专利名称：用蜂王浆制备功能蛋白RJCPs的方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白工程与细胞工程领域，尤其涉及一种利用西方蜜蜂(Apis mellifera)，尤其是意大利蜜蜂(Apis mellifera mellifer)王浆制备的功能蛋白RJCPs 的方法，本发明还涉及该蛋白应用于动物细胞培养的具体方法。
背景技术：
动物细胞，包括昆虫细胞、哺乳动物细胞和人体细胞的大规模培养是现代生物技 术的重大发展方向之一，在如单克隆抗体、组织型纤溶酶原激活因子、红细胞生成素、干扰 素等生物制品的生产中已成为起支柱作用的技术，特别是近几年一些贵重的生物制品可来 源于异倍体细胞、肿瘤组织源的细胞及重组细胞。随着动物细胞培养系统气升式反应器、中 空纤维系统、微载体等工业化规模的兴起，相应地无血清培养日益受到关注，人们正寻求胎 牛血清的替代物以降低生产成本。20世纪50年代初，Eagle发明了含有氨基酸、维生素、碳水化合物和矿物质等的基 础培养基。但该培养基仍然需要体液作支持。当时不清楚体液的作用，只知道其为细胞生 长所必需。后来，这种培养基在使用20%的动物血清替代体液后，得到了广泛的使用，人们 随之了解到，胎牛血清含有最完全的细胞培养所需的营养成分和因子，增加牛血清后的培 养基具有足够的生长因子。目前最常用的是添加10-20%胎牛血清的培养基。目前，牛血清是疫苗和生物技术产品生产过程中细胞培养不可或缺的原材料，但 其质量的高低严重影响产品质量，尤其是受外源因子污染的血清对最终产品的使用者将造 成严重威胁。我国的牛血清产品均以宰杀出生后的小牛获取血清的模式生产，这种小牛感 染BVDV和其他外源病毒的机率很高。此外，由于不同批次牛血清间的生物活性和因子的不 一致，导致产品和实验结果的重现性差；制品中残留的牛血清易引起被接种者对血清的过 敏反应。虽然目前将一些细胞的培养设计成无血清的培养体系可避免这些问题，但绝大多 数的培养体系仍在使用添加血清的培养基。ig 1997 $出片反的〈〈Medical and healthcare market place guideH^IlJ, H^^rU 场每年用于生物药物和疫苗生产的胎牛血清为50万升，价值10亿美元，而使用胎牛血清后 所产出的产值为40亿美元，可见目前生物技术产品和病毒性疫苗的生产大多数仍依靠细 胞培养来表达产物和扩增病毒。虽然近年来无血清培养基正在扩大使用，并证明是可行的， 但是需要复杂的设备，而且仅限于特殊的细胞类型。尽管人们已认识到无血清培养基有许 多优点，但应用无血清培养基培养正常细胞的目标很难达到，目前仅用于丧失贴壁功能、具 有肿瘤特性的细胞的悬浮培养。因此，未来一段时间内仍不得不采用常规添加牛血清生产 生物制品。以昆虫细胞为例，目前昆虫细胞培养一般是在含有10% 20%的牛血清培养基 中生长，由于血清成本高、来源少，批量间的质量不稳定、重复性差，限制了昆虫细胞大规模 培养的发展及应用，而且血清成份复杂，是支原体和其它异源病毒污染的重要来源，为重组 蛋白的下游处理带来了困难，发展无血清培养基是解决这些困难的关键技术之一。而进口的无血清培养基价格昂贵，不利于开展细胞大规模培养工作，因此在国内发展无血清培养， 寻找使用可替代血清的多肽或蛋白生长因子具有重要的经济意义和理论意义。据文献报道，含有乳球蛋白、α-乳白蛋白和血清蛋白等的蛋白质含有11种 必需氨基酸和7种非必需氨基酸，是目前已知的、具有促细胞生长活性的细胞生长因子。如 β -乳球蛋白含有两种促细胞生长因子，分子量约4-40kDa，在0. 3% -0. 5%内对细胞生长 有明显的刺激作用，而当其浓度低于0.05%时不能促进细胞增殖。目前已有很多采用重组 基因工程方法表达人体表皮细胞生长因子的研究报道，但国内尚未见利用蜂王浆制备细胞 生长因子的研究报道。蜂王浆是由成年工蜂头部的外分泌腺体分泌的一种化合物，它是蜂群用于哺育蜂 幼虫的食物的重要组分，是促进幼虫产生级型分化的最重要的营养因素。蛋白质是蜂王浆 最主要的组分之一，占王浆干重的50%。一般王浆蛋白由水溶性蛋白和非水溶性蛋白组 成，其中水溶性蛋白占总蛋白含量的46% -89%，为王浆蛋白的主要部分，称Major Royal Jelly Proteins (MRJPs)。此外，Schmidt等根据研究结果推测蜂王浆蛋白中MRJPs的含量 可能达到 90% (Schmidt et al，1998，Cell Mol Life Sci. 54(9) 1020-1030) Drapeau 等通过对西方蜜蜂基因组研究确定，西方蜜蜂MRJPs家族有9个成员，即MRJPl MRJP9，其 分子量范围在25 87kDa。通过对该家族基因、分子结构和功能的研究发现，MRJPs包含大 量的必需氨基酸，在蜜蜂营养中有着重要作用，其中MRJPlmRNA在新羽化蜂、哺育蜂、采集 蜂头部有不同表达，在咽下腺，即大脑蕈体的Kenyon细胞中表达，在大脑中发挥调控作用， 与其行为相关。我国自1957年开始生产王浆，1959年中国农科院蜜蜂所研究成功有王生产技术。 通过科研人员和蜂农的选择育种、杂交育种和工程育种，目前我国已陆续育成了多个意大 利蜜蜂优良产浆种系，其中浙江省的浙农大1号、平湖意蜂和萧山意蜂成为国内公认的高 产浆蜂种质资源，王浆产量在1995年创世界最高记录，年群单产达7. 7kg。自1999年以来， 我国蜂蜜和王浆产量和出口量一直稳居世界第一，王浆产量占世界的90%以上。我国养蜂 业的崛起，产量大幅度提高的主要原因是形成了以王浆高产蜂种为龙头的配套技术，高产 蜂种资源成为我国养蜂业的优势，并大量出口海外(陈盛禄.2001，中国蜜蜂学.中国农业 出版社)，蜂王浆成为我国出口创汇的主要农产品之一。但是，但由于我国王浆生产长期停 留于传统农产品模式，缺乏深加工技术，国内市场和出口产品主要为原王浆和王浆冻干粉， 作为居民直接消费品的主要是保健食品、化妆品，缺乏具有高新技术含量和自主知识产权， 产品附加值高的生物医药、生物试剂产品，特别是对出口依赖性大，价格波动性大。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用蜂王浆制备功能蛋白RJCPs 的方法与应用。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种用蜂王浆制备功能蛋白RJCPs 的方法，该功能蛋白RJCPs通过新鲜蜂王浆或新鲜蜂王浆冻干粉经PBS缓冲液溶解、离心分 离、透析除盐、冻干等步骤制备而成。进一步地，所述蜂王浆功能蛋白RJCPs电泳后显示的分子量范围在25 SOkDa ； 所述蜂王浆功能蛋白RJCPs可与蜂王浆蛋白MRJPl和MRJP7多克隆抗体产生免疫反应，显示分子量范围在57 80kDa在Western blot印迹。一种蜂王浆功能蛋白RJCPs作为细胞生长因子应用于任何昆虫、动物、人体细胞 的传代和原代体外无血清培养生存生长培养方面的应用。本发明的有益效果是本发明所制备的蜂王浆功能蛋白RJCPs是一种细胞生长 因子，可替代牛血清应用于昆虫、动物、人体细胞的传代和原代体外无血清培养生存生长培养。
图1是意大利蜜蜂蜂王浆功能蛋白RJCPs的SDS-PAGE电泳分析，RJCPs的与蜂王 浆主蛋白MRJPl多克隆抗体的Western blot印迹分析，其中，(a)和(b)为意大利蜜蜂蜂 王浆功能蛋白RJCPs的SDS-PAGE电泳图，M为标准蛋白分子量Marker，RJ所示为蜂王浆 功能蛋白样品，(c)为Western blot印迹分析结果，RJ所示为意大利蜜蜂王浆蛋白；箭头 所示为AmMRJPs各成员AmMRJPl、AmMRJP2、AmMRJP3a和AccMRJP5的位置，位置的标示参 照 Schmidt 等发表的西方蜜蜂蜂王菜(Schmidt et al, 1998, Cell Mol Life Sci. 54(9) 1020-1030)。图2是采用Bradford法蛋白定量试剂，用酶标仪测定不同浓度下蛋白标准品的 OD595值建立的标准蛋白曲线，X轴为OD595值，Y轴为蛋白浓度。图3是标准无血清培养基TNM-FH中添加RJCPs与添加胎牛血清FBS第3天，两种 培养基中的粉纹液蛾细胞TN-5B1-4细胞形态比较图，(a)添加胎牛血清FBS后3天后细胞 形态，(b)为添加RJCPs后3天的细胞形态。图4是TN-5B1-4标准无血清培养基中添加RJCPs与添加胎牛血清FBS后第3天， 两种培养基中的TN-5B1-4活细胞密度比较。图5是无血清培养基中DMEM中添加RJCPs与添加胎牛血清FBS后10天后，人结 肠癌细胞HCT-116细胞形态比较图，(a)添加胎牛血清FBS后10天的细胞形态，(b)无血清 DMEM培养基培养的细胞3天后的形态，(c)添加RJCPs后10天的细胞形态。图6是无血清培养基中DMEM中添加不同浓度RJCPs (0，100, 200, 300,400, 500 μ g/ mL DMEM)与添加10 %胎牛血清FBS后第10天，每个培养皿的培养液中存活人结肠癌活细 胞 HCT-116 数量(Viable cell number/well)的比较图。图7是无血清培养基MEM中添加RJCPs与添加胎牛血清FBS后，不同培养基中人 肾上皮细胞系293T细胞形态比较图，(a)为添加胎牛血清FBS后3天的细胞形态，(b)为无 血清MEM培养基培养3天的细胞形态，(c)为添加RJCPs后3天的细胞形态，活细胞数采用 台盼蓝法测定。图8是无血清培养基中DMEM中添加不同浓度RJCPs (0，100, 200, 300,400, 500 μ g/ mL DMEM)与添加10%胎牛血清后FBS第10天，每个培养皿的培养液中存活人肾上皮细胞 系293T数量(Viable cell number/well)的比较图，活细胞数采用台盼蓝法测定。图9是无血清培养基RPMI 1640中添加RJCPs与添加胎牛血清后10天后，不同培 养基中卵巢癌细胞系A2780/cp70细胞形态比较图，(a)为添加胎牛血清后10天的细胞形 态，(b)为无血清RPMI 1640培养基培养的细胞10天后的形态，(c)为添加RJCPs后10天 的细胞形态。
具体实施例方式蜂王浆功能蛋白RJCPs属水溶性蛋白，通过新鲜蜂王浆或新鲜蜂王浆冻干粉经 PBS缓冲液溶解、离心分离、透析除盐、冻干而成，分子量范围在57 105kDa，可与蛋白 MRJPl和MRJP7多克隆抗体产生免疫反应，添加于无血清标准培养基后，具有类似于胎牛血 清或小牛血清的，促进动物细胞生长与分裂的生物活性，该蛋白可应用于动物细胞培养。本发明用蜂王浆制备具有促进动物细胞生长功能的生长因子的具体步骤如下1.蜂王浆功能蛋白RJCPs的制备与检测①称取冷冻保存的王浆冻干粉5g，溶于15mL IX磷酸缓冲液PBS(配制方法 NaCl 8g、KCl 0. 2g、KH2P040. 24g、Na2HP04 · 12H20 3. 63g，溶解 800mL 蒸馏水中，用 HCl 调 节溶液的PH值至7. 4，加水定容至1L，高压蒸汽灭菌20min，室温保存)。将王浆溶液置4°C 抽提24h。②将王浆溶液置离心管，用冷冻离心机在每分钟12000rpm转速下离心30min，取 上清即为可溶性王浆蛋白MRJPs。③将RJCPs置膜径为14k的透析袋中，将透析袋置去离子水中，在4°C下透析24h， 期间每隔6 8h换水一次，去除盐离子。④将透析过的RJCPs置真空冷冻干燥机冻干，-20°C保存备用。取此冻干粉，进行 SDS-PAGE变性电泳分析，可见分子量范围在25 87kDa ；用纯化的蜂王浆主蛋白MRJPl免 疫大白兔所制备的多克隆抗体作为一抗，进行Western blot检测，RJCPs蛋白显示35、57、 87、105kDa的免疫印迹。⑤取此RJCPs冻干粉溶于无菌去离子水，用Bradford试剂盒对该溶液进行蛋白质 含量测定，定容为每毫升含蛋白80 100 μ g ；溶液用孔径为0. 22 μ m的过滤膜进行过滤除菌。2.用蜂王浆功能蛋白RJCPs替代胎牛血清培养昆虫细胞①无血清昆虫细胞培养基配制称取TNM-FH培养基干粉(美国Sigma公司生产)δ1· 2g,NaHCO3O. 35g，溶于800mL 灭菌双蒸水，置磁力搅拌器搅拌至完全溶解；用lmol/L NaOH溶液调pH值至6. 0，定容至 IL ；溶液用孔径0. 22 μ m的过滤膜过滤除菌，得无血清标准培养基。②添加蜂王浆功能蛋白RJCPs的昆虫培养基配制在无血清标准培养基中添加10-20%体积比的蜂王浆功能蛋白RJCPs，混勻。③培养昆虫细胞取35mm细胞培养皿，接种1 X 105Τη-5Β1_4单层细胞，加入2mL含胎牛血清的培 养基，轻轻晃动培养皿，使细胞分散均勻，28°C培养箱中培养培养48h至细胞长至对数生长 期；用无血清的TNM-FH培养基轻轻洗涤细胞2次；加含10% RJCPs的TNM-FH培养基；分别 在72h、96h后，用倒置显微镜观察细胞的形态、贴壁情况，拍照、计数细胞增殖数量。3.用蜂王浆功能蛋白RJCPs替代胎牛血清培养人结肠癌细胞HCT-116用添加蜂王浆功能蛋白RJCPs的MEM培养基(GIBC0公司产，含100U/L青霉素、含 100U/L链霉素)培养起始密度为30%的人结肠癌细胞HCT-116，于37°C、50ml/L CO2的培 养箱中培养，可维持细胞正常生长10天以上，活性明显优于牛血清。
4.用蜂王浆功能蛋白RJCPs替代胎牛血清培养人肾上皮细胞系293T用添加蜂王浆功能蛋白RJCPs于DMEM高糖培养基(含100U/L青霉素、含100U/L 链霉素)培养人大肠癌细胞HCT-116，培养起始密度为30%，于37°C、50mL/L CO2的培养箱 中培养3天，具有明显优于牛血清的活性。意大利蜜蜂王浆是蜜蜂哺育工蜂头部王浆腺分泌的乳状物，含丰富的活性蛋白。 本发明的蜂王浆功能蛋白RJCPs为发展蜂王浆深加工，开发高科技生物制品，提供有利于 克服胎牛血清弊病，确保细胞工程产品安全的新方法，及其大规模的生产并应用于抗菌方 面打下了基础。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明范围。实施例1 蜂王浆功能蛋白RJCPs的制备与检测1.可溶性王浆蛋白抽提称取冷冻保存的王浆冻干粉5g，溶于15mL磷酸缓冲液IXPBS (配制方法=NaCl 8g、KCl 0. 2g、KH2PO4O. 24g、Na2HP04 · 12H20 3. 63g，溶解 800mL 蒸馏水中，用 HCl 调节溶液 的pH值至7. 4，加水定容至1L，高压蒸汽灭菌20min，室温保存)，将溶液置4°C抽提24h。2.可溶性王浆蛋白分离将王浆溶液置离心管，用冷冻离心机在每分钟12000g/转速下离心30min，取上清 即为可溶性王浆蛋白MRJPs。3.透析脱盐 将可溶性蜂王浆蛋白RJCPs溶液置膜径为14kDa的透析袋中，扎紧袋口，将透析袋 置去离子水中，置冰箱内冷藏室内，在4°C温度下透析24h，期间每隔6 8h换水一次，以去 fe ik罔子ο4.冻干将已经透析处理的RJCPs溶液置冰箱内冷冻，然后置真空冷冻干燥机冻干。将冻 干粉密封容器内，-20°C保存备用。5.蛋白质电泳检测取此冻干粉，进行SDS-PAGE变性电泳分析，可见分子量范围在25 87kDa(附 图1A)；用纯化的蜂王浆主蛋白MRJPl免疫大白兔所制备的多克隆抗体作为一抗，进行 Western blot检测，RJCPs蛋白显示同样的kDa的免疫印迹(附图1B)。6.使用液配制取此RJCPs冻干粉溶于无菌去离子水，用Bradford试剂盒对该溶液进行蛋白质含 量测定。按照Bradford法蛋白定量试剂盒的说明稀释蛋白标准品，用酶标仪测定不同浓度 下标准品及样品的0D595值(见表1)，建立标准曲线(图2)，公式为y = 14. 441χ-8. 1249。 将MRJPs溶液的吸光度(X)代此公式，MRJPs溶液浓度(Y)为80. 9 μ g/mL。将此溶液用孔 径为0. 22 μ m的过滤膜进行过滤除菌即得。表1蛋白标准品及样品的吸光度(0D值)测定
权利要求
一种用蜂王浆制备功能蛋白RJCPs的方法，其特征在于，该功能蛋白RJCPs通过新鲜蜂王浆或新鲜蜂王浆冻干粉经PBS缓冲液溶解、离心分离、透析除盐、冻干等步骤制备而成。
2.根据权利要求1所述用蜂王浆制备功能蛋白RJCPs的方法，其特征在于，所述蜂王浆 功能蛋白RJCPs电泳后显示的分子量范围在25 80kDa。
3.根据权利要求1所述用蜂王浆制备功能蛋白RJCPs的方法，其特征在于，所述蜂王浆 功能蛋白RJCPs可与蜂王浆蛋白MRJPl和MRJP7多克隆抗体产生免疫反应，显示分子量范 围在57 80kDa在Western blot的印迹。
4.一种蜂王浆功能蛋白RJCPs作为细胞生长因子应用于任何昆虫、动物、人体细胞的 传代和原代体外无血清培养生存生长培养方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用蜂王浆制备功能蛋白RJCPs的方法，该功能蛋白RJCPs通过新鲜蜂王浆或新鲜蜂王浆冻干粉经PBS缓冲液溶解、离心分离、透析除盐、冻干而成；本发明所制备的蜂王浆功能蛋白RJCPs是一种细胞生长因子，可替代牛血清应用于昆虫、动物、人体细胞的传代和原代体外无血清培养生存生长培养。
文档编号C12N5/07GK101948518SQ20101025616
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者张伟光, 张瑮文, 沈立荣, 莫寅元, 袁鹏, 赖超强, 陈益 申请人:浙江大学