使用RNAi技术生产有用生物碱生物合成中间体的方法

专利名称:使用RNAi技术生产有用生物碱生物合成中间体的方法
技术领域：
本发明涉及生产生物碱生物合成中有用中间体的方法。
背景技术：
生物碱是植物中所含的碱性含氮化合物的通称。按照其主骨架生物碱分为喹啉类、异喹啉类、吲哚类、托烷类、植物黄素(xanthin)类生物碱等等。已知多种生物碱在药学上有用。举例而言，已知可待因和吗啡具有止痛性质，且有商业价值。那可汀因其镇咳作用而有用。罂粟碱用作平滑肌松弛剂和脑血管扩张剂。小檗碱一直作为具有抗菌活性、抗疟活性和解热性的化合物使用。
异喹啉类生物碱为具有异喹啉作为基本骨架的生物碱的通称。异喹啉类生物碱广泛分布于自然界并具有各种结构。异喹啉类生物碱实例包括吗啡型(例如吗啡)、原小檗碱型(例如小檗碱)和苯并菲啶型(例如血根碱)。产生异喹啉类生物碱的植物实例包括罂粟科(Papaveraceae)、小檗科(Berberidaceae)、毛莨科(Ranunculaceae)、防己科(Menispermaceae)、芸香科(Rutaceae)等等。
在异喹啉类生物碱生物合成途径的中间体中，人们一直在关注网脉番荔枝碱，因为它是多种药物化合物的重要前体。举例而言，专利文献1公开一种用于生产网脉番荔枝碱的方法，其包括将突变随机引入至罂粟基因组中并选择具有高含量网脉番荔枝碱的突变体。然而，该方法很繁复，因为其包括在随机产生的突变体中选择具有高含量网脉番荔枝碱的植物并自该选择的突变体提取网脉番荔枝碱的步骤(参见专利文献1)。
小檗碱桥酶是一种参与异喹啉类生物碱生物合成途径的酶，其使用网脉番荔枝碱作为底物。人们一直试图开发一种借助基因工程通过降低小檗碱桥酶的表达水平来增加网脉番荔枝碱(其为小檗碱桥酶的底物)含量的方法。为了特异性地抑制小檗碱桥酶的表达，这些试验采用反义方法。总体而言，这些试验导致小檗碱桥酶表达受抑制并减少该生物碱含量。然而，并没有观察到包括网脉番荔枝碱在内的中间体的特异性积聚(举例而言，参见非专利文献1和2)。
最近，人们使用一种不同于反义方法的RNAi技术来抑制基因表达。RNAi技术(RNA干扰)是一种通过将dsRNA(双链RNA)引入至目标细胞内抑制与该dsRNA具有同源序列的目标基因表达的方法。一直以来RNAi用于分析各种物种的基因功能。举例而言，非专利文献3报道，借助RNAi技术特异性抑制参与类固醇合成系统的酶可导致作为所述酶底物的中间体的积聚。然而，根据该文献，存在相当多的转换可将该计划中的中间体转换为其它化合物，因此该计划中的中间体的特异性积聚是失败的。不能达到完全关闭该代谢途径的可能原因是类固醇为细胞膜的主要成分且与细胞生长紧密相关。该文献同样报告该等植物细胞生长受到抑制(举例而言，参见非专利文献3)。
为在植物体内表达双链RNA(dsRNA)，构建用于RNAi技术的RNAi载体。RNAi载体依其结构粗略分为两种类型。
其中一种为独立构建的两种质粒的组合，一种质粒表达有义RNA，而另一种质粒表达反义RNA。用这两种质粒混合物转化细胞以在该等细胞中形成dsRNA。另一种为一表达具发夹结构的RNA的质粒。就后者而言，有报道证明在秀丽新小杆线虫(Caenorhabditiselegans)、果蝇(Drosophila)、植物、锥虫科(Trypanosomatidae)等等中存在RNAi。关于植物案例，有篇报道比较了由一带有引入至一转基因发夹结构中部的内含子的构建体所达到的基因沉默效果与由无该内含子引入的构建体所达到的效果。在该项研究中，据报道带内含子的转基因在表达沉默方面比无内含子的更有效。
迄今本发明人发现，基因沉默可通过表达具有与该目标基因约80％同源性的约100个碱基对的dsRNA来实现。关于沉默现象，据认为dsRNA由细胞内的RNA酶降解而得到约20个碱基对的siRNA，将后者引入至称为RISC的复合体中，该复合体降解目标mRNA。据报道在动物细胞中约20个碱基对的siRNA可使基因表达沉默。
专利文献1日本未审查专利公开号2002-508947非专利文献1Sang-Un Park等人，Plant Physiology，vol.128，p.696-706(2002年2月)非专利文献2Sang-Un Park等人，Plant Molecular Biology，vol.51，p153-164(2003)非专利文献3Celine Burger等人，Journal of Experimental Botany，vol.54，.No.388，p1675-1683(2003年7月)
发明内容
本发明所要解决的问题本发明一目标为提供一种生产生物碱生物合成中特定间体的方法。
解决该等问题的方法本发明提供一种用于生产生物碱生物合成中间体的方法，其包括通过使用RNAi技术在生产生物碱的植物细胞、植物组织或植物体中抑制用所述中间体作为其底物的酶的表达。
具体而言，该方法包含借助下文所述的RNAi基因抑制用生物碱生物合成的特定中间体作为其底物的酶的表达，这关闭了代谢途径并导致在植物细胞中积聚该生物碱生物合成的目标中间体。
本发明同样提供由上述方法产生的生物碱生物合成中间体。
另外，本发明提供一种用于上面方法的基因，其包含i)一种启动子，和ii)该启动子下游的a)和b)序列a)正向序列，其与编码用所述中间体作为其底物的酶的全部或部分序列同源，
b)反向序列，其与所述正向序列互补。
在本说明书中，所述基因称为″RNAi基因″。
此外，本发明提供一种用于上述方法的基因组合，其包含A与B基因A. i)一种启动子，和ii)该启动子下游的基因，其包含与编码用所述中间体作为其底物的酶的全部或部分序列同源的正向序列，B. i)一种启动子，和ii)该启动子下游的基因，其包含与所述正向序列互补的序列。
在本说明书中，所述基因组合称为″RNAi基因组合″。
术语″与编码用所述中间体作为其底物的酶的全部或部分序列同源的正向序列″意即与转录同一方向引入至诸如载体等构建体的序列，其与编码用该生物碱生物合成目标中间体作为其底物的酶的全部或部分序列同源，且长度不短于约100bp。
术语″编码该酶全部或部分的序列″不仅包括编码所述酶的基因的翻译区的序列，而且同样包括该基因的非翻译区的序列。
术语″与所述正向序列互补的反向序列″意即与上面定义的″与编码用所述中间体作为其底物的酶的全部或部分序列同源的正向序列″具互补性的序列。换言之，该术语是指与转录反方向引入至诸如载体等构建体且与该正向序列具同源性的序列。
在该RNAi基因中，正向序列和反向序列二者都必须位于启动子下游，但或者是正向序列或者是反向序列可位于另一个的上游。
在该RNAi基因中，优选间隔区序列存在于该正向序列与该反向序列之间。插入间隔区提供使正向序列与反向序列易于配对的空间(下文中包括正向序列与反向序列的重复称作″反向重复″)。该间隔区序列虽不限于但通常为一从几百个碱基对至1kb长度的序列。举例而言，优选使用内含子序列。
通过在植物细胞中表达包含正向序列、间隔区序列和反向序列的RNAi基因，来抑制植物细胞中目标生物碱生物合成酶的表达。
在植物细胞中包含正向序列、间隔区序列和与该正向序列互补的反向序列的DNA通过启动子作用转录为mRNA。从该正向序列转录的单链RNA和从该反向序列转录的单链RNA通过氢键形成互补配对。这样的RNA最好形成具有带间隔区序列的发夹结构的双链RNA(dsRNA)。认为该dsRNA引起RNAi，即抑制目标生物碱生物合成酶基因的表达。
当使用本发明RNAi基因组合时，将包含一启动子下游正向序列的载体(称为有义载体)和包含另一启动子下游反向序列的载体(称为反义载体)两者都引入植物细胞中。在植物细胞中该正向序列和该反向序列通过启动子作用转录为mRNA，从该正向序列转录的单链RNA和从该反向序列转录的单链RNA通过氢键形成互补配对得到双链RNA(dsRNA)。认为该dsRNA引起RNAi，即抑制该目标生物碱生物合成酶基因的表达。
通过使用上述RNAi基因或RNAi基因组合得到的双链RNA抑制该目标生物碱生物合成酶基因的表达，从而在细胞中特异性积聚作为该酶底物的生物碱生物合成中间体。
上述″编码用所述中间体作为其底物的酶的全部或部分序列″并非一定要在该目标基因编码区内不可，而是可为一位于5′UTR或3′UTR区域内的序列，并可为一位于该启动子区内的序列。通过使用如那些非编码区序列的序列可发生RNAi。
此外，本发明提供上述载体以及由该载体转化的植物细胞、植物组织或植物体。
本发明的有益作用在先前研究中已报道抑制生物合成途径末端产物积聚。然而，在这些研究中既无大规模产生一中间体的概念(借助其允许特异性积聚该中间体代谢物)又无通过增加如本发明的新颖反应途径来生产新型化合物的概念。即使有也没有使该等概念现实化的技术。在本发明中，本发明人发现使用RNAi技术可积聚生物合成途径中的目标中间体代谢物。本发明提出在多种代谢途径中积聚有用代谢物的可能性。本发明具有广泛应用。
附图简述
图1所示为异喹啉类生物碱的生物合成途径和生物合成酶。
图2所示为吲哚类生物碱的生物合成途径和生物合成酶。
图3所示为源自中间体网脉番荔枝碱的化合物。
图4所示为源自中间体异胡豆苷的化合物。
图5所示为构建dsRNA表达载体pART27-BBEir的程序，该载体靶向小檗碱桥酶(BBE)基因。
图6所示为指出加州罂粟花(Eschscholzia californica)BBE dsRNA转化子中网脉番荔枝碱积聚的LC/MS分析(m/z 330)。
图7所示为对照和BBE dsRNA转化子的BBE酶活性。
图8所示为分析对照和BBE dsRNA转化子的BBE酶反应的LC/MS结果。
图9所示为对照与BBE dsRNA转化子中网脉番荔枝碱含量和血根碱含量。
图10为表明通过抑制BBE关闭网脉番荔枝碱成为金黄紫堇碱反应的图示说明。
符号说明1去甲乌药碱-6-O-甲基转移酶2乌药碱-N-甲基转移酶3N-甲基乌药碱-3′-羟化酶4小檗碱桥酶(BBE)
5葡糖苷酶I/Il发明的最佳实施方式在本发明中，目标植物(即引入dsRNA的植物)虽不限于但包括任何具有生物碱生物合成途径的植物。优选的生物碱生物合成途径为异喹啉类生物碱生物合成途径、吲哚类生物碱生物合成途径等等。
具有生物碱生物合成途径的植物的具体实例虽包括但不限于产小檗碱植物，举例而言，黄连属(Coptis)，例如日本黄连(Coptisjaponica)、黄连(Coptis chinensis Franch)和三角叶黄连(Coptisdeltoides)；黄檗属(Phellodendron)，例如黄檗(Phellodendronamurense)；小檗属(Berberis)；南天竹属(Nandina)，例如南天竹(Nandinadomestica)；十大功劳属(Mahonia)，例如华南十大功劳(Mahoniajaponica)；唐松草属(Thalictrum)，例如亚欧唐松草(Thalictrum minus)；产吗啡植物、产可待因植物或产罂粟碱植物，举例而言，罂粟科(Papaveraceae)(例如罂粟(Papaver somniferum Linn)、Papaver setigerumDC和大红罂粟(Papaver bracteatum))；虽不产吗啡但产紧密相关的生物碱的植物，举例而言，杠板归(Papaver orientale Linn)和虞美人(Papaver rhoeas)；产血根碱植物，举例而言，花菱草属(Eschscholzia)(例如加州罂粟花(Eschscholzia californica))和血根草属(Sanguinaria)(例如血红根(Sanguinaria canadensis L.))；产紫堇碱植物，举例而言，紫堇属(Corydalis)块茎(紫堇属植物，例如山延胡索(Corydalis bulbosaDC.)、延胡索(Corydalis ternata Nakai)、朝鲜产延胡索(Corydalis NakaiiIshidoya)、伏生紫堇(Corydalis decumbens Person))；产非洲防己碱植物，举例而言，木防己属(Calumba)(木防己(Jateorhiza columba))；产顶花防己碱植物，举例而言，头花千金藤(Stephania cepharantha)；产汉防己碱植物，举例而言，青藤(Sinomenium acutum)(例如青藤(Sinomenium acutum Rehder et Wilson))；产吐根碱植物，举例而言，吐根(Cephaelis ipecacuanha)；诸如此类。
在以上植物中，优选产异喹啉类生物碱的植物，尤其优选产血根碱或小檗碱的植物，例如花菱草属、黄连属、黄檗属、小檗属、南天竹属、十大功劳属和唐松草属。最优选植物为加州罂粟花。
引入RNAi基因的目标植物来源和被引入至该植物的RNAi基因来源可为同一来源或不同来源。考虑到该目标基因与该转基因之间的同源性，它们最好是源自同一植物种。
在本发明方法中，通过RNAi技术沉默的目标是用该目标生物合成中间体作为其底物的酶。这些酶实例包括小檗碱桥酶(BBE)、去甲乌药碱-6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶和N-甲基乌药碱-3′-羟化酶。所有这些酶皆参与异喹啉类生物碱合成途径(参见图1)。
通过借助RNAi抑制这些酶来积聚作为生物碱生物合成中间体的酶的底物。具体而言，通过抑制小檗碱桥酶、去甲乌药碱-6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶或N-甲基乌药碱-3′-羟化酶，分别积聚网脉番荔枝碱、去甲乌药碱、乌药碱或N-甲基乌药碱。
除异喹啉类生物碱生物合成途径中的酶之外的实例包括糖苷酶I/II，其为一种参与吲哚类生物碱生物合成途径的酶，而通过将该酶作为目标，可积聚其底物异胡豆苷(参见图2)。
由本发明方法产生的生物碱生物合成的优选中间体选自网脉番荔枝碱、去甲乌药碱、乌药碱和N甲基乌药碱，尤其优选中间体为网脉番荔枝碱。
通过将小檗碱桥酶作为目标，可积聚网脉番荔枝碱。网脉番荔枝碱和其前体例如去甲乌药碱、乌药碱及N-甲基乌药碱(参见图1)为各种异喹啉类生物碱的有用前体，如图3所示。异胡豆苷同样可作为各种吲哚类生物碱的前体，如图4所示。
在本发明中，引发RNAi的优选RNAi基因具有编码一种选自小檗碱桥酶、去甲乌药碱-6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶和N-甲基乌药碱-3′-羟化酶的酶的序列或序列部分。引发RNAi的dsRNA长度虽不限于但优选为不短于23个bp，更优选从100bp至2kb，而最优选为从100bp至800bp。
在本发明中，诱导引发RNAi之基因表达的启动子不限定，只要当将其引入至目标植物时能引起该基因表达即可。该等启动子为本领域技术人员熟知，其包括花椰菜花叶病毒35S启动子、可诱导启动子，例如乙醇脱氢酶启动子、四环素阻遏物/操纵子控制系统等等。
本发明中，正向或反向序列与编码该目标生物合成酶基因序列之间的同源性不必非100％不可。其可由于突变、多态性或进化分歧而在某种程度上不同。在RNAi中与该目标基因比较具有插入、缺失或点突变的dsRNA同样有效。用于引发RNAi的基因可不完全与目标基因相同，它们之间的同一性优选不小于70％，更优选为不小于80％，甚至更优选为不小于90％，而最优选为不小于95％。
同样地，正向序列与反向序列之间的互补性不限定，只要在它们转录后能形成双链RNA。为了有效形成dsRNA，正向序列与反向序列之间的互补性不小于70％，优选至少为80％，更优选为至少90％，而最优选为至少95％。
本发明中，可采用任何已知的用于将载体引入至目标植物的方法。为本领域技术人员所知的该等方法实例包括聚乙二醇法、电穿孔法、农杆菌法、粒子轰击法等等。用于制备载体及用于从适于以上各方法的转化植物细胞再生植物体的方法可为本领域技术人员所知的任何方法，其视植物种属而定(Toki S等人，Plant Physiol.1001503，1995)。
已建立的用于创造转基因植物的实例包括用聚乙二醇将基因引入至原生质体并再生植物体(Datta SKGene Transfer To Plant(Potrykus I and Spangenberg编辑)pp.66-74，1995)；用电脉冲将基因引入至原生质体并再生植物体(Toki S，等人，Plant Physiol.1001503，1992)；用粒子轰击将基因直接引入至细胞并再生植物体(Christou P.等人，Biotechnology 9957，1991)；包括用农杆菌将基因引入到细胞并再生植物体的方法(Hiei Y等人Plant J 6271，1994)等等。在本发明中可适宜地采用以上任何方法。
在本发明中，可使用任何种类的载体将RNAi基因引入至植物中，其可依基因转移的方法来选择。举例而言，当使用农杆菌法进行基因转移时，适宜地使用二元载体，例如pART、pBI101、pBI121及pIG121Hm。
在本发明中，创造该载体的方法不限定，可采用任何熟知的方法。用于本发明的载体包括位于转基因3′端的终止子。可适宜地使用任何已知终止子，终止子实例包括OCS终止子、nos终止子、35S终止子等等。
在本说明书中，可通过使用Karlin S.和Altschul的BLAST算法来测定核苷序列的同一性(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990，Karlin S & Altschul SF，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873，1993)。已开发了基于BLAST算法的程序，例如BLASTN和BLASTX(Altschul SF等人，J Mol.Biol.215403，1990)。这些分析中的方法对本领域为已知(http://www.ncbi.mlm.nih.gov/)。
实施例通过参考 具体实施例进一步阐述本发明，但这些实施例仅用于阐明本发明而非用于限制本发明。
实施例简述构建产生特异性靶向生物碱生物合成基因的双链RNA(dsRNA)的表达载体，由于其有效的沉默作用，有效抑制该目标基因的表达和该目标酶活性。经确证积聚了生物碱生物合成途径中间体。
具体而言，公开了一种用于生产异喹啉类生物碱生物合成中间体(其可作为一种重要药物使用)的方法，其包括使用双链RNA(dsRNA)通过RNA干扰(RNAi)技术关闭产生物碱植物细胞的代谢途径。将表达对应于编码小檗碱桥酶(苯并菲啶生物碱生物合成途径酶之一)序列之一部分的dsRNA的载体，引入至产生苯并菲啶生物碱的加州罂粟花细胞。结果关闭了加州罂粟花的该生物碱生物合成途径，且在该植物细胞中积聚网脉番荔枝碱，其为一种生物合成中间体。
实施例详述通过使用基于分离自加州罂粟花的已知的BBE基因序列(SEQ IDNO1)设计的引物，从加州罂粟花(其为可转化植物并产生异喹啉类生物碱)分离小檗碱桥酶(BBE)之cDNA。基于该cDNA构建BBE dsRNA表达载体。将该载体引入至加州罂粟花细胞，得到表达BBE dsRNA的转化子。由此建立加州罂粟花转化子，在其中积聚网脉番荔枝碱这种生物合成中间体或小檗碱桥酶底物。
材料与方法广泛用于产生反向重复的载体pKANNIBAL和pART27用于制备构建体。pKANNIBAL包括CaMV 355启动子、一在该启动子下游具有多重限制酶位点的内含子区域和该内含子区下游的OCS终止子。将正向序列和反向序列插入至该内含子两端。由此得到的序列在植物中被转录为mRNA然后被剪接。所述RNA形成一反向重复即双链RNA(dsRNA)。可用于本发明的载体不限于在实施例中使用的载体。从加州罂粟花分离BBE基因基于在数据库中注册的序列，通过PCR从培养的加州罂粟花细胞cDNA分离约1kb的几乎全长的加州罂粟花BBE基因片段，该片段在其3’臂具有BamHI和HindIII限制位点(在本说明书中称为反向序列的部分)和在其5’臂具有EcoRI和XhoI位点(在本说明书中称为正向序列的部分)。
用于PCR的引物如下BBE-3’臂-正向(FW)ATG GAT CCG ATT CGG ACT CGG ATTTCA ACC(SEQ ID NO2)反向(RV)ATT AAG CTT CCA CTT CGA TGA GGA AAC GG(SEQ ID NO3)5’臂-正向(FW)AAT CTC GAG ATT CGG ACT CGG ATTTCA ACC(SEQ ID NO4)反向(RV)CGA ATT CCA CTT CGA TGA GGA AAC GG(SEQID NO5)。
将由此分离的基因亚克隆至质粒pT7 Blue(Novagen)中，并用SIMADZU DSQ-2000L测序。
创造dsRNA表达载体(图5)插入3’臂将用引物对BBE 3’臂-FW和RV得到的PCR产物亚克隆至pT7-Blue中，测序和用BamHI和HindIII限制酶消化。同样用BamHI和HindIII消化载体PKANNIBAL。电泳这些DNA，用苯酚处理，氯仿抽提，乙醇沉淀，溶于10微升TE，并进行连接反应。用得到的DNA转化XL1-Blue。通过限制酶消化且用AS1测定该OCS终止子序列，确证该插入。
5’臂插入将用引物对BBE 5’臂-FW和RV得到的PCR产物亚克隆至pT7-Blue中，测序和用EcoRI和XhoI限制酶消化。为避免串联插入，用碱性磷酸酶(小牛肠碱性磷酸酶CIAP)进行去磷酸化作用。为了灭活CIAP，在65℃将反应物温育30分钟。然后通过乙醇沉淀灭活限制酶，将DNA溶于20微升TE中。同样用EcoRI和XhoI消化3’臂已有引入物的载体pKANNIBAL，进行连接反应。用得到的载体转化XL1-Blue。通过限制酶消化，用AS1引物测定该OCS终止子序列，以及用S1引物(35Spro-S1，GAG CTA CAC ATG CTC AGG TT(SEQ ID NO6)测定35S启动子序列，确证该插入。得到的插入BBE 3’臂和5’臂的质粒命名为pKANNIBAL-BBEir。
引入至二元载体pART27用限制酶NotI消化pART27载体，并用碱性磷酸酶(小牛肠碱性磷酸酶CIAP)处理。用NotI消化上述质粒pKANNIBAL-BBEir得到插入物。用苯酚分别抽提如此得到的载体溶液和插入物溶液，然后用氯仿抽提，用乙醇沉淀。将该等载体和插入物溶于20微升TE缓冲液中，将该混合物进行连接反应。从获得的菌落提取产生的质粒，用限制酶消化以确证该计划中的插入物是否插入。另外，使用35Spro-S1作为引物测定所得质粒的序列。经确证创造了表达计划中的dsRNA的载体pART27-BBEir。
引入至农杆菌通过电穿孔将由此创造的pART27-BBEir引入农杆菌LBA4404株中。通过用Promega SV Minipreps从出现的菌落提取质粒和用限制酶消化该质粒来确证该转化。
转化加州罂粟花细胞按照阐述于Proc.Nat.Acad.Sci.98367-372(2001)7中的方法将如上构建的表达载体引入至加州罂粟花细胞中。将加州罂粟花(Californiapoppy)的种子(Kaneko Seeds，Japan)包裹于神奇滤布(miracloth)中，用1％苯扎氯铵溶液表面消毒1分钟、用70％(v/v)乙醇表面消毒1分钟和用1％次氯化钠溶液表面消毒14分钟，然后用无菌水漂洗3次(每一次漂洗5分钟)。将如此消毒的种子播种在植物培养基中，在25℃培育。发芽后2到3周，用刀将幼苗的胚轴和叶子切为5毫米-1厘米长的断片。用共培养培养基将已在25℃摇瓶培养了2天的根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(用于引入pART27作为对照，用于引入pART27-BBEir)稀释5倍，将得到的悬浮液转入培养皿中，将该等植物断片在该悬浮液中沉浸10分钟。然后将该等植物断片置于Kimtowel上，移走培养基，将该等断片转入其上放置有滤纸的共培养琼脂培养基上。2天后将该等带有根瘤农杆菌的植物断片转入琼脂选择培养基(补充有100μM乙酰丁香酮、10μM萘乙酸、1μM苄基腺嘌呤和3％蔗糖的Linsmaier-Skoog培养基)中。此后将该等植物段片转入补充有200μg/ml头孢噻肟、20μg/ml潮霉素、10μM萘乙酸、1μM苄基腺嘌呤和3％蔗糖的Linsmaier-Skoog培养基中以实施选择。每3个星期将该等材料转入新鲜选择培养基中，选择健康生长的细胞。
确证转化使用基因组DNA，通过PCR确证转化子中转基因的存在。
分析生物碱按照于Proc.Nat.Acad.Sci.98367-372(2001)7中所述方法从该等细胞提取生物碱。详细情况为用4毫升经0.01N HCl酸化的甲醇过夜提取1克细胞，通过离心将上清液分开。用Shimadzu HPLC SCL-10系统(流动相50mM酒石酸和10mM SDS/乙腈/甲醇(4∶4∶1)；流速1.2毫升/分钟；管柱TSK-GEL ODS-80)分析该提取物。用ShimadzuLC/MS-2010系统(流动相水/乙腈/甲醇/乙酸＝391∶400∶100∶9；流速0.5毫升/分钟；管柱TSK-GEL ODS-80)鉴定每一种生物碱(图6)。
测量BBE酶活性如下测量加州罂粟花对照和带有BBE-dsRNA的转化子的BBE活性。将培养的细胞(1克湿重)加入至2毫升甘氨酸缓冲液(50mM甘氨酸-NaOH，pH8.9)中，在冰上匀浆。在PD-10柱上脱去提取物的盐分。向500μl粗酶溶液中加入底物网脉番荔枝碱以达到1mM浓度，并在30℃实施酶反应。在预定时间后通过加入10μl的1N NaOH终止该反应。此后用LC/MS定量金黄紫堇碱这种BBE代谢物的产量(图7)。
结果关于已用BBE-dsRNA转化的加州罂粟花转化子，在选择后2个月观察到愈伤组织的形成。在液体培养基中培养该愈伤组织。获得19个对照系(引入了pAPT27的系)和20个引入了BBE-dsRNA的转化子系。在对照和BBE-dsRNA转化子之间存在表型差异。对照细胞为微红色，而很多BBE-dsRNA转化细胞为白色。图6显示检查生物碱组成的HPLC分析结果。该图指出在BBE dsRNA转化子中显著积聚网脉番荔枝碱(约1.5毫克/1克湿重)。
关于BBE酶活性，与对照比较，在BBE-dsRNA转化子(在该图中称为BBEir)中观察到BBE活性显著降低。换言之，对照中网脉番荔枝碱这种BBE底物完全转换为金黄紫堇碱，而在BBE-dsRNA转化子中很少有从网脉番荔枝碱到金黄紫堇碱的转换(图7)。进行了BBE活性的时程分析和该活性量化。结果为对照细胞系C23的BBE活性为1.85+0.33pkat/毫克蛋白，而BBE-dsRNA转化子B14的BBE活性为0.056+0.051pkat/毫克蛋白。该结果显示BBE-dsRNA转化子的BBE活性降低为对照的约3％(图8)。
同样测定了对照和BBE-dsRNA转化子中网脉番荔枝碱和血根碱的含量。图9显示BBE-dsRNA转化子的网脉番荔枝碱含量通常高于对照的含量。
另一方面，据报道将反义BBE RNA表达载体引入至加州罂粟花根培养物中，一般导致该等细胞红色变淡且生物碱含量大大降低。在该报道中，未观察到由本发明引起的中间体代谢物积聚(PlantPhysiology，128，696-706(2002)和Plant Molecular Biology 51153-164(2003))。按照Plant Molecular Biology 511531-164(2003)的研究，通过使用反义方法保留约0.6pkat/毫克蛋白的BBE活性，据认为该代谢途径的关闭不够彻底。
基于这些发现，第一次证明RNAi技术在关闭代谢途径方面相当有效，通过RNAi技术沉默基因使抑制代谢反应并导致积聚计划中的中间体代谢物成为可能。
通过表达靶向BBE的dsRNA引起BBE底物网脉番荔枝碱积聚这一事实，提示各种中间体代谢物的积聚可通过关闭各自代谢途径来实现。
业已详尽阐明了生物碱生物合成途径，并且已分离了参与生物合成途径的某些酶，已知道它们中的某些序列。
关于生物碱生物合成途径的资料可通过参考(举例而言)P.J.Facchini，植物中生物碱生物合成Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.2001，5229-66和KEGGhttp://www.genome.ad.jp/kegg/metabolism/html来获得。关于该等酶的序列的资料可通过参考(举例而言)DDBJhttp://www.ddbj.nig.ac.jp/welcome-j.html和GenbankTMhttp://www/genome.ad.jp/dbget/debget links.html来获得。
因此，通过使用与本发明实施例所述方法相同的方法，可在植物中积聚生物碱生物合成的其它中间体。
举例而言，关于示于图1中的异喹啉类生物碱生物合成途径，通过抑制去甲乌药碱-6-O-甲基转移酶(1)(gb029811)、乌药碱-N-甲基转移酶(2)(gbAB061863，gbuAY217334)和乌药碱-3′-羟化酶(3)(gbAF014801，gbAB025030)，可分别积聚去甲乌药碱、乌药碱和N-甲基乌药碱。此外，关于示于图2中的吲哚类生物碱生物合成途径，通过抑制葡糖苷酶I/II(5)(gbAF112888)可积聚异胡豆苷。该等酶序列可从上述数据库获得。
工业应用性发现本发明中使用dsRNA的RNAi技术可有效关闭产生有用化合物(例如异喹啉类生物碱)的代谢途径。本发明第一次使在该途径中产生有用代谢中间体成为可能。由本发明建立的细胞系可用于开发产生新型化合物的新颖生物合成途径，该新型化合物可作为用于化学转化和各种相关化合物(例如药学上重要的生物碱)的材料。
序列表<110>京都大学<120>利用RNA干扰生产有用生物碱生物合成中间体的方法<130>664705<150>JP 2003-324960<151>2003-09-17<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>6968<212>DNA<213>加州罂粟花(Eschscholzia californica)<400>1aaatttagtt gcaaattcaa tttttctaat ttcttttctg ttgctatatg attcataagt 60gttagaaaat gattccatat atgtattagg cgtggtcgtc gtaaagtttt tggaattttg 120taaaccaaaa attactatat ataagttaga tattctccaa aagtgtctga tttatatgaa 180aagaataatt gaaaacaaga ttttataaca actaactccc aagaattaca tataaaaatt 240caagattatg gacaagtaat tgatgacaac tatcttcaac aaaaaaaaaa aattgatgac 300aactaacttc ccttagttgt ctttgtggag tagttgtttg acaagtgaaa atgtaagatg 360gtgattggca agttattgat ggcaaccaac ttgttacttt tccggtggta gctgtcaatt 420gcccttccat tagggctcgt cagtgttata ggtattcatg gggacatcta acatgtacat 480agaccctagt atccttccat aattttatga ttgattgatt ctatcctctc attaagtcta 540tataaggcta atactggttt cccattctgt tggctactat caaaatgacc taattagcaa 600agacaattta tctagttgac tactatacta acaatggaac tccctaacca aagaaagaga 660agatatgggt gggtgggggg agagtgacat tcttctctag gttttcaatt cctcccttga 720tcttaatttt cctttctttc ttttattgtt ttagattttc attatcacaa gtaatcaact 780tgagttttca acaaaaaaaa ataatcaact tgagtataaa atttaatata aaatattaga 840
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<223>合成核酸<400>2atggatccga ttcggactcg gatttcaacc 30<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成核酸<400>3attaagcttc cacttcgatg aggaaacgg 29<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成核酸<400>4aatctcgaga ttcggactcg gatttcaacc 30<210>5
<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成核酸<400>5cgaattccac ttcgatgagg aaacgg 26<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成核酸<400>6gagctacaca tgctcaggtt 20
权利要求
1.一种用于生产生物碱生物合成中间体的方法，其包括通过使用RNAi技术，在产生物碱的植物细胞、植物组织或植物体中抑制用所述中间体作为其底物的酶的表达。
2. 权利要求
1所述的方法，其中所述生物碱为一异喹啉类生物碱。
3. 权利要求
1所述的方法，其中所述酶选自小檗碱桥酶、去甲乌药碱-6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶和N-甲基乌药碱-3′-羟化酶。
4. 权利要求
3所述的方法，其中所述酶为小檗碱桥酶。
5. 权利要求
1所述的方法，其中所述生物碱生物合成中间体选自网脉番荔枝碱、去甲乌药碱、乌药碱和N-甲基乌药碱。
6. 权利要求
5所述的方法，其中所述生物碱生物合成中间体为网脉番荔枝碱。
7.一种由 权利要求
1至6任一所述方法生产的生物碱生物合成中间体。
8.一种用于 权利要求
1至7任一所述方法的基因，其包含i)一种启动子，和ii)该启动子下游的a)和b)序列a)正向序列，其与编码用所述中间体作为其底物的酶的全部或部分序列同源，b)反向序列，其与所述正向序列互补。
9.一种用于 权利要求
1至7任一所述方法的基因组合，其包含A与B基因A.i)一种启动子，和ii)该启动子下游的基因，其包含与编码用所述中间体作为其底物的酶的全部或部分序列同源的正向序列，B.i)一种启动子，和ii)该启动子下游的基因，其包含与所述正向序列互补的反向序列。
10. 权利要求
8所述的基因，其中所述酶选自小檗碱桥酶、去甲乌药碱-6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶和N-甲基乌药碱-3′-羟化酶。
11. 权利要求
9所述的基因组合，其中所述酶选自小檗碱桥酶、去甲乌药碱-6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶和N-甲基乌药碱-3′-羟化酶。
12.一种包含 权利要求
8或10所述基因的载体。
13.一种载体组合，其包含一种携有包含陈述于 权利要求
9或11中的正向序列的基因的载体，和一种携有包含与所述正向序列互补的反向序列的基因的载体。
14.一种植物细胞、植物组织或植物体，其用 权利要求
12所述载体或 权利要求
13所述载体组合来转化。
15. 权利要求
14所述植物细胞、植物组织或植物体，其中所述植物为产异喹啉类生物碱的植物。
16. 权利要求
15所述植物细胞、植物组织或植物体，其中所述植物为加州罂粟花(Eschscholzia californica)。
专利摘要
本发明提供一种用于生产生物碱生物合成中间体的方法，其包括通过使用RNAi技术在生产生物碱的植物细胞、植物组织或植物体中抑制用所述中间体作为其底物的酶的表达。本发明还提供用于所述方法的RNAi基因。
文档编号C12P17/12GKCN1882686SQ200480033547
公开日2006年12月20日 申请日期2004年9月15日
发明者佐藤文彦 申请人:国立大学法人京都大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan