本发明涉及医学病理领域，尤其涉及一种玻璃化冷冻保存软骨的方法。
背景技术：
近年来，随着我国人们生活水平的提高以及体育运动的全面普及，关节软骨损伤患者显著增多。软骨移植是目前治疗软骨病变的十分有前景的修复方法之一。因为异体软骨移植材料获得相对较容易且可预制成任意形状和大小,便于将正常功能的关节软骨制成各种形状植于骨缺损处，恢复软骨的外形。
近年来，同种异体骨软骨移植技术受到临床学者的关注。在实施关节软骨移植治疗过程中，软骨取材后的储藏、保存是保证手术实施的重要一环。传统低温冷冻法尽管能够保存软骨组织一定的活性，但会造成软骨基质的断裂。
传统的低温方法有很多局限性，无法避免冷冻过程中细胞内冰晶的形成，操作过程繁琐，需要昂贵的程序降温仪等。近年发展起来的玻璃化冷冻法以一种液态和固态之间的非晶体透明的玻璃样高粘度物质，并以这种状态在低温下长期保存，避免了冰冻过程中细胞内冰晶的形成，极大的减慢了反应速度，显著降低了细胞损伤的概率，使细胞长期维持相对稳定状态。
但是，玻璃化冷冻法在软骨保存的应用，并不完善，还存在着很多需要改善和提升的地方。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种玻璃化冷冻保存软骨的方法，降低冰冻液对软骨的毒性损伤，提高软骨细胞的成活率和生物活性。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种玻璃化冷冻保存软骨的方法，包括以下步骤：
1)配置玻璃化冷冻液在Hanks平衡盐溶液加入DMSO、乙酰胺、丙二醇、半乳糖、青霉素和聚乙二醇，用2mol/L氢氧化钠调节pH至7.3-7.5。
2)细胞培养将收集的软骨以灭菌PBS充分漂洗，并进行细胞培养和细胞传代，得细胞悬液。
3)冷冻保存将细胞悬液和玻璃化冷冻液分别预冷至4℃2h，缓慢向细胞悬液滴加玻璃化冷冻溶液得到细胞冷冻悬液，将细胞冷冻悬液分装于冷冻管管中，将冻存管两端以火焰封口，将冷冻管快速投入液氦中保存。
作为一种优选的方案，步骤1)中，所述玻璃化冰冻液中，每1000ml的Hanks平衡盐溶液中还包括：DMSO 18-22mmol，乙酰胺14-16mmol、丙二醇8-10mmol、半乳糖2-5g、聚乙二醇5-6mmol和青霉素70-90U。
作为一种优选的方案，每1000ml的Hanks平衡盐溶液中还包括：DMSO20.5mmol、乙酰胺15.5mmol、丙二醇10mmol、半乳糖3g、青霉素90U和聚乙二醇6mmol，用2mol/L氢氧化钠调节pH至7.4。用2mol/L氢氧化钠调节pH至7.4。
作为一种优选的方案，步骤3)中，向细胞悬液滴加玻璃化冷冻溶液的滴加过程为：前3min以0.3ml/min滴加，后5min以0.6ml/min滴加，余下的冻存液以0.75ml/min滴加。
作为一种优选的方案，还包括复温过程，将冷冻管放入37℃水浴复温，不断搅拌直到完全融化后，收集细胞悬液备用。
作为一种优选的方案，收集的细胞悬液放入PBS缓冲液中备用。
由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明涉及的玻璃化冷冻保存软骨的方法选用的玻璃化冷冻液，低浓度渗透液降低了对软骨细胞的毒性损伤。用Hanks平衡盐溶液加入DMSO、乙酰胺、丙二醇、半乳糖、青霉素和聚乙二醇的冷冻液，延长了细胞的保存时间。
使用温度更低的液氦(﹣269℃)为冷源冷冻保存皮肤间充质干细胞，取得的结果是液氦冷冻的效果优于液氮冷冻。液氦是唯一在常压下和沸点以下直至趋近绝对零度仍保持液态的物质，是目前可被利用的、温度最低的液体。
选用液氦液氦(﹣269℃)取代液氮(﹣196℃左右)作为冷源，在相同操作条件下，降温速率提高，进一步降低了软骨细胞的损伤概率，提高了软骨细胞的成活率和生物活性。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种玻璃化冷冻保存软骨的方法，包括以下步骤：
1)配置玻璃化冷冻液每1000ml的Hanks平衡盐溶液中还包括：DMSO20.5mmol、乙酰胺15.5mmol、丙二醇10mmol、半乳糖3g、青霉素90U和聚乙二醇6mmol，用2mol/L氢氧化钠调节pH至7.4。用2mol/L氢氧化钠调节pH至7.4。
2)细胞培养将收集的软骨以灭菌PBS充分漂洗，并进行细胞培养和细胞传代，得细胞悬液。
3)冷冻保存将细胞悬液和玻璃化冷冻液分别预冷至4℃2h，缓慢向细胞悬液滴加玻璃化冷冻溶液得到细胞冷冻悬液，滴加过程为：前3min以0.3ml/min滴加，后5min以0.6ml/min滴加，余下的冻存液以0.75ml/min滴加。将细胞冷冻悬液分装于冷冻管中，将冻存管两端以火焰封口，将冷冻管快速投入液氦中保存。
4)复温将冷冻管放入37℃水浴复温，不断搅拌直到完全融化后，收集细胞悬液，用磷酸盐缓冲液液冲洗3遍，然后用荧光标记法测定细胞存活率为86％。
同样条件下，分别采用程序性降温法、梯度降温法、采用氮气降温的玻璃化冷却法保存软骨细胞相同时间，测定细胞存活率为79％、62％和82％。可以看出本发明涉及的冷冻保存方法提高了细胞的成活率。
实施例2
一种玻璃化冷冻保存软骨的方法，包括以下步骤：
1)配置玻璃化冷冻液每1000ml的Hanks平衡盐溶液中加入：DMSO 20mmol，乙酰胺16mmol、丙二醇8mmol、半乳糖4g和聚乙二醇5mmol以及青霉素70U，用2mol/L氢氧化钠调节pH至7.4。
2)细胞培养将收集的软骨以灭菌PBS充分漂洗，并进行细胞培养和细胞传代，得细胞悬液。
3)冷冻保存将细胞悬液和玻璃化冷冻液分别预冷至4℃2h，缓慢向细胞悬液滴加玻璃化冷冻溶液得到细胞冷冻悬液，滴加过程为：前3min以0.3ml/min滴加，后5min以0.6ml/min滴加，余下的冻存液以0.75ml/min滴加。将细胞冷冻悬液分装于冷冻管中，将冻存管两端以火焰封口，将冷冻管快速投入液氦中保存。
4)复温将冷冻管放入37℃水浴复温，不断搅拌直到完全融化后，收集细胞悬液备用。然后用荧光标记法测定细胞存活率为84％。
实施例3
一种玻璃化冷冻保存软骨的方法，包括以下步骤：
1)配置玻璃化冷冻液每1000ml的Hanks平衡盐溶液中加入：DMSO18mmol，乙酰胺14mmol、丙二醇8mmol、半乳糖2g和聚乙二醇5mmol以及青霉素75U，用2mol/L氢氧化钠调节pH至7.4。
2)细胞培养将收集的软骨以灭菌PBS充分漂洗，并进行细胞培养和细胞传代，得细胞悬液。
3)冷冻保存将细胞悬液和玻璃化冷冻液分别预冷至4℃2h，缓慢向细胞悬液滴加玻璃化冷冻溶液得到细胞冷冻悬液，滴加过程为：前3min以0.3ml/min滴加，后5min以0.6ml/min滴加，余下的冻存液以0.75ml/min滴加。将细胞冷冻悬液分装于冷冻管中，将冻存管两端以火焰封口，将冷冻管快速投入液氦中保存。
4)复温将冷冻管放入37℃水浴复温，不断搅拌直到完全融化后，收集细胞悬液备用。然后用荧光标记法测定细胞存活率为85％。