一种基于KASP技术鉴定棉花品种中棉所63的方法

本发明属于棉花品种鉴定领域，具体为一种基于kasp技术鉴定棉花品种中棉所63的方法。

背景技术：

1、棉花是我国重要的经济作物和战略物资，从种源上保证棉花品种的真实性对我国棉产业发展至关重要。好的种源能够保证棉农增收，促进当地经济发展，但是在市场上往往存在种子“套牌”现象，导致一些假冒伪劣棉种流入市场，造成产量损失与品质下降，坑害棉农的利益，所以棉花品种的真伪鉴定在生产、加工和销售过程中及其重要。

2、在众多棉花品种中，中棉所63是中国农业科学院棉花研究所历经多年培育的强优势杂交棉品种，2010～2015年连续六年入选全国主导品种，是年限最长的杂交棉主导品种和长江流域棉区主导品种。在长江流域多次实现亩产籽棉超500kg，亩产皮棉超200kg，是以高产、稳产著称的杂交棉品种。因此，针对中棉所63开展品种鉴定，对保障棉花种业市场稳定、防止种子套牌具有积极意义。

3、但是现有的种子鉴别包括人工鉴别、田间种植鉴别、电泳检测、生理和化学鉴定等方法，这些方法虽能有效鉴别棉花品种，但都存在着一些缺点，如人工鉴别往往存在着经验性，鉴别精度差，而田间种植则需要消耗大量的时间人力物力，成本较高，电泳检测操作繁琐等。

技术实现思路

1、要解决的技术问题：如何通过精度高、操作简便、节省成本的方法进行棉花品种中棉所63的鉴别。

2、技术方案：本发明提供了一种基于kasp技术鉴定棉花品种中棉所63的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤一，收集单核苷酸多态性位点(snp)信息：从公共数据库中下载陆地棉基因组序列，借助blsat+进行基因组序列的本地化比对，找到基因组中存在的snp信息，随机从不同染色体上挑选snp并整理其基本信息，包括所在染色体、染色体物理位置和碱基变异，根据这些信息，提取snp位点上下游50bp的序列；步骤二，kasp引物设计：对上述每条序列在snp位置处添加碱基变异位点，根据kasp引物设计原则，利用primer3软件基于上述每条序列碱基变异位点分别设计三条引物序列，包括两条正向pcr引物序列和一条通用反向引物序列；其中，正向引物3’端为变异的碱基，在正向引物的5’端分别添加标签序列；步骤三，棉花品种dna准备：选取包括tm-1在内的来自我国不同育种年代的棉花品种21份，具体包括陆地棉遗传标准系tm-1，其它品种具体包括八农212、吐71-113、库车96515、喀什736、库车t94-4、新陆早10号、莎陆1号、新陆中5号、新陆早36、博乐34、新陆早21、新陆早28、新陆中34、军棉1号、吐83-161、石河子913、科遗7号、红鸡脚叶白绒、新陆早31和新陆早7号；将包括中棉所63在内共22份棉花品种种植于营养钵中，待长出真叶后，剪取供试材料幼嫩叶片组织，采用ctab法提取基因组dna，将提取好的dna稀释成最终浓度为40ng/μl，得到待检测模板；步骤四，kasp反应体系及扩增程序：kasp反应在384孔荧光定量板上进行，每孔的混合反应体系共计5.0μl；反应的混合体系如下：dna模板2.2μl、kasp试剂2.5μl、引物0.056μl、灭菌超纯水0.244μl；kasp扩增程序包括四步：一是在94℃环境温度下扩增15min；二是在95℃环境温度下扩增20s；三是在61-55℃环境温度下扩增25s；四是在95℃下扩增10s；五是在57℃下扩增1min；最后冷却至4℃后保存；步骤五，结果和数据读取：利用罗氏lightcycler480荧光定量仪收集扩增产物的荧光信号，对产物分型检测；待反应完成后，同一位点不同等位变异通过不同颜色或者不同形状展示，相同等位变异类型的材料以相同颜色或者相同形状的图形通过二维聚类图展示，同时导出表格形式。

3、技术效果：本发明对p2-6、p5-4、p6-3、p7-3、p12-2、p13-2中碱基变异位点信息整理，针对变异位点设计特异性引物，获得的6对引物组可有效区分等位变异位点，可用于中棉所63品种鉴定。采用所述引物组对包括中棉所63在内的22份棉花品种进行差异位点分型，结果能够明显区分中棉所63和其它品种基因组位点差异的检测，为中棉所63品种鉴定和保护提供了新思路。

技术特征：

1.一种基于kasp技术鉴定棉花品种中棉所63的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于kasp技术鉴定棉花品种中棉所63的方法，其特征在于，kasp扩增程序中，在61-55℃环境温度下扩增25s需要依次经历10个循环，每个循环下降0.6℃。

3.根据权利要求1所述的基于kasp技术鉴定棉花品种中棉所63的方法，其特征在于，kasp扩增程序中，在57℃下扩增1min需要经历40个循环。

技术总结
本发明涉及棉花品种鉴定领域，且公开了一种基于KASP技术鉴定棉花品种中棉所63的方法，其包括收集单核苷酸多态性位点(SNP)信息、KASP引物设计、棉花品种DNA准备、KASP反应体系及扩增程序以及结果和数据读取五个步骤。本发明对P2‑6、P5‑4、P6‑3、P7‑3、P12‑2、P13‑2中碱基变异位点信息整理，针对变异位点设计特异性引物，获得的6对引物组可将等位变异位点的碱基差异明显区分，可用于中棉所63品种鉴定。采用所述引物组对包括中棉所63在内的22份棉花品种进行差异位点分型，结果能够明显区分中棉所63和其它品种在基因组位点上的差异，为中棉所63品种鉴定和保护提供了新思路。

技术研发人员：赵俊杰,杨代刚,李威,刘艳改,张飞,贺昆仑,任中英,章志强,郭金峰,张文生,王海娟
受保护的技术使用者：中国农业科学院棉花研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/3/12