusin A是否具有免疫活 性。首先制备小鼠脾细胞:雌性小鼠2只，体重为200g，将其处死，用70%乙醇的浸泡，在无菌 的环境中取其脾脏，于蒸发皿中，研磨捣碎，加入3.5mL化nk's液，混合均匀，用尼龙铜布过 滤，滤液放置于lOmL离屯、管，再加入3.5mL化nk' S液洗涂，合并洗涂液共7ιΛ;用1800r/m的 离屯、机将洗涂液离屯、5min，弃上清液，再用化nk's液洗一次，收集脾细胞。将收集的脾细胞 加入到3mL含有10%小牛血清的RPMI 1640完全培养液中，混匀后过滤，取细胞悬液0.1 mL， 加3.9mL 1.5%冰醋酸，混匀，复2管，计数，细胞总数为1 X 108个;取全部细胞悬液加含有 10%小牛血清的RPMI 1640完全培养液，调整浓度至5X106个/mL，4°C保存。然后取10化L处 理好的小鼠脾细胞，加入96孔板中，后加 Con A 5化L(终浓度为化g/mU和不同浓度的倍半 祗各50化，4复孔，倍半祗浓度梯度设置为:200、100、50、25、12.5μΜ。空白对照组设置为Con A 50化和50化1640完全培养基，将96孔板放置于37°C的C〇2解育箱中培养，48小时后每孔 中加入50化MTT( 2mg/mL)，培养4h后去上清液，加含1N HC1的DMS0溶液150μLν孔，振荡 lOmin，使甲琐充分溶解。用酶标仪测定490nm处的每孔内溶液的0D值。计算SI值，SI值二刺 激组的0D值/非刺激组的0D值。
[0045] 结果：实施例1所制得的倍半祗Salicifoliusin A与Con A对照组相比较，对小鼠 脾细胞的增值表现出了明确的抑制作用，且具有剂量依赖性。运提示该化合物可能是潜在 的降低免疫活性的药物(如表3所示）。
[0046] 表3:制得的倍半祗体外免疫活性
[0047]
【主权项】
1. 一种式(I)所示的杜松烧型倍半砲Salicifoliusin A:2. -种式(I)所示的杜松烧型倍半砲Salicifoliusin A的制备方法，其特征在于，所述 的制备方法按如下步骤进行： (1) 将柳叶蜡梅的枝干进行粉碎干燥后，用乙醇浸提提取，之后过滤除去不溶物，取滤 液减压浓缩得到乙醇浸膏； (2) 将步骤（1)所得乙醇浸膏分散于水中，得到悬浮液，再将所得悬浮液用石油醚进行 萃取，得到石油醚萃取液，减压浓缩后得到石油醚浸膏； (3) 用200~300目柱层析硅胶对步骤(2)所得石油醚浸膏进行柱层析分离，以石油醚/ 乙酸乙酯体积比为9:1~1:9的混合液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集含目标化合物的洗脱 液，减压浓缩后合并得粗品，所得粗品依次经洗涤、重结晶，得到所述的杜松烷型倍半萜 Salicifoliusin A;所述粗品的洗涤采用石油醚、乙酸乙酯中的一种或两者以任意比例的 混合液;所述粗品的重结晶采用甲醇作为重结晶溶剂。3. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)中，用于浸提提取的乙醇为体积 分数95 %的乙醇。4. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)中，所述乙醇浸提提取的具体操 作方法为:将粉碎干燥后的柳叶蜡梅枝干与乙醇以料液质量比1:0.8~1混合，常温浸提5~ 10天，过滤得到乙醇浸提提取液，重复浸提2~4次，合并每次所得乙醇浸提提取液，50°C减 压旋蒸回收乙醇，得到乙醇浸膏。5. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述乙醇浸膏与水的质量比 为1:2~4〇6. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述悬浮液用等体积的石油 醚萃取3次。7. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述梯度洗脱的具体操作方 法为：以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为9 :1、7:1、5:1、3.5:1、2:1、1 :1、1:2、1:3.5、1:5、1: 7、1:9的混合液为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为5~7 111171^11，每种不同比例洗脱 剂的洗脱时间为300min~400min，收集含目标化合物的洗脱液，减压浓缩后合并得粗品。8. 如权利要求1所述的杜松烷型倍半萜Salicifoliusin A在制备免疫活性药物中的应 用。
【专利摘要】本发明提供了一种式(I)所示的杜松烷型倍半萜Salicifoliusin A及其制备方法，本发明所述杜松烷型倍半萜Salicifoliusin A的提取、分离、纯化方法简单，免疫活性明确，具有潜在的工业化制备和开发为免疫调节药物的价值，该化合物化学结构及其绝对构型经过波谱学数据和X?射线单晶衍射分析得到确认，不存在光学异构体，可以避免光学异构体潜在的风险；
【IPC分类】C07C29/76, A61P37/02, C07C35/36
【公开号】CN105712844
【申请号】CN201610045940
【发明人】王奎武, 李丹
【申请人】浙江工商大学