本发明涉及组织细胞培养技术领域，具体涉及一种造血干细胞细胞冻存剂及其制备方法和应用。
背景技术：
造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。它是研究历史最长且最为深入的一类成体干细胞，对研究各类干细胞，包括肿瘤干细胞，具有重要指导意义。
近几年来.自体造血干细胞移植在恶性血液病和多种实体肿瘤的治疗上得到了广泛的应用。如何高质量地保存采集的自体造血干细胞是ahsct治疗成功的关键之一。ahsc的保存分为非冷冻保存和冷冻保存两种，前者虽无冷冻损伤。但保存时间短，限制了临床应用.后者将造血干细胞置于0℃以下，可以长时间保存以供实验研究与临床应用，但冻存过程中会造成部分细胞的损伤和丢失，因此如何最大限度地使造血细胞在冻存过程中免受损伤是最需要解决的课题。
为了防止细胞在冷冻过程中因细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致细胞损伤，加人冷冻保护剂是必要的。选择不同的冷冻保护剂及其浓度对hsl的保护是有影响的。二甲基亚矾能够快速穿透细胞膜进人细胞中，降低冰点、延缓冷冻过程，使细胞有充足时间适应降温变化，同时提高胞内离子浓度，减少胞内冰晶形成从而减少细胞损伤。但临床回输用dmso冻存的hsc时出现高血压、心律失常、胸闷、腹部不适等毒副作用.其发生率与dmsd的输人量有关。于是人们开始寻找有效且毒副作用更小的冷冻保护剂。现有技术用细胞内冷冻保护剂5％dmso与细胞外冷序冻保护剂6％羟乙基淀粉hes冷冻保存外周血单个核细胞获得了很好的回收率，显示dmso/hes联合应用优于dmso单用，但加果hes浓度过高会使细胞过度脱水、皱缩而造成损伤。在冷冻保护液中加人自体血浆或人血清白蛋白等对提高hsc的保存质量很重要，但它们的作用机制还不十分明确，可能与维持细胞在冻融过程中的活力有关。最近有人研究在冷冻液中加人细胞因子如:gh4-csf,il-3.il-1等，对提高冷冻保存hsc的增殖潜力有一定作用。据报告在冷冻前用造血生长因子刺激千细胞、能有效提高冻存的hsc的增殖潜力，部分受冷冻损伤的hsc在一定条件下可恢复其增殖能力。
目前，干细胞冻存使用的冻存液有含血清和无血清的两类，由于血清具有成分复杂、质量不稳定、价格昂贵等缺点，无血清冻存和复苏技术成为发展趋势。低温保存干细胞主要依靠抗冻液二甲基亚砜(dmso)和血清的保护。常用到的细胞保护剂还有羟乙基淀粉、聚乙二醇(peg)等。但是，dmso会对细胞产生毒性作用，对冻存的干细胞造成不可逆的损伤。为获得来源方便的造血干细胞，开展有效的造血干细胞冻存方法是本领域迫切的需求，建立一种长期低温保存造血干细胞的方法对于促进造血干细胞的研宄和应用具有重大意义。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种造血干细胞细胞冻存剂以及相应的制备方法及使用方法。
本发明的技术方案如下：
一种造血干细胞细胞冻存剂，其特征在于由如下各组分组成：谷氨酰胺20mg，表皮细胞生长因子300μg，0.2％w/v蔗糖，0.5％w/v低密度脂蛋白，0.5％w/v的海藻糖，0.5％w/v卵磷脂，多肽100ppmw/v，bfgf0.6％w/v，维生素e0.5％w/v，甘油2％v/v最后用dmem培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，所述多肽的序列如seqidno：1-3任一所示。所述多肽由申请人通过特异性针对造血干细胞进行的前期的大量的基因库筛选得到，所述多肽具有保护造血干细胞免受损伤的功能。其名称分别为
hscs-1：ftqnrcsyqqgssqgatlhpewiawir；
hscs-2：vweqylrrkrwrqcyekdhlsrhprhd；
hscs-3：tatinpyprsakwwkrwwspmwrycls。
在本发明的细胞的冻存液中，甘油和海藻糖以及维生素e和多肽具有明确的抵御外来伤害对细胞的损伤，特别是多肽，还具有保护细胞免受冻存时冰结晶对细胞的损伤，其余集中组分对于维持特异性的造血干细胞的生存是必须的。
本发明还提供了一种细胞的冻存液的制备方法，即将所述各组分混合摇匀即成。
本发明还提供了一种造血干细胞冻存方法，包括以下步骤:
a.冻存液制备:制备所述的细胞冻存液，将各组分按照常规的操作方法将各组分按照相应的比例混合即可获得；
b.细胞悬液制备:培养生长成单层的造血干细胞一瓶，0.25％胰蛋白酶液消化4分钟，弃胰酶液，加入dmem培养液15ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，离心4000转/分，弃上清，加入步骤a冻存液2ml，混均，置入无菌的冻存管内；
c.冷冻:先将冻存管在4℃下冻存30min，然后放入-30℃冻存lh，再放入-80℃冻存3h，最后移入液氮中保存；
d.细胞复苏:取出冻存管快速置于37℃水浴，震荡直至细胞悬液完全融化，然后用5倍dmem液稀释，1000r/min离心5min,离心去除上清液,再重复3次。所述细胞悬浮浓度为108细胞/ml-1010细胞/ml。
本发明的有益效果:
本发明的细胞冻存液，复苏细胞存活率可达98.0％以上，较使用常规细胞冻存液的复苏存活率有了显著提高，基本上没有细胞的损耗。
本发明的造血干细胞冻存液可以长期保存造血干细胞，细胞活性不发生变化，保证了细胞生物学活性。
本发明神经细胞冻存方法，操作简单可行，价格适宜，具有较好的实用价值。
具体实施方式
实施例1
分别加入谷氨酰胺20mg，表皮细胞生长因子300μg，0.2％w/v蔗糖，0.5％w/v低密度脂蛋白，0.5％w/v的海藻糖，0.5％w/v卵磷脂，多肽100ppmw/v，bfgf0.6％w/v，维生素e0.5％w/v，甘油2％v/v最后用dmem培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，所述多肽的序列如seqidno：1所示。
实施例2
分别加入谷氨酰胺20mg，表皮细胞生长因子300μg，0.2％w/v蔗糖，0.5％w/v低密度脂蛋白，0.5％w/v的海藻糖，0.5％w/v卵磷脂，多肽100ppmw/v，bfgf0.6％w/v，维生素e0.5％w/v，甘油2％v/v最后用dmem培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，所述多肽的序列如seqidno：2所示。
实施例3
分别加入谷氨酰胺20mg，表皮细胞生长因子300μg，0.2％w/v蔗糖，0.5％w/v低密度脂蛋白，0.5％w/v的海藻糖，0.5％w/v卵磷脂，多肽100ppmw/v，bfgf0.6％w/v，维生素e0.5％w/v，甘油2％v/v最后用dmem培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，所述多肽的序列如seqidno：3所示。
比较例i
将dmso，1640无菌培养基和血液保存液i三者体积比例:10:5:5混合。
比较例ii
将二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，最后用dmem培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。
比较例iii
将二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，最后用dmem培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。
实施例3冻存液的效果验证
以上实施例1-3及比较例i-iii所制备的细胞冻存液，分别按照下述方法进行细胞冻存和复苏实验。
细胞冻存过程:
培养生长成单层的造血干细胞，其细胞密度约6*109个/ml，加入ph7.0的pbs洗细胞表面一次。
将细胞用0.25％胰蛋白酶液消化4分钟，弃胰酶液，加入dmem培养液15ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，离心4000转/分，弃上清，加入实施例1-3和比较例1所制备的冻存液2ml，混均，置入无菌的冻存管内；
冷冻:先将冻存管在4℃下冻存30min，然后放入-30℃冻存lh，再放入-80℃冻存3h，最后移入液氮中保存；分别冻存1周，4个月，8个月。每组3个重复。
细胞复苏:取出冻存管快速置于37℃水浴，震荡直至细胞悬液完全融化，然后用5倍dmem液稀释，1000r/min离心5min,离心去除上清液,再重复3次，计算细胞存活率。结果如下：
取8个月的冻存细胞，进行细胞分化培养，其中所述的造血干细胞能够正常进行分化，分化效率达到98.5％，而比较例i-iii取出的细胞其分化率只能达到62.3％,60.0％，67.4％，这充分的说明细胞活性收到很大的影响。
实施例4特异性检测
将实施例1的培养基，分别针对其他几种干细胞：骨髓间充质干细胞，神经干细胞，脂肪干细胞进行采用实施例1的培养方式进行冷冻试验，通过8个月的冻存试验，发现，8个月之后的这几种细胞存活率分别为88.3％，87.5％，80.2％，说明，本发明的冷冻剂可以特异性的培养造血干细胞。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
〈110〉陈印平
〈120〉一种造血干细胞细胞冻存剂
〈160〉3
〈210〉1
〈211〉27
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉hscs-1
ftqnrcsyqqgssqgatlhpewiawir；
〈211〉27
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉hscs-2
vweqylrrkrwrqcyekdhlsrhprhd；
〈211〉27
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉hscs-3
tatinpyprsakwwkrwwspmwrycls；