改进的基因表达检测的制作方法

专利名称：改进的基因表达检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的表达。更具体地说，本发明涉及检测CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3的甲基化或非甲基化形式的方法以及相关寡核苷酸、引物、探针、引物对和试剂盒。本发明方法涉及扩增技术，尤其是基于荧光的实时 PCR和终点PCR方法，具有诊断、预防和治疗用途。
背景技术：
癌症睾丸(CT)抗原癌症睾丸(cancer testis，CT)抗原是一类肿瘤相关抗原，其表达通常局限于睾丸、卵巢或滋养层中的生殖细胞。这些抗原通常不在成体的体细胞组织中表达 (Simpson 等，Nat. Rev. Cancer, 5 (8) :615-625(2005) ；Scanlan 等，Immunol. Reviews, 188 22-32(2002) ；ScanIan 等，Cane. Immun.，4 1-15 (2004)) 癌症患者体内的CT抗原基因调控被破坏，导致这些抗原在许多种肿瘤中异常表达。第一个被鉴定的CT抗原MAGE-I于二十世纪90年代早期通过T-细胞表位克隆得到 (van der Bruggen 等，1991 Science 13 ；254 (5038) :1643-7 ；van der Bruggen 等，1999 Science 254 1643-1647 ;Traversah 等，1992 Immunogenetics, 35 (3) 145-152 ；以及美国专利No. 5，342，774，通过引用并入本文)。从那以后，血清学表达克隆技术(serological expression cloning technique, SEREX) (Sahin 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92 (25) 11810-11813(1995)和美国专利No. 5，698，396)、酵母表面重组抗原表达(recombinant antigen expression on yeast surface, RAYS) (Mischo 等，Cane. Immun.，3 :5-16(2003)) 以及差异性mRNA表达分析(Gure等，Int. J. Cane，85 (5) :726-732(2000))已使得更多的CT 抗原被鉴定出来。癌症患者体内一些CT抗原的免疫原性使其成为肿瘤疫苗开发的理想靶标。被免疫系统的细胞或体液效应子所识别的肿瘤相关抗原的鉴定已打开了癌症免疫治疗的新前景。免疫治疗的理念是基于这一推测，即肿瘤中表达的抗原蛋白能够在利用自体免疫系统的治疗方法中用作靶标。抗原特异性癌症免疫疗法(Antigen-Specific Cancer Immunotherapeutics, ASCI)允许进行靶向治疗。ASCI具有两个主要组分将免疫应答特异性靶向于癌细胞的“肿瘤抗原”，和包含选择用于提高抗肿瘤免疫应答的免疫刺激化合物的“佐剂系统”。CTAGlB。当前感兴趣的用于癌症免疫治疗的一种癌症睾丸抗原为由CTAGlB基因(别名为NY-ES0-1基因)编码的癌症/睾丸抗原1B。该抗原最初于上世纪九十年代末在Ludwig癌症研究院纽约分院通过SERE欧洲杯赔率赌场 从食管鳞状细胞癌中鉴定得到(Chen 等，PNAS USA, 94 (5) :1914-1918(1997)；和美国专利 No. 5，804，381，incorporated by reference)。CTAGlB蛋白的长度为180个氨基酸，已在多种肿瘤中被发现，这些肿瘤包括但不限于卵巢癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、膀胱癌以及黑色素瘤(Konishi J 等.Oncol Rep. 2004 May ； 11 (5) :1063-7 ；Nicholaou T等，Immunol Cell Biol. 2006 Jun ；84(3) :303-17 ；Sugita Y 等.Cancer Res.2004Mar 15 ；64(6) :2199-204 ；Velazquez EF 等.Cancer Immun. 2007 Jul 12 ；7 11 以及 Jungbluth 等.2001，Int.J. Cane,92(6) 856-860)。针对该抗原的自发体液和细胞免疫应答已在CTAGlB阳性肿瘤患者体内有所描述，并已鉴定出许多HLA (人类白细胞抗原)I类和II类限制肽(Jager等，1998 J. Exp. Med.，187 (2) :265-270 ；Yamaguchi 等，2004 Clin. Cane. Res.，10 (3) :890-961 ；以及 Davis 等，2004 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101 (29) 10697-10702)。专利文献的示例为美国专利 No. 6，140，050,6, 251，603,6, 242，052,6, 274，145,6, 338，947,6, 417，165,6, 525，177、 6，605，711,6, 689，742,6, 723，832,6, 756，044 和 6，800，730，所有文献均通过引用并入本文。在临床试验中，已将具有HLA-A2结合基序的三种部分重叠的CTAGlB衍生肽 (157-167、157-165和155-163)用于疫苗中，以治疗12个具有表达NY-ES0-1的转移性肿瘤的患者。该研究表明，合成的NY-ES0-1肽可安全给药并能够产生可能有益的T细胞应答 (Jager 等，2000 PNAS USA, 97 (22) 12198-12203)。该蛋白中的许多I类和II类MHC(主要组织相容性复合体)表位已被不同的研究小组鉴定得到。N端的胶原蛋白样区域中包含至少一个I类MHC表位，在本文中称为A31。 中间区域包含几个II类MHC表位，在本文中称为DRl、DR2、DR4、DR7和DP4。该区域还包含几个I类MHC表位，在本文中称为B35、B5UCw3和Cw6。C端被认为含有至少两个II类表位(DR4和DP4)和一个I类表位(A2)。GTAG2.由于其序列与CTAGl的高度相似性，可望用于免疫疗法的另一癌症睾丸抗原为CTAG2(别名为LAGE-I基因)。已经描述了两种CTAG2转录本LAGE-I a和LAGE-1 b。 LAGE-I b为不完全剪接，编码约210个氨基酸残基的假定蛋白，而LAGE-I a基因产物含有 180 个氨基酸残基(Sun 等.Cancer Immunol Immunother 2006 :55 :644-652)。LAGE-I和NY-ES0-1蛋白的N端区域高度保守，被认为具有超过97%的同一性。不过，LAGE-I在中心区域与NY-ES0-1有所不同，仅有62%的同一性。NY-ES0-1和LAGE-I a 的C端高度保守(超过97%的同一性)。不过，LAGE-I b的C端更长，被认为与LAGE-I a/ NY-ES0-1相同区域的同一性小于50%。关于这两个蛋白的一般信息可从LICR网站中找到(参见www. cancerimmunity. org/CTdatabase)。PRAME-偏好性表达的黑色素瘤抗原PRAME最初作为编码被黑色素瘤反应性细胞毒T细胞(CTL)识别的人黑色素瘤抗原的基因而分离。PRAME因其在一些正常成体组织 (包括子宫内膜和肾上腺)中的痕量表达水平而未被指定为CT基因。不过，PRAME确实表现出CT基因的其他主要特征，即在睾丸中的强表达和多种肿瘤中的上调，包括黑色素瘤 (97%)、肉瘤(80%)、小细胞肺癌(70%)、肾细胞癌(40%)和头颈癌(四％)。已观察到该基因编码相同蛋白的五种替代性剪接转录本变体。509个氨基酸的假定蛋白具有存在于 HLA A24和HLA-A2分子上的已充分表征的表位。MaReA3. MAGE基因属于癌症/睾丸抗原家族。MAGE基因家族包括超过20个成员， 由 MAGE A、B、C 禾Π D 基因组成(Scanlan 等，Q002) Immunol Rev. 188 :22-32 ；Chomez 等， (2001) Cancer Res. 61(14) :5544-51)。它们在 X 染色体上聚簇(Lucas 等.，1998 Cancer Res. 58. 743-752 ；Lucas 等.，1999 Cancer Res 59 :4100-4103 ；Lucas 等.，2000 Int JCancer 87 :55-60 ；Lurquin 等.，1997 Genomics 46 :397-408 ；Muscatelli 等.，1995Proc Natl Acad Sci USA 92 :4987-4991 ；PoId等.，1999 Genomics 59 :161-167 ；Rogner等1995 Genomics 29 :725-731)，功能尚未确定(Ohman 等 2001 Exp Ceu Res. 265(2) :185-94) MAGE基因高度同源，尤其是MAGE-A家族的成员具有60-98%的同源性。人MAGE-A3基因表达于多种类型的肿瘤中，包括黑色素瘤(Furuta等.2004 Cancer Sci. 95，962-968)、膀胱癌、肝细胞癌(Qiu 等.2006. Clinical Biochemistry 39，259-266)、胃癌(Honda 等.2004 British Journal of Cancer 90，838-843)、结肠直肠癌(Kim 等.2006 World Journal of Gastroenterology 12,5651-5657)和肺癌(NSCLC) (Scanlan 等 2002 Immunol Rev. 188 22-32 Jang等2001 Cancer Res. 61，21 :7959-7963)。未在任何正常成体组织中观察到其表达，仅有的例外是睾丸生殖细胞或胎盘(Haas等.1988 Am J Reprod Immunol Microbiol
18:47-51 ；Takahashi 等· 1995 Cancer Res55 :3478-382)。重要的是获得这样的定量高通量分析测定，其能够特异性鉴定可受益于免疫疗法的表达CTAG1B、CTAG2和/或PRAME的患者，为剂量目的而监测CTAG1B、CTAG2和/或PRAME 的表达，在临床试验中鉴定表达CTAG1B、CTAG2和/或PRAME的样品，或仅仅是对癌症早期阶段的患者进行鉴定。许多可用的诊断方法已被描述，其利用RNA提取和RT-PCR(例如 Odunsi 等·，Cancer Research 63,6076-6083, 2003 ;Sharma 等·，Cancer Immunity, Vol. 3,
19页，2003)。现有测定的最大缺点是它们需要分离RNA以评估CTAG1B、CTAG2和/或PRAME的表达。福尔马林固定石蜡包埋的(Formalin-Fixed，I^araffin-EmbeddecbFFPE)肿瘤组织是临床中心肿瘤组织保存的常用方法。福尔马林固定改变了组织中RNA分子的结构，引起交联和部分降解。部分降解导致产生100-300碱基对的更小RNA碎片。这些RNA结构的改变限制了从FFPE组织提取出的RNA在检测CTAG1B、CTAG2和/或PRAME表达水平上的应用。基因甲基化基因甲基化是基因表达的重要调节因子。尤其地，在特定基因启动子区CpG 二核苷对中发现的胞嘧啶残基的甲基化可通过基因表达的下调而导致多种病症。例如，肿瘤抑制因子基因的异常甲基化可导致这些基因的上调或下调，因而与许多癌症的存在和发生相关(Hoffmann等.2005Biochem Cell Biol 83:296-321)。异常基因甲基化模式常常是来源组织特有的。据此，特定基因甲基化状态的检测可具有预测和诊断用途，并能够用于疾病相对阶段的检测，还可用于预测对特定治疗类型的应答(Laird. 2003 Nat Rev Cancer 3 253-266)。CTAG1B、CTAG2和/或PRAME的甲基化状态已在癌症组织中进行了一定程度的研究。认为DNA甲基化是慢性髓细胞样白血病(chronic myeloid leukemia, CLM)中直接导致PRAME基因高表达的分子机制。对PRAME启动子、外显子1和外显子2的分析表明， PRAME具有三个CpG岛位于启动子内部的20Ibp岛，位于外显子1中的204bp岛，以及位于外显子2中的310bp岛，其中仅有外显子2中的CpG岛显示出表观遗传调节(Gomez-Roman 等.Leukemia Research 31 (2007) 1521-1528)。与涉及 DNA 甲基化的 DNA 截短 / 转染实验相结合，还显示出PRAME调节区中确定部分的甲基化模式的改变足以使其在通常不表达该基因的细胞中上调。LAGE-I 甲基化状态的改变也有研究(De Smet等.(1999)Molecular and CellularBiology :7327-7335)。由于LAGE-I与LAGE-2/NY-ES0-1的高度序列相似性，很难区分这两个基因启动子序列的甲基化状态。结果在凝胶上显现的甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR, MSP)(基于凝胶的MSP测定)广泛用于检测基因的表观遗传学沉默(Esteller M等.Cancer Res 2001 ；61 :3225-9)，但已开发了使用其他技术的定量检测方法(Laird Pff.，Nat Rev Cancer 2003 ；3 :253-66 ；Eads 等· Nucleic Acids Res 2000 ；28 :E32 ；Mikeska T 等 J Mol Diagn 2007)。许多基于荧光的技术可用于核酸扩增反应的实时定量监测。在US6，090，552和 EP 0912597中描述了一种这样的技术，其商品名为Amplifluor 。该方法还适用于核酸扩增反应的终点监测。Vlassenbroeck 等(Vlassenbroeck 等.，2008. Journal of Molec. Diagn.，V10, No. 4)描述了一种使用Amplifluor 技术的标准化定的实时MSP测定。本发明的一个目的是提供消除已有测定的缺点的改进测定。

发明内容
本发明涉及测定表达的改进方法和/或测定。本发明还涉及对通过使用本文所述寡核苷酸、引物、探针、引物对、试剂盒和/或方法鉴定为表达07^让、07^2、？1^1^和/或 MageA3的患者进行某些类型的治疗，特别是基于抗原特异性癌症免疫疗法(ASCI)的治疗。 CTAG1B、CTAG2、PRAME 和 / 或 MageA3 的(蛋白)表达是通过测定 CTAG1B、CTAG2、PRAME 和 /或MageA3基因的甲基化状态来确定的，而不是测定基因本身的表达水平。本发明表明，就 NSCLC、黑色素瘤和乳腺癌样品中的CTAG1B、CTAG2和/或PRAME表达而言，其甲基化测试的甲基化状态结果与用PT-PCR试验所得结果非常一致。对于难以进行qRT-PCR的样品(例如对非小细胞肺癌的细针穿刺活检)而言，通过测定MageA3基因甲基化状态检测到的蛋白表达提供了有价值的替代方法。该测定因此对选择(适合于)治疗的患者、预测患者治疗成功的可能性很有用，并可用于辅助患者疗法选择。一方面，本发明提供了寡核苷酸、引物或探针，其包含SEQ ID N0. 1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、61、62或63中任一项的核苷酸序列，或基本由其组成， 或由其组成，所述寡核苷酸、引物或探针可用于检测基因的甲基化状态。优选地，所述寡核苷酸、引物或探针以5'至3'的顺序包含以下相邻的序列，或基本由其组成，或由其组成(a)约6至30个核苷酸的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列中的核苷酸用第一部分进行标记，所述第一部分选自分子能量转移对中的供体部分和受体部分，其中所述供体部分在被激发时在一个或多个特定波长下发射荧光，所述受体部分吸收和/或猝灭所述供体部分所发射的荧光；(b)单链的第二核苷酸序列，其包含约3至20个核苷酸，或基本由其组成，或由其组成；(c)第三核苷酸序列，其包含约6至30个核苷酸，或基本由其组成，或由其组成， 其中所述第三核苷酸序列中的核苷酸用第二部分进行标记，所述第二部分选自所述供体部分和所述受体部分，且所述第二部分为所述组中未标记所述第一核苷酸序列的所述基团成员，其中所述第三核苷酸序列与所述第一核苷酸序列为反向互补，使得所述第一核苷酸序列与所述第三核苷酸序列之间可形成双联体而使所述第一部分与第二部分接近，从而当供体部分处于激发状态且发射荧光时，受体部分吸收并猝灭所述供体部分发射的所述荧光； 和(d)在引物的3'末端的单链的第四核苷酸序列，其包含约8至40个核苷酸，或基本由其组成，或由其组成，所述核苷酸在其3'末端包含SEQ ID N0.2、4、6、8、10、12、14、16、 18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、62 和 63 中任何一个核苷酸序列。其中在不形成所述双链体时，所述第一部分和所述第二部分分隔开一定距离，阻止了所述第一和第二部分之间的分子能量转移。 3 ‘末端的特定核苷酸序列允许检测CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的甲基化状态。用适当试剂(如下所述)处理后，这些引物偏好性地与CTAG1B、CTAG2、PRAME 和/或MageA3基因的未甲基化形式相结合。本文讨论了这些寡核苷酸的特性，该讨论适于进行必要的修改。该特定核苷酸序列能够引发由核酸聚合酶合成核苷酸序列，所述核苷酸序列与包含CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3家族基因的甲基化或未甲基化DNA部分的核酸链互补。最优选地，该寡核苷酸、引物或探针由SEQ ID NO. 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、 21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或61的核苷酸序列组成，并用于扩增目的基因的一部分。还提供了引物对，其包括这样的引物，所述引物包含SEQ ID NO. 1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、61、62或63的核苷酸序列，或基本由其组成，或由其组成。本领域技术人员易于根据指导扩增相关基因适当部分的有义和反义引物来确定适用的引物对(如下所述)。本发明引物对的实例阐述于表1。权利要求6中也列举了适用的引物对。另一方面，提供了试剂盒，其包含至少一种引物、引物对或引物组，所述单引物、引物对或引物组包含 SEQ ID NO. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、61、62 或
63中任一核苷酸序列，或基本由其组成，或由其组成。所述试剂盒用于检测基因的甲基化状态，特别是如CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3的基因。另一方面，本发明提供了一种检测含DNA的样品中CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或 MageA3基因甲基化状态的方法，其包括(a)用选择性修饰DNA中未甲基化胞嘧啶残基以产生可检测的修饰残基但不修饰甲基化胞嘧啶残基的试剂接触/处理含DNA的样品；(b)用至少一个引物对扩增所述甲基化或未甲基化目的基因的至少一部分，所述引物对中至少一个引物被设计成仅分别与该试剂处理后的甲基化或未甲基化DNA序列结合，其中所述引物对中至少一个引物包含SEQ ID NO. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、44、61、62或63中任一核苷酸序列(适当时)，或基本由其组成，或由其组成。
另一方面，本发明提供了一种诊断癌症或癌症患病素因(predisposition)的方法，包括利用本文所述寡核苷酸、引物或探针、引物对、试剂盒或方法检测样品中CTAG1B、 CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的甲基化状态，其中样品中未甲基化CTAGIB、CTAG2、PRAME 和/或MageA3的存在指示了癌症或癌症素因。另一方面，本发明提供了一种检测CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3阳性肿瘤的存在情况的方法，包括利用本文所述寡核苷酸、引物或探针、引物对、试剂盒或方法检测样品中CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的甲基化状态，其中样品中未甲基化 CTAG1B、CTAG2、PRAME 和 / 或 MageA3 的存在表示存在 CTAG1B、CTAG2、PRAME 和 / 或 MageA3 阳性肿瘤。“CTAG1B、CTAG2、PRAME 和 / 或 MageA3 阳性肿瘤”意为表达 CTAGIB、CTAG2、PRAME 和/或MageA3抗原的任何肿瘤或肿瘤细胞(从患者体内分离的)。本发明还提供了一种鉴定和/或选择适于用CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3 免疫疗法进行治疗的患者的方法，包括利用本文所述寡核苷酸、引物或探针、引物对、试剂盒或方法检测患者样品中CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的甲基化状态，其中如果CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因是未甲基化的，则该患者(优选地)鉴定和/ 或选择为以CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3免疫疗法进行治疗。因此，具有未甲基化 CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3的患者比体内这些基因为甲基化状态的那些患者更合适。或者，如果所述基因不是未甲基化状态，则该患者优选地鉴定和/或选择为不以 CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3免疫疗法进行治疗。一个相关方面中，本发明提供了预测成功治疗癌症的可能性的方法，包括利用本文所述寡核苷酸、引物或探针、引物对、试剂盒或方法检测患者样品中CTAG1B、CTAG2、PRAME 和/或MageA3基因的甲基化状态，其中如果所述基因是未甲基化的，则以CTAG1B、CTAG2、 PRAME和/或MageA3免疫疗法成功治疗的可能性高于基因甲基化的情况。或者，样品中不存在未甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3表示对CTAG1B、 CTAG2、PRAME和/或MageA3免疫疗法治疗有抗性的可能性高于基因未甲基化的情况。因此，检测到甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因表示以免疫疗法进行成功治疗的可能性低。另一个相关方面中，本发明提供了选择适用的癌症治疗方案的方法，包括利用本文所述寡核苷酸、引物或探针、引物对、试剂盒或方法检测患者样品中CTAG1B、CTAG2、PRAME 和/或MageA3基因的甲基化状态，其中如果所述基因是未甲基化的，则选择免疫疗法进行治疗。或者，如果所述基因不是未甲基化状态，则禁用免疫疗法。本发明还提供了治疗受试者的癌症的方法，包括施用免疫疗法，其中所述受试者已根据本发明任一方法或利用本文所述寡核苷酸、引物或探针、引物对、试剂盒或方法，基于CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因甲基化状态测定而进行选择。优选地，对本文所述所有不同的方面而言，检测到未甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME 和/或MageA3基因相当于CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3蛋白水平的提高。本发明还提供一种治疗患者的方法，其包括根据本发明任一方法和/或利用本文所述寡核苷酸、引物或探针、引物对、试剂盒或方法测定CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的甲基化状态，然后向该患者施用本文所述包含CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或 MageA3的组合物。所述组合物优选在发现CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因未甲基化的情况下施用。另一方面，本发明提供了一种治疗易于复发表达CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或 MageA3之肿瘤的患者的方法，所述患者已通过治疗除去肿瘤组织，所述方法包括根据本发明任一方法和/或利用本文所述寡核苷酸、引物或探针、引物对、试剂盒或方法测定肿瘤组织中CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的甲基化状态，然后向该患者施用本文所述包含CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3的组合物。所述组合物优选在发现CTAG1B、 CTAG2、PRAME和/或MageA3基因未甲基化的情况下施用。本发明还提供了包含CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3的组合物在制备用于治疗肿瘤患者的药物中的用途，其中所述患者已根据本发明任一方法或利用本文所述寡核苷酸、引物或探针、引物对、试剂盒或方法，基于CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因甲基化状态的测定而被选择用于治疗。还提供了用于肿瘤患者治疗的包含CTAG1B、CTAG2、 PRAME和/或MageA3的组合物，其中所述患者已根据本发明任一方法或利用本文所述寡核苷酸、引物或探针、引物对、试剂盒或方法，基于CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因甲基化状态的测定而被选择用于治疗。在另一实施方案中，提供了包含CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗易于复发表达CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3 之肿瘤的患者，其中所述患者已根据本发明任一方法或利用本文所述寡核苷酸、引物或探针、引物对、试剂盒或方法，基于CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因甲基化状态的测定而被选择用于治疗。还提供了包含CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3的组合物，其用于治疗易于复发表达CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3之肿瘤的患者，其中所述患者已根据本发明任一方法或利用本文所述寡核苷酸、引物或探针、引物对、试剂盒或方法，基于 CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因甲基化状态的测定而被选择用于治疗。发明详述本发明提供了用于检测含DNA样品中甲基化或未甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME和 /或MageA3基因的存在情况和/或其量的测定。为开发该测定，必须鉴定CTAG1B、CTAG2、 PRAME和/或MageA3基因中易于甲基化的区域，并开发出可区分CTAG1B、CTAG2、PRAME和 /或MageA3基因的未甲基化和甲基化形式的特定寡核苷酸。据此，本发明的一个方面提供了寡核苷酸、引物或探针，其包含SEQ ID NO. 1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、61、62 或 63 中任一核苷酸序列，或基本由其组成，或由其组成。这些寡核苷酸可用于检测目的基因的甲基化状态。所述寡核苷酸可用作引物和/或探针。在某些实施方案中，所述寡核苷酸检测基因的未甲基化形式。在某些实施方案中，这些寡核苷酸包含如本文所述的发夹结构，由SEQ ID NO. 43代表。此类优选的寡核苷酸包含 SEQ ID NO ;1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，四，31，33，35，37， 39，41或61的核苷酸序列，或基本由其组成，或由其组成，用于检测基因的未甲基化形式。本发明中“基因”或“目的基因”优选地为CTAGlB和/或CTAG2和/或PRAME和/ 或 MageA3。
“CTAG1B”是经HUGO基因命名委员会批准的基因符号。该基因位于X染色体上；(位置Xq28)该基因序列在登记号U87459和匪001327下列出。系统基因ID为 ENSG00000184033。该基因编码癌症/睾丸抗原IB[人]。CTAGlB经常可互换地称为 “CTAGlB” 或“CTAG” 或 “CTAG1” 或 “NY-ES0-1” 或 “ES01” 或 “LAGE-2” 或 “LAGE2B”，均在本文中使用。该基因的低甲基化可与癌症的发病相关联，比如黑色素瘤、肺癌(包括NSCLC)、 前列腺癌或卵巢癌。“CTAG2”是经HUGO基因命名委员会批准的基因符号。该基因位于X染色体上； (位置Xq28)该基因序列在登记号A.T012833下列出。系统基因ID为ENSG00000126890。 该基因编码癌症/睾丸抗原2 [人]。CTAG2经常可互换地称为“CTAG2”或“CAMEL”或 “ES02” LAGE-I或“LAGE-沘”或“MGC3803”或“MGC1387M”，均在本文中使用。该基因的低甲基化可与癌症的发病相关联，比如黑色素瘤、肺癌(包括NSCLC)、膀胱癌、前列腺癌、头颈癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食管癌或肝细胞癌。“PRAME”是经HUGO基因命名委员会批准的基因符号。该基因位于第22号染色体上；(位置22qll.22)该基因序列在序列号U65011和匪206953下列出。系统基因ID为 ENSG00000185686。该基因编码黑色素瘤中的抗原[人]。PRAME经常可互换地称为“MAPE” 或“0IP4”，均在本文中使用。该基因的低甲基化可与癌症的发病相关联，比如宫颈癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌或头颈鳞状细胞癌。MAGEA3和MAGEA6是经HUGO基因命名委员会批准的基因符号。MAGE-A3基因位于X染色体上(位置:q28)，其基因序列在序列号NM 005362和ENSG00000197172下列出。MAGE-A3基因编码黑色素瘤抗原家族A，3。MAGEA6基因位于X染色体上(位置q28)。 MAGE-A3经常可互换地称为MAGE-3或MAGEA3。同样地，MAGE-A6经常可互换地称为MAGE-6 或MAGEA6 ；均在本文中使用。这两个基因的低甲基化可与癌症的发病相关联，比如黑色素瘤或肺癌(包括NSCLC)。易于被甲基化的CpG 二核苷酸通常集中在人类基因的启动子和/或外显子和/或内含子区域。在某些实施方案中，通过测定基因启动子、内含子、外显子1和/或外显子2区域的甲基化水平来评估该基因的甲基化状态。“启动子”是转录起始位点(transcription start site, TSS)上游的区域，距离 TSS 约 IOKb、4Kb、3Kb、1Kb、500bp 或 150_300bp。当启动子区中CpG的分布相当稀少时，可在内含子和/或外显子区域进行甲基化水平评估。用于评估的区域可以是同时包含内含子和外显子序列的区域，并因此重叠覆盖两个区域。术语“甲基化情形”或“甲基化状态”意为DNA序列中一个或多个CpG 二核苷酸处 5-甲基胞嘧啶(“5-mCyt”)的存在与否。“超甲基化”定义为甲基化水平超出正常水平。因此，它涉及基因中特定CpG位点上胞嘧啶(5-mCyt)的异常甲基化，常发生在启动子区。甲基化的正常水平可通过例如测定非癌细胞中的甲基化水平来定义。“低甲基化”意为与(适当对照样品中的)“正常”DNA序列中相应CpG 二核苷酸处的5-mCyt量相比，(测试DNA样品的)DNA序列中一个或多个CpG 二核苷酸处5_mCyt存在量降低。此外，“正常”甲基化水平可通过测定例如非癌细胞中的甲基化水平来定义。本发明中，CTAG1B、CTAG2和/或PRAME基因(或某些方面中的MageA3)的低甲基化指示该肿瘤相关抗原基因的表达升高，提供了可靠的癌症指标。本发明在另一个方面提供了检测含DNA的样品中甲基化或未甲基化基因的存在情况和/或其量的方法，包括将至少一种寡核苷酸与所述含DNA的样品相接触的步骤，其中所述寡核苷酸包含 SEQ ID NO. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、61、62 或
63中任一核苷酸序列，或基本由其组成，或由其组成。该方法优选地还包含评估基因是甲基化还是未甲基化的步骤。这可取决于所述寡核苷酸是否与本文所述含DNA样品中的DNA稳定地结合。用于甲基化状态评估的技术基于不同的方法。可采用适用于本发明寡核苷酸的任何合适的技术。在一个实施方案中，用于检测甲基化CpG 二核苷酸基序的方法利用了可选择性修饰DNA中未甲基化胞嘧啶残基以产生可检测的修饰残基的试剂。该试剂不修饰甲基化的胞嘧啶残基，因此允许在下游过程(优选可包括核酸扩增)中区分未甲基化和甲基化的核酸分子。在一个实施方案中，该试剂可作用于选择性地使未甲基化胞嘧残基脱氨。因此，在暴露于该试剂后，未甲基化DNA含有与相应甲基化DNA不同的核苷酸序列。胞嘧啶的脱氨导致尿嘧啶残基的存在，其与胸腺嘧啶具有相同的碱基配对特性，因而与胞嘧啶碱基配对行为不同。这使得区分甲基化与非甲基化胞嘧啶成为可能。评估序列差异的有用常规技术使用寡核苷酸引物。两种引物设计方法是可行的。 第一种，引物可以设计成不涵盖任何DNA甲基化潜在位点。差异性甲基化位点的序列改变位于两个引物的结合位点之间，序列改变的识别需要其他测定步骤。第二种，引物可以设计成与原始处理序列的甲基化或未甲基化形式特异性杂交。杂交后可进行扩增反应，并用本领域熟知的任意检测系统分析扩增产物。扩增产物的存在表明引物与DNA发生了杂交。引物的特异性指示了 DNA是否被修饰，这进而指示了 DNA是否被甲基化。如果与靶标序列有足够的互补区域，如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个核苷酸，则引物也可以包含不干扰杂交但可用于其他操作的额外核苷酸残基。此类其他残基的例子可以是用于限制性内切酶切割、用于配体结合或因子结合的位点或接头或重复序列，或是用于观察目的的残基。寡核苷酸引物可以对修饰的甲基化残基有或没有特异性。用作引物的优选寡核苷酸包含 SEQ ID NO. 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41 或61 中任一核苷酸序列，或基本由其组成，或由其组成。区分修饰和未修饰核酸的另一个常用互补方法是使用寡核苷酸探针。此类探针可直接与修饰的核酸杂交或与修饰核酸的进一步产物(例如扩增所得产物)杂交。基于探针的测定利用了与特定序列的寡核苷酸杂交以及其后的杂交体检测。在检测扩增产物之前还可有进一步的纯化步骤，例如沉淀步骤。寡核苷酸探针可以用本领域已知的任意检测系统标记。这些检测系统包括但不限于荧光部分、放射性同位素标记部分、生物发光部分、发光部分、化学发光部分、酶、底物、受体或配体。用作探针的寡核苷酸可包含SEQ ID NO. 1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、61、62 或 63 中任一核苷酸序列，或基本由其组成，或由其组成。优选的核苷酸探针优选地主要包含选自于SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、 14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44 和 61 的核苷酸序列，或基本由其组成，或由其组成。“寡核苷酸引物”在本文中可互换地称为“引物”。同样地，“寡核苷酸探针”在本文中可互换地称为“探针”。
在一些优选的实施方案中，使用甲基化特异性PCR(MSP)检测基因(或其一部分， 尤其是CpG岛)的甲基化状态。本领域技术人员熟悉MSP技术。MSP方法中，可用引物对扩增DNA，所述引物对设计成利用由于亚硫酸氢钠处理而产生的序列差异来区分未甲基化与甲基化的DNAOferman JG 等.Proc Natl Acad Sci U S A. 1996Sep 3 ；93 (18) :9821-6 和 WO 97/46705)。MSP 技术的一个具体实例称为实时定量MSP (QMSP)，其允许进行实时的甲基化DNA定量。实时方法通常基于对扩增程序的持续光学监测，并利用荧光标记试剂，其在产品中的掺入可被定量，并且其量指示了模板中序列的拷贝数。此类标记试剂可为与双链DNA偏好性结合的荧光染料，通过与双链DNA结合其荧光可大大增强。或者，可使用标记的引物和/或标记的探针。它们代表了众所周知并市售的实时扩增技术的一种特
殊应用，如 TAQMAN 、molecular BEACONS 、 AMPLIFLUOR 和
SCORPION DzyNA 等。这些实时方法经常用于聚合酶链式反应(pcr)。TaqMan技术使用含有荧光染料和猝灭染料的线性水解寡核苷酸探针。被照射时， 受到激发的荧光染料将能量转移至邻近的猝灭染料分子上，而不是发荧光(FRET原理)。 TaqMan探针退火到PCR产物内部区域上，并在其复制模板时被聚合酶的外切核酸酶活性切除。这使得猝灭剂活性丧失，报告染料开始发射荧光，其强度在每个循环中与探针切割速率成正比增长。分子信标也包括荧光和猝灭染料，但它们被设计为采取发夹结构，当在溶液中为游离状态时使得两种染料接近以发生荧光共振能量转移(FRET)。当信标在退火步骤中与靶标杂交时，发夹结构被线性化，两种染料(供体和受体/猝灭剂)分离。检测到的来自于供体的荧光增强将与可用的PCR产物量相关联。scorpion探针利用单个核苷酸完成序列特异性引发和PCR产物的检测。scorpion 探针在未杂交状态下保持茎-环构型，荧光团与猝灭剂之间发生FRET。所述茎的3’部分还包含与引物延伸产物互补的序列。该序列与特异性引物的5’端通过不可扩增单体相连。 korpion引物延伸后，特异性探针序列能够在延伸的扩增子内与其互补区结合，从而打开发夹环，使荧光团与猝灭剂分离，提供荧光信号。在重甲基法(Heavymethyl)中，引发是甲基化特异性的，但这种特异性由不可延伸的寡核苷酸阻断剂提供，而不是由引物自身提供。阻断剂与亚硫酸氢盐处理的DNA以甲基化特异性方式结合，其结合位点覆盖引物结合位点。当阻断剂结合时，引物就不能结合， 因此不能产生扩增产物。重甲基法可与实时检测组合使用。Plexor qPCR与qRT_PCR系统利用两个修饰核苷酸之间的特异性相互作用来完成定量PCR分析。PCR引物之一在其5’端邻近iso-dC残基处含有荧光标记。另一PCR引物未标记。反应混合物包括脱氧核苷酸和以猝灭剂dabcyl修饰的iso-dGTP。dabcyl-iso-dGTP 偏好性地掺入与iso-dC残基互补的位点上。dabcyl-iso-dGTP在该位点的掺入导致互补链上荧光染料的猝灭和荧光强度降低，这允许在扩增过程中进行定量。对这些多重反应而言， 对每个靶标序列使用带有不同荧光团的引物对。因此，包含 SEQ ID N0. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、61、62或63中任一核苷酸序列或基本由其组成或由其组成的寡核苷酸可在上述用于目的基因甲基化检测的方法中作为引物或探针。在一个优选的实施方案中，本发明提供了检测含DNA的样品中甲基化或未甲基化目的基因的存在情况和/或其量的实时方法，包括(a)用选择性修饰DNA中未甲基化胞嘧啶残基以产生可检测的修饰残基但不修饰甲基化胞嘧啶残基的试剂接触/处理所述含DNA的样品。(b)用至少一个引物对扩增所述甲基化或未甲基化目的基因的至少一部分，所述引物对中至少一种引物被设计成仅分别与该试剂处理后的甲基化或未甲基化DNA序列结合，其中所述引物对中至少一种引物包含SEQ ID NO. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、44、61、62或63中任一核苷酸序列，或基本由其组成，或由其组成。本发明方法中的目的基因优选地为CTAGlB、CTAG2、MageA3和/或PRAME基因。优选地，所述引物对中至少一种引物为含有茎环结构的引物，所述茎环结构带有分子能量转移对的供体和受体部分，其排列成使得在未扩增时受体部分使供体部分(激发状态)发射的荧光猝灭，而扩增过程中茎环结构被破坏，使得供体与受体部分分开足够距离以产生可检测的荧光信号。可对此进行实时检测，以提供甲基化或未甲基化目的基因存在与否的指示。引物对中包含 SEQ ID NO. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、61、62 或 63中任一核苷酸序列或基本由其组成或由其组成的引物优选地携带所述茎环结构。在某些实施方案中，测定了甲基化或未甲基化基因的拷贝数。这时，本文所述方法优选地还包含以下步骤(c)利用标准曲线定量甲基化或未甲基化目的基因的实时检测结果，以产生基因拷贝数输出。优选地，步骤(c)的特征还在于在循环数阈值小于或等于40认为扩增是有效的。对诸如CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME的基因而言，对其基因未甲基化形式的检测可能最为相关。本发明的方法允许在样品中实时检测甲基化或未甲基化的目的基因的存在情况。 由于本发明方法为定量方法，因此目的基因甲基化或未甲基化形式的(相对)量也可以在反应进程中测定。但是，不一定需要使用实时方法。可以仅进行分析以确定样品中是否存在靶标 DNA。终点扩增检测技术利用了广泛应用于实时PCR的相同方法。因此，本发明的方法可包含检测含DNA样品中甲基化或未甲基化目的基因存在情况和/或其量的终点法。因此，本发明提供了检测含DNA的样品中甲基化或未甲基化目的基因的存在情况和/或其量的(终点)方法，包括(a)用选择性修饰DNA中未甲基化胞嘧啶残基以产生可检测的修饰残基但不修饰甲基化胞嘧啶残基的试剂接触/处理所述含DNA的样品。(b)用至少一个引物对扩增所述甲基化或未甲基化目的基因的至少一部分，所述引物对中至少一种引物被设计成仅分别与该试剂处理后的甲基化或未甲基化DNA序列结合，其中所述引物对中至少一种引物包含SEQ ID NO. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、44、61、62或63中任一核苷酸序列，或基本由其组成，或由其组成。如上所述，本发明方法中的目的基因优选地为CTAGlB、CTAG2、MageA3和/或PRAME 基因。优选地，所述引物对中至少一种引物为含有茎环结构的引物，其中所述茎环结构带有具有本文所述特征的分子能量转移对的供体和受体部分。该引物对中包含SEQ ID NO. 1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、61、62 或 63 中任一核苷酸序列或基本由其组成或由其组成的引物优选地携带所述茎环结构。对诸如CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME的基因而言，对其基因未甲基化形式的检测可能最为相关。设计了包含 SEQ ID NO. 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、 四、31、33、35、37、39、41或61中任一核苷酸序列或基本由其组成或由其组成的引物，用于检测该试剂处理后未甲基化的CTAG1B、CTAG2和/或PRAME DNA。不存在未甲基化基因指示了甲基化基因的存在。在想要得到甲基化或未甲基化基因拷贝数的情况下，该方法还包含以下步骤(c)利用标准曲线定量甲基化或未甲基化目的基因的实时检测结果，以产生基因拷贝数输出。本发明的所有实施方案均在加以必要修改后适用于本发明的终点法方面。终点法分析可能需要使用荧光平板读数器或其他适用仪器在扩增结束时确定荧光强度。本发明方法最优选地为对任何合适(含DNA的)测试样品进行的体内或体外方法。然而，在一个实施方案中，该方法还可包括获得样品的步骤。所述测试样品为含DNA的样品，尤其是包括目的基因的含DNA样品。本发明方法可用于疾病的诊断，尤其是目的基因甲基化(已知)与疾病发生相关时。含DNA的样品可包括任何合适的组织样品或体液。优选地，测试样品采集自人受试者。就癌症方面的应用而言，样品可包括从疑似为癌症的组织或从代表性体液中获得的组织样品。CTAGlB、CTAG2、MageA3和/或PRAME基因的低甲基化已与肺癌相关联，因此本发明可应用于肺癌。因此，一个实施方案中，本发明方法中所用涉及CTAGlB、CTAG2、MageA3和/ 或PRAME基因的测试样品优选地含有肺细胞或来自于肺细胞的核酸(分子)。最优选地，样品为福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织。有两种类型的肺癌非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)。名称仅描述了肿瘤中发现的细胞类型。测试样品优选地含有来自于非小细胞肺癌(NSCLC)的细胞或核酸。NSCLC包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌，占肺癌的约80%。在一个优选的实施方案中， 所述癌症为NSCLC，所述样品为肺组织样品或痰样品或血清样品。NSCLC难以治愈，可用的治疗通常以尽可能地延长生命并缓解疾病症状为目标。NSCLC是最常见的肺癌类型，并与不良预后相关。CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME基因的低甲基化还与黑色素瘤相关，因此本发明可应用于黑色素瘤。黑色素瘤是色素沉着的易于接触的病变，已在组织病理学术语中得到很好的定义。径向生长期(radial growth phase,RGP)早期的黑色素瘤可侵入表皮和乳头真皮层，但不具有转移能力；此阶段的切除几乎完全是治愈性的。随后的纵向生长期(vertical growth phase,VGP)意味着转变成能够转移的更具侵袭性的阶段。因此发生在 RGP/VGP转变期的基因表达变化有重要意义。因此，在另一实施方案中，本发明方法中所用的其他测试样品包含黑色素瘤细胞或来自黑色素瘤细胞的核酸。优选地，测试样品来自皮肤病变。CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME基因的低甲基化还与乳腺癌相关，因此本发明可应用于乳腺癌。乳腺癌主要分为两类非侵袭性癌症和侵袭性癌症。非侵袭性癌症包括原位小叶癌和原位导管癌。遗憾的是，乳腺癌常生长穿过基底膜，全部乳腺癌中约95%为浸润性或侵袭性癌症。侵袭性乳腺癌的最常见类型(约75%)为侵袭性导管癌，出现于输乳管中并通过管壁传播。侵袭性小叶癌起源于乳腺，占侵袭性乳腺癌的10-15%。较不常见的侵袭性乳腺癌类型包括如下癌症炎性乳腺癌、乳头I^aget氏病、髓样癌、粘液癌、叶状肿瘤和小管癌。很少地(约)，乳腺中发生肉瘤(结缔组织癌症)。个体可发生侵袭性和非侵袭性乳腺癌中的一种、另一种或其组合。因此，另一实施方案中，本发明方法中所用的另一优选的测试样品包含乳腺细胞或来自于乳腺细胞的核酸分子。最优选地，测试样品来自于乳腺组织。其他用于本发明方法的含DNA样品包括用于诊断、预后或个性化医疗应用的样品。这些样品可得自例如外科手术样品(如活检或细针穿刺)、石蜡包埋组织、冷冻肿瘤组织样品、新鲜肿瘤组织样品或是新鲜或冷冻的体液。非限定性实例包括全血、骨髓、脑脊液、 腹水、胸水、淋巴液、血清、血浆、尿液、乳糜、粪便、精液、痰、乳头分泌物、唾液、棉签取样、结肠清洗样品和刷取样。组织和体液可用任何适用方法收集，许多此类方法为本领域众所周知。石蜡包埋样品可直接进行评估或对其组织切片进行评估。术语“样品”、“患者样品”和“患者的样品”可相互替换使用，意为来自于患者的含 DNA样品，如上所述。本发明方法可在含纯化或未纯化DNA的样品中进行。不过，在一个优选的实施方案中，在(a)步骤(试剂处理步骤)操作之前，或作为预先步骤，从含DNA样品中分离/提取/纯化出DNA。可使用任何适用的DNA分离技术。纯化技术的实例可在标准教材如《分子克隆——实验室操作手册(第三版)》(Sambrook和Russell，特别参考其附录8及第5 章)。在一个优选实施方案中，纯化涉及DNA的醇沉淀。优选的醇包括乙醇和异丙醇。合适的纯化技术还包括盐沉淀法。因此，在一个具体实施方案中，DNA纯化技术包括使用高浓度盐来沉淀污染物。例如，所述盐可包含乙酸钾和/或乙酸铵，或基本由其组成，或由其组成。 该方法可进一步包括除去已沉淀的污染物的步骤，然后通过醇沉淀回收DNA。在另一实施方案中，DNA纯化技术是基于使用有机溶剂从细胞裂解物中提取出污染物。因此，在一个实施方案中，该方法包括使用酚、氯仿和异戊醇提取提取DNA。采用合适的条件以确保污染物被分离至有机相而DNA保留在水相中。此外，试剂盒利用磁珠、硅膜等。此类试剂盒为本领域所熟知并作为商品提供。本发明方法可利用PUREGENE DNA纯化试剂盒。在这些纯化技术的一些优选实施方案中，通过醇沉淀来回收所提取的DNA，比如乙
醇或异丙醇沉淀。福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的肿瘤组织是临床中心保存肿瘤组织的常用方法。此类FFPE包埋样品在DNA提取之前需要脱蜡处理步骤。在一个优选的实施方案中，固定在玻片上的FFPE组织样品或样品材料首先通过二甲苯处理来脱蜡。与二甲苯的接触时间必须足以使二甲苯与样品接触并相互作用。在一个更优选的实施方案中，将FFPE样品在 100%二甲苯中脱蜡2小时。此步骤可再重复一次以确保完全脱蜡。二甲苯处理后，用70% 乙醇使样品再水化。本发明方法适当时还可包括(也是在(a)步骤之前或是作为预处理步骤)对从样品中分离/提取/纯化的DNA进行定量。样品中DNA的定量可能任何合适的手段完成。例如，核酸的定量可基于分光光度计、荧光计或UV透射仪的使用。适用技术的实例描述于标准教材，如《分子克隆——实验室操作手册(第三版)》(Sambr00k和Russell，特别参考其附录8)。在一个优选的实施方案中，可使用试剂盒(如可购自Molecular ProbesJnvitrogen 的Picogreen dsDNA定量试剂盒)定量DNA。本发明方法可依赖于选择性修饰DNA中未甲基化胞嘧啶残基以产生可检测的修饰残基的试剂。所述试剂的作用原理已有阐述。在一个优选的实施方案中，所述选择性修饰DNA中未甲基化胞嘧啶残基以产生可检测的修饰残基而不修饰甲基化胞嘧啶残基的试剂包含亚硫酸氢盐试剂或基本由其组成或由其组成(Frommer等.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 199289 1827-1831)。若干含有亚硫酸氢盐的试剂为本领域公知，适于进行脱氨基反应的试剂盒是市售的(如来自Zymo Research的EZ DNA甲基化试剂盒)。一种特别优选用于本发明方法的试剂包含亚硫酸氢钠或基本由其组成或由其组成。样品中的DNA经试剂处理后，就必须检测由该试剂引起的核苷酸序列差异。这一检测利用核酸扩增技术完成。如前所述，与功能相关的甲基化最常与启动子区有关。特别地，所谓“CpG岛”包括相对高的CpG残基比率，并且常常存在于基因的转录起始位点附加。 对一些基因例如MAGE-3而言，CpG在启动子区的分布非常罕见。这种情况下，可以适当地评估基因内含子和外显子区域的甲基化情况。存在多种软件程序可允许鉴定目的基因中 CpG岛。据此，本发明方法可涉及用至少一个引物对扩增甲基化或未甲基化目的基因的至少一部分。如上所述，由于需要研究其甲基化状态的目的残基通常发现于目的基因中确定的 CpG岛和/或启动子区域和/或内含子区域和/或外显子区域，所以引物对通常仅扩增基因(在此区域中)的一部分，而非整体。只要扩增产物为可检测的目的基因存在性的可靠指示物，则基因的任何合适部分都可根据本发明方法进行扩增。特别易于检测的扩增产物为约50至250bp之间。更优选地，使用至少一个引物对进行的甲基化或未甲基化目的基因的扩增产生约100-200bp或50-100bp的扩增产物。这对组织样品特别重要，尤其是通常只能获得有限DNA质量且只能期望较小扩增子的石蜡包埋样品。在一个优选的实施分案中， 可检测扩增产物至少包含 SEQ ID NO. 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、洸、28、30、32、 34、36、38、40、42、44、62 和 63 中任一核苷酸序列。优选地产生(约)50bp、51bp、52bp、53bp、 54bp、55bp、56bp、57bp、58bp、59bp、60bp、61bp、62bp、63bp、64bp、65bp、66bp、67bp、68bp、 69bp>70bp>71bp>72bp>73bp>74bp>75bp>76bp>77bp>78bp>79bp>80bp>81bp>82bp>83bp> 84bp>85bp>86bp>87bp>88bp>89bp>90bp>91bp>92bp>93bp>94bp>95bp>96bp>97bp>98bp> 99bp、lOObp、lOlbp、102bp、103bp、104bp、105bp、106bp、107bp、108bp、109bp、llObp、lllbp、 112bp、113bp、114bp、115bp、116bp、117bp、118bp、119bp、120bp、121bp、122bp、123bp、 124bp、125bp、126bp、127bp、128bp、129bp、130bp、131bp、132bp、133bp、134bp、135bp、 136bp、137bp、138bp、139bp、140bp、141bp、142bp、143bp、144bp、145bp、146bp、147bp、148bpU49bp或150bp的扩增产物。引物对中至少一种引物(优选地为两种)引物被设计成仅与试剂处理后的甲基化或未甲基化DNA序列结合。因此，引物可通过仅与甲基化形式基因(试剂处理后保持未修饰状态)或仅与非甲基化形式基因(被试剂修饰)碱基配对来区分甲基化和未甲基化基因， 这取决于该方法的应用。因此，引物必须覆盖目的基因中至少一个甲基化位点。优选地，引物与基因中包含至少1、2、3、4、5、6、7或8个甲基化位点的区域结合。最优选地，该引物被设计成与这样的序列结合，所述序列的引物结合位点中CpG对的所有胞嘧啶残基为甲基化或未甲基化，即“全甲基化”或“全未甲基化”序列。不过，如果仅有单个或少量甲基化位点具有功能相关性，则引物可设计为与这样的靶标序列相结合，其中仅这些残基必须为甲基化(仍为胞嘧啶)或未甲基化(转变成尿嘧啶)以便发生有效结合。可通过适当的引物设计完全避开其他(非功能相关性)潜在甲基化位点，或者可将引物设计成使其结合不依赖于这些较低相关性位点的甲基化状态(例如通过在引物序列中适当位点上包括G和A残基的混合)。据此，预计只有在含DNA的原始样品中存在目的基因的甲基化或未甲基化形式时才能产生扩增产物。作为补充或替代，可能合适的是，引物对中至少有一个引物仅与试剂处理后的未甲基化DNA序列结合，而另一引物仅与处理后的甲基化DNA序列结合——例如，基因包括甲基化的功能性重要位点和独立的未甲基化功能性重要位点。优选地，引物对中至少一种引物为含有茎环或“发夹”结构的引物，其中所述茎环结构带有分子能量转移对的供体和受体部分。该引物可以是或不是区分甲基化和未甲基化 DNA的期望引物。引物的排列方式使得在未发生扩增时受体部分使受到激发的供体部分所发射的荧光猝灭。因此，在引物指导的扩增开始前或未发生时，茎环或“发夹”结构保持完整。供体部分发射的荧光被受体部分有效地接收，导致荧光猝灭。在扩增过程中，引物的茎环或发夹结构的构型发生改变。特别地，一旦引物被掺入扩增产物中，尤其是双链DNA中时(特别是在第二轮扩增过程中)，茎环或发夹结构被破坏。这一结构改变使得供体和受体部分充分分离以致受体部分不能再有效猝灭供体部分所发射的荧光。因此，供体部分产生可检测的荧光信号。实时检测这种信号以提供甲基化或未甲基化目的基因拷贝数的指标。因此，本发明方法可利用寡核苷酸来扩增以分子能量转移(MET)标记可检测地进行标记的核酸。所述引物含有MET对的供体和/或受体部分，在扩增反应中被掺入扩增产物中，使得扩增产物同时含有MET对的供体和受体部分。当扩增产物为双链时，掺入扩增产物中的MET对可以在同一链上，或者当扩增为三重扩增(triamplification)时，可以在两条相对的链上。在扩增所用聚合酶具有5’_3’ 外切核酸酶活性的一些情况下，MET对中的一个部分可被这种外切核酸酶活性从至少一些扩增产物群体上切除。此类外切核酸酶活性对本发明的扩增方法没有不利影响。如本文所述，本发明方法可适用于许多种核酸序列扩增方法，包括聚合酶链式反应(PCR)、三重扩增和其他扩增系统。在一个优选的实施方案中，MET为荧光共振能量转移(FRET)，其中寡核苷酸以供体和受体部分进行标记，其中供体部分为荧光团，受体部分可以是荧光团，以使供体部分发射出的荧光能被受体部分吸收。受体部分可以是猝灭剂。这样，扩增引物为同时包含供体和受体部分的发夹引物，其构型使得受体部分使供体的荧光猝灭。当引物被掺入扩增产物中时，其构型发生变化，猝灭现象被消除，可检测到供体部分的荧光。本发明方法允许检测扩增产物而无需预先分离出未掺入的寡核苷酸。此外，通过将标记寡核苷酸掺入产物中，它们还允许直接对扩增产物进行检测。在一个优选的实施方案中，本发明方法还涉及检测参照基因的表达。参照基因对于不同样品之间的比较而言非常重要。通过选择认为在被比较样品中以稳定且可靠方式表达的适合基因，对参照基因和目的基因一起进行的检测将样品间的变异性考虑在内，例如输入原料量、酶活效力、样品降解等。存在可靠的输入DNA量时，参照基因应当理想地为在测试条件下在各样品中恒定地表达。因此，目的基因所得结果可针对相应参照基因的拷贝数进行归一化。本发明的合适参照基因包括β -肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、 核糖体RNA基因如18S核糖体RNA和RNA聚合酶II基因(Radonic Α.等.，Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jan 23 ；313 (4) :856-62)。一个特别优选的实施分案中，参照基因为 β-肌动蛋白。因此，本发明的方法可进一步以利用至少一个引物对扩增参照基因的至少一部分为特征，其中所述引物对中至少一种引物为含有上述特征的茎环结构的引物。只要可以检测扩增产物作为参照基因存在情况的可靠指示，参照基因中任何合适的部分都可根据本发明的方法进行扩增。特别易于检测的扩增产物为约50-250bp之间。更优选地，使用至少一个引物对进行甲基化或未甲基化参照基因进行的扩增产生约50-150bp 的扩增产物。这对组织样品特别重要，尤其是通常只能获得有限DNA质量的石蜡包埋样品。在包括参照基因的本发明方法实施方案中，所述方法还可以该方法的步骤为特征，所述步骤包括利用标准曲线定量甲基化或未甲基化目的基因的(实时)检测结果，还包括利用参照基因的标准曲线定量甲基化或未甲基化参照基因的实时检测结果，以产生每一情况下基因的拷贝数，并任选地还包括通过用甲基化或未甲基化目的基因拷贝数除以参照基因拷贝数而对结果进行归一化。同样，该方法的特征可以是当循环数阈值小于或等于40时认为扩增是有效的。对参照基因至少一部分的扩增通常利用至少一个引物对。优选地，像目的基因一样，所述引物对中至少一种引物为含有茎环结构的引物，其中所述茎环结构带有分子能量转移对的供体和受体部分。本文已就此类结构在扩增中的作用机制进行了阐释。本发明方法中所用“发夹”引物最优选地如US 6，090, 552和EP0912597中所述，
这些公开内容通过引用并入本文。这些引物的商品名称为Amplifluor 引物。因此，在一个特别优选的实施方案中，用于扩增一部分目的基因和/或参照基因的含有茎环结构的引物以5'至3'顺序包括以下邻接序列(a)约6至30个核苷酸的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列中的核苷酸用选自分子能量转移对中供体部分和受体部分的第一部分进行标记，其中所述供体部分在激发后在一个或多个特定波长下发射荧光，所述受体部分吸收和/或猝灭所述供体部分所发射的荧光；(b)单链的第二核苷酸序列，其包含约3至20个核苷酸，或基本由其组成，或由其组成；(C)第三核苷酸序列，其包含约6至30个核苷酸，或基本由其组成，或由其组成，其中所述第三核苷酸序列中的核苷酸用选自所述供体部分和所述受体部分的第二部分进行标记，且所述第二部分是该组中未用于标记所述第一核苷酸序列的成员，其中所述第三核苷酸序列与所述第一核苷酸序列为反向互补，以使所述第一核苷酸序列与所述第三核苷酸序列之间可形成双链体而使所述第一部分与第二部分接近，从而在该供体部分被激发且发射荧光时，该受体部分吸收并猝灭所述供体部分所发射的荧光；和(d)在所述引物的3'末端的单链的第四核苷酸序列，其包含约8至40个核苷酸， 或基本由其组成，或由其组成，所述第四核苷酸序列在其3'末端包含SEQ ID N0.2、4、6、8、 10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、62 和 63 中任一核苷酸序列 (并因此能够引发由核酸聚合酶合成核苷酸序列，所述核苷酸序列与包含该基因甲基化或未甲基化DNA的一部分的核酸链互补)；其中在未形成所述双链体时，所述第一部分与所述第二部分分开一定距离，阻止了所述第一和第二部分之间的分子能量转移。一个特别优选的实施方案中，所述供体部分和受体部分形成一个荧光共振能量转移(FRET)对。分子能量转移(MET)是能量在供体分子和受体分子之间以非辐射形式传递的过程。荧光共振能量转移(FRET)是MET的一种形式。FRET因某些化合物的特性而产生；当被特定波长的光照射而激发时，它们会发射不同波长的光(即，发荧光)。此类化合物被称为荧光团。FRET中，能量在供体分子(为荧光团)和受体分子之间以非辐射形式长距离(10-100人)传递。供体吸收光子并将其能量非辐射地转移给受体(Fiirster, 1949， Z. Naturforsch. A4 :321-327 ；Clegg, 1992，Methods Enzymo 1. 211 :353-388)。当激发谱和发射谱有重叠的两个荧光团靠近时，一个荧光团的激发将导致其发射特定波长的光，而这一波长的光被第二个荧光团吸收并使其激发，继而导致其发荧光。也就是说，第一个(供体)荧光团的激发态能量通过共振引发的偶极-偶极相互作用转移到邻近的第二个(受体)荧光团。结果，供体分子的寿命缩短，其荧光被猝灭，而受体分子的荧光强度增强并去极化。当供体的激发态能量转移至非荧光团受体上时，供体的荧光被猝灭而没有随后的受体荧光发射。这种情况下，受体起着猝灭剂的作用。猝灭剂和受体均可用于本发明。能够参与荧光共振能量转移(FRET)的分子对被称为FRET对。为使能量转移发生，供体和受体分子通常必须非常接近(最多 70 至 100 A ) (Clegg, 1992，Methods Enzymo 1. 211 :353-388 ； Selvin, 1995, Methods Enzymol. 246 :300-334)。能量转移效率因供体与受体分子之间的距离而迅速降低。据F5rster (1949，Ζ. Naturforsch. A4 =321-327)所述，能量转移效率与DX 10-6成正比，其中D为供体与受体之间的距离。实际上，这意味着FRET可在最大约 70 λ的距离时以最高效率发生。FRET中常用的分子在独立章节中讨论。荧光团是供体还是受体取决于其激发和发射谱，以及与其配对的荧光团。例如，FAM可被488nm波长的光最高效地激发，发射出500-650nm波谱的光，525nm处有最强发射。FAM是与JOE、TAMRA和 ROX (均在514nm处达到其最大激发)配对使用的合适的供体荧光团。一个特别优选的实施方案中，所述供体部分为荧光素或其衍生物，所述受体为 DABCYL0优选地，所述荧光素衍生物包含6-羧基荧光素，或基本由其组成，或由其组成。MET标记可附着至引物的任意适当位点。一个特别优选的实施方案中，供体和受体部分位于茎环结构中互补的核苷酸上，以使茎环结构完整时两个部分在物理空间上彼此极为接近。然而，本发明引物可在任何这样的位置以所述部分进行标记所述位置可有效地允许在未发生扩增时在供体与受体之间发生MET/FRET，而在引物被掺入扩增产物后使供体与受体分开。
所述茎环或发夹结构序列不依赖于靶标基因(目的基因或参照基因)的核苷酸序列，因为不与其结合。据此，可设计“通用”的茎环或发夹序列，随后可与序列特异性引物组合以便于进行目的序列的实时检测。主要的序列要求是，序列在扩增未发生时形成稳定的茎环/发夹结构(并因此保证有效猝灭)。这样，引物中的序列特异性部分与模板链结合并指导互补链的合成。引物因此成为第一轮扩增中扩增产物的一部分。当互补链合成后，扩增通过茎环/发夹结构发生。这就使荧光团与猝灭剂分子分开，从而随着扩增的进行而导致荧光的产生。所述茎环结构优选地位于扩增所用引物中序列特异性部分的5’末端。如上所述，这一检测序列通常以FRET对进行标记。优选地，发现FRET对中一个部分为朝向、接近或位于序列的5’端，另一个部分朝向、接近或位于序列的3’端，以使茎环或发夹结构保持完整时，两个基团之间发生有效的FRET。如实验部分中的详述，必须仔细选择引物以确保本发明方法的灵敏度和特异性。 据此，检测基因甲基化状态的特别优选的引物包括包含以下核苷酸序列或基本由其组成或
由其组成的引物
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和/或，
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和/或，
5，-CCCTCCACCAACATCAAA-3，(SEQ ID NO. 62)
5，-TGGAATTTAGGGTAGTATTGT-3' (SEQ ID NO. 63)
SEQ ID NO 4和8代表与经亚硫酸氢盐转换的CTAGlB未甲基化序列互补的正向引
物(有义引物)序列。SEQ ID NO 12、16和20代表与经亚硫酸氢盐转换的CTAG2未甲基化序列互补的正向引物(有义引物)序列。SEQ ID NO 24、沘、32、36和40代表与经亚硫酸氢盐转换的PRAME未甲基化序列互补的正向引物(有义引物)序列。SEQ ID NO 43代表发夹结构序列。SEQ ID NO 1、5、9、13、17、21、25、29、33 和 37 分别包含发夹结构序列以及 SEQ ID NO. 4、8、12、16、20、24、28、32、36 和 40 的序列。SEQ ID NO. 2和6代表与经亚硫酸氢盐转换的CTAGlB启动子未甲基化序列互补的反向引物(反义引物)序列。SEQ ID NO. 10、14和18代表与经亚硫酸氢盐转换的CTAG2启动子未甲基化序列互补的反向引物(反义引物)序列。SEQ ID NO. 22、沈、30、；34和38代表与经亚硫酸氢盐转换的PRAME启动子未甲基化序列互补的反向引物(反义引物)序列。
SEQ ID NO. 3、7、11、15、19、23、27、31、35 和 39 包含发夹结构序列以及 SEQ ID NO. 2、6、10、14、18、22、26、30、34 和 38 的序列。SEQ ID NO 42和44代表与经亚硫酸氢盐转换的甲基化β -肌动蛋白基因序列互补的正向和反向引物序列；SEQ ID NO. 41包含发夹结构序列和SEQ ID 44的序列。SEQ ID NO 63代表与经亚硫酸氢盐转换的MageA3未甲基化序列互补的正向引物 (有义引物)序列。SEQ ID NO 61包含发夹结构序列和SEQ ID 63的序列。SEQ ID NO. 62代表与经亚硫酸氢盐转换的MageA3未甲基化序列互补的反向引物序列。如实验部分中所详述，CTAG2的表达和甲基化水平在使用SEQ ID NO. 9至12和SEQ ID NO 21至20中任一引物的测定中显示出最佳一致性。如实验部分中所详述，PRAME的表达和甲基化水平在使用SEQ ID NO 21至40中任一引物的实验中显示出最佳一致性。因此，另一实施方案中，与CTAG2的区域结合的优选引物包含SEQ ID NO 9至12和 SEQ ID NO 21至20中任一核苷酸序列，或基本由其组成，或由其组成。与PRAME的区域结合的优选引物包含SEQ ID NO 21至40中任一核苷酸序列，或基本由其组成，或由其组成。以不同低甲基化测定产生的扩增产物具有如下序列CTAG1B_1 (129bp)GGAAGGTGGGGGAGAGTGGTTTGGATTTTAGTATTTTTTTTTTTTTTTAGGGTTAGGTTTTGTTTGGTT ATTTTTTGTTGTTATAGGTGTGTTTGGTATAGATATTTAGTTTTTGGGGTTGTGTTGTTTT(SEQ ID NO. 45)CTAGlB_2(130bp)GGGTTGGAGAGTTGTTTGTTTGAGTTGTATTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGATAGTTTTGGTGGTG AGGTGGGGGTTGGGAGATGGGGAGGGTAGGGTTAGGTGGGGGAGGAGGTGGGGGAGATG(SEQ ID NO. 46)CTAG2(150bp)TGGTGGTGTTGTTTTTGTGTAGGATGGAAGGTGTTTTTGTGGGGTTAGGAGGTTGGATAGTTGTTTGT TTTAGTTGTATTTTGTTTTGTTTTGTTTTAGGAGGTTTTGGTGGTGAGGTGGGGGTTGTGAGATGGAGATAATAGG GTTAAG(SEQ ID NO. 47)CTAG2_2 (80bp)GGTGGTTTTGAAGGATTTTATTGTGTTTGGTAATTTATTGTTTATGTTAGTTTGGGATTAGGATAGGGA AGGTGTTGGGT(SEQ ID NO. 48)CTAG2_3(125bp)TTTTGTTTTGGGATGTTGTATTTTTTTTTTGATTAGGGGTGGTTTTGAAGGATTTTATTGTGTTTGGTA ATTTATTGTTTATGTTAGTTTGGGATTAGGATAGGGAAGGTGTTGGGTGGATGAGG(SEQ ID NO. 49)PRAME_1:129bpTGGGTTTGTAGTGTTTTAGTATTGTTTTGGGATATTTTATTTGTTTTTTAGGTGTGATTTGTTAATAGG TTTGTATTGGTGATMAAGGAGTAGTTTTGAATGTAGGGAAAGTAGGGTGGAGTTTTTTG(SEQ ID NO. 50)PRAME_2 :106bpTTGTTTTGGGATATTTTATTTGTTTTTTAGGTGTGATTTGTTAATAGGTTTGTATTGGTGATAAAAGGA GTAGTTTTGAATGTAGGGAAAGTAGGGTGGAGTTTTT(SEQ ID NO. 51)PRAME_3 :120bp
GAGGGGAGGGGTGTGAATGTGTGGATTTTTGTGGAGAGTGGAAATATGGGGAGTTGAGGGGAGTATGTG TGGGTTTTAGAAAGTTTTGGGAAATTGATTTTTGGGAGTAGGGAGGAATG(SEQ ID NO. 52)PRAME_4 :59bpAGTGTTGGAGGTTTTGAGGTTAGTTTAAGTTGTTTTAAAATGGAATGAAGGTGTTTGTG(SEQ ID NO. 53)PRAME_6 :50bpTGGTGGATGTTTTGGGATTTGGTTTTTTTGAAGGTGTTGGGGGTTGGGGATGGTTTAGGTAGTGGTGTA GGTGTTTTAGGAAGGTGGGAGTAGAGGTAGAAATGTTG(SEQ ID NO. 54)PRAME_7 :98bpGTTTTGGAAGGATTGAGAAATGGGGATTGGTTAGATTAGGTTGTTTAGTTTTTTGGTTTTTATTGTTGT TTTTTTTGTTTTATGTAGTGGTTAGGGTG(SEQ ID NO. 55)这些序列位于相应基因的CpG富集岛中。因此，本发明还涉及寡核苷酸、引物和/ 或探针，其由SEQ ID NO :45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55所述经亚硫酸氢盐转换的核苷酸序列部分组成或与其互补。由CTAG1B、CTAG2和/或PRAME基因的经亚硫酸氢盐转换序列部分组成或与其互补的引物部分优选地小于30bp ；其长度优选地为27、26、25、24、23、22、21、20、19、18或 17bp。因此，此类优选引物的CTAG1B、CTAG2和/或PRAME特异性部分优选地为28至16bp， 或27至17bp之间长度。引物可因此包含27、26、25、24、23、22、21、20、19、18或17bp个由
经亚硫酸氢盐转换的序列组成或与其互补的连续碱基。(引物对中)一种或两种引物可用合适的茎环或发夹结构标记，或合成成引入合适的茎环或发夹结构，所述茎环或发夹结构带有供体和受体部分，如上详述，优选地在5’ 端。在一个优选的实施方案中，引物之一或之两优选地在5’端用茎环结构进行标记，或合成成引入茎环结构，所述茎环结构包含以下核苷酸序列或基本由其组成或由其组成5，-AGCGATGCGTTCGAGCATCGCU-3，(SEQ ID NO 43)该检测序列通常以FRET对进行标记。优选地，所述FRET对中一个部分为朝向、接近或位于序列的5’端，另一个部分朝向、接近或位于序列的3’端，以使茎环或发夹结构保持完整时，两个部分之间发生有效的FRET。一个特别优选的实施方案中，所述茎环或发夹结构(尤其是包含SEQ ID NO 1所示序列或基本由其组成或由其组成的核酸)在其5’端以 FAM标记，其3’端以DABCYL标记。本文论述了其他优选的组合，这些讨论酌情应用。这些引物形成了本发明的不同方面。这些引物的其他特征概述于以下的详细说明 (实验部分)。需要注意的是寡核苷酸、引物和探针(序列)的变体可用于本发明中。特别地，可依据需要添加额外的侧翼序列，例如以提高结合特异性或有助茎环形成。变体序列优选地与SEQ ID NO :1至42和SEQ ID NO :44、60、61和62的引物和/或探针核苷酸序列之间具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%或至少99%的核苷酸序列同一性。适当时，引物与发夹结构中可引入合成的核苷类似物，或是基于例如DNA、RNA或PNA，或是其混合。同样地，可酌情使用其他荧光供体和受体部分/FRET对。除了用荧光供体和受体部分标记外，引物还可包括修饰的寡核苷酸和其他悬突基团和标签，只要本发明方法中的引物和/或茎环/发夹结构的功能不受影响即可。
对于每一个引物对，至少一个引物用分子能量转移对的供体和受体部分进行标记，其排列方式使得在未扩增时受体部分猝灭供体部分(激发状态)发射的荧光，而扩增过程中茎环结构被破坏，使得供体与受体部分分开足够距离以产生可检测的荧光信号，实时检测这种荧光信号以提供基因拷贝数的指标。优选地，所述供体部分和所述受体部分为 FRET对。一个实施方案中，所述供体部分和所述受体部分选自于5-羧基荧光素或6-羧基荧光素(FAM)、2' 7' -二甲氧基-4' 5' -二氯_6_羧基荧光素(JOE)、罗丹明、6-羧基罗丹明(R6G)、N，N，N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)，6-羧基-X-罗丹明(ROX)、 5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、邻氨基苯甲酰胺、香豆素、铽螯合衍生物、孔雀绿、活性红4 (Reactive Red 4)、DABCYL、四甲基罗丹明、芘丁酸、伊红硝基酪氨酸、溴化乙锭和德克萨斯红。在另一实施方案中，所述供体部分选自于荧光素、5-羧基荧光素或6-羧基荧光素(FAM)、罗丹明、5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、邻氨基苯甲酰胺、香豆素、铽螯合衍生物、孔雀绿和活性红4，所述受体部分选自于DABCYL、罗丹明、四甲基罗丹明、芘丁酸、伊红硝基酪氨酸、溴化乙锭和德克萨斯红。优选地，所述供体部分为荧光素或其衍生物，所述受体基基团为DABCYL，最优选地，供体部分为6-羧基荧光素。本文讨论了其他优选组合，尤其是在多重检测情况下，这些组合也在本发明这些方面的考虑中。本发明还提供了可用于进行本发明方法的试剂盒。所述试剂盒可引入任何与本文所述本发明多种方法(和使用)相关的优选特征。因此，本发明提供了用于检测含DNA样品中甲基化或未甲基化目的基因存在情况和/或量的试剂盒，其包含至少一个本发明的引物对。优选地，所述试剂盒包含用于检测甲基化或未甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或 MageA3基因的存在情况和/或量的本发明引物对，以及用于检测参照基因(尤其是β-肌动蛋白)的存在情况和/或量的引物对。因此，所述试剂盒可含有包含引物的引物对，所述引物包含 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、60、61 或 62 所示核苷酸序列或基本由其组成或由其组成。优选地，每个引物对中至少一种引物以适当茎环或发夹结构进行标记，以利于实时检测，如上所述(其讨论加以必要修改后也适用于此处)。最优选地，每个引物对的至少一种引物中引入了包含SEQ ID NO :43的核苷酸序列或基本由其组成或由其组成的茎环或发夹结构。该茎环结构以适当供体和受体部分进行标记，如上所述(其讨论加以必要修改后也适用于此处)。如上所述，本发明引物的其他特征鉴定概述于以下的详细说明(实验部分)。本文所述这些序列的变体可用于本发明。如本文所述，可酌情使用其他荧光供体和受体部分 /FRET 对。在一个实施方案中，本发明试剂盒还包含修饰未甲基化胞嘧啶的试剂，如本文所述(与被保护的甲基化胞嘧啶残基相比的偏好性)。此类试剂可用于区分胞嘧啶残基的甲基化和未甲基化形式。在一个优选的实施方案中，所述试剂包含亚硫酸氢盐，优选亚硫酸氢钠。该试剂能够将未甲基化的胞嘧啶残基转换为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶保持不变。这一残基差异可用于在下游过程中区分甲基化和未甲基化核酸，例如用区分胞嘧啶和尿嘧啶的引物进行的PCR(胞嘧啶与鸟嘌呤配对，而尿嘧啶与腺嘌呤配对)。根据本文对本发明方法的讨论，适当的对照可用于该方法的质量控制。据此，在一个实施方案中，本发明试剂盒还包含一个或多个甲基化状态已知的对照核酸分子，或基本由其组成，或由其组成。这些(一个或多个)对照核酸分子可包括已知为(或经处理而成为)甲基化的核酸和/或已知为(或经处理而成为)未甲基化的核酸。一个适当内参基因的例子为β -肌动蛋白，其通常为未甲基化，但可处理成为甲基化。本发明试剂盒可额外地包括其他用于进行本发明要求保护的方法的适当缓冲剂和试剂。因此，对本发明方法进行的讨论酌情适用于此处，为简洁起见不再重复。在一个实施方案中，本发明试剂盒还包含核酸扩增缓冲剂，或基本由其组成，或由其组成。试剂盒还可额外包含催化核酸扩增的酶，或基本由其组成，或由其组成。因此，试剂盒还可额外包含用于核酸扩增的合适的聚合酶，或基本由其组成，或由其组成。实例包括那些来自于家族A和家族B类型的聚合酶，例如Taq、Pfu, Vent等。试剂盒的多种组分可分别包装在独立隔间中，或者可以例如在适当时贮存在一起。试剂盒还可包含适当的使用说明，可单独打印在纸片上或例如并入试剂盒的包装中。说明书可有助于本发明试剂盒与适当的实时扩增或终点检测仪器一起使用，许多是市售的。本发明实时方法的最后一步涉及利用标准曲线定量甲基化或未甲基化目的基因和任选的参照基因(如果有)的实时检测结果。标准曲线可用一组标准品产生。每一标准品含有已知拷贝数或浓度的目的基因和/或参照基因(视情况而定)。通常，荧光基线值将被设定为背景荧光。例如，一个实施方案中利用了序列检测系统Gequence Detection System, SDS)软件。该软件在开始检测扩增产物前设定了一个3_15个扩增反应循环的默认基线范围。然后将荧光阈值定义为高于此基线的统计学显著值。通常，阈值设定为高于基线荧光的10倍标准差。设备提供适当软件以进行实时扩增反应。软件自动计算反应的基线和阈值。然后确定各标准品的循环数阈值(Ct)。这是达到阈值扩增水平所需的循环数。因此，反应混合物中基因标准品的起始浓度越大，达到特定扩增产物产量所需的循环数越少。将Ct值与标准品DNA的已知起始拷贝数的Iogltl值作图可得到直线。这就是标准曲线。因此，目的基因和参照基因(如果使用)扩增的Ct值可各自从相应标准曲线内推，以确定其在含DNA样品中的拷贝数。因此，该方法的输出为各目的基因和参照基因的拷贝数。 可通过用甲基化或未甲基化目的基因的拷贝数除以参照基因拷贝数以使结果归一化。在一个优选的实施方案中，Applied Biosystems 7900HT快速实时PCR系统用于实施本发明的方法。优选地，使用SDS软件，优选地包括适当的算法，例如Auto CT算法，以自动地生成各个检测物的基线和阈值。本发明方法可以与任何适当扩增技术一起使用，但最优选地，使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。因此，尽管PCR是一个扩增方法(包括基本技术的变体如巢式PCR)， 但等同的技术也可包括在本发明范围内。实例包括但不限于等温扩增技术如NASBA、3SR、 TMA和三重扩增，均为本领域所熟知，其适用试剂是市售的。其他适用的扩增方法包括但不限于连接酶链式反应(LCR) (Barringer等，1990)、MLPA、靶标多核苷酸序列选择性扩增 (美国专利No. 6，410，276)、共有序列引发的聚合酶链式反应(美国专利No 4，437，975)、入侵者技术(invader technology) (Third Wave Technologies， Madison, WI)、链置换技术、 随机引发的聚合酶链式反应(W090/069%)和缺口置换扩增(W02004/067726)。本发明的实时PCR方法通常包括以下步骤降温以允许引物退火、升温以使引物延伸、升温以进行变性和降温以采集数据。一个具体实施方案中，数据采集步骤在约56 V至 63°C之间的温度下进行，最优选地在约57°C或62°C，因为这一温度表现出可产生最高灵敏度和特异性的结果，如实施例部分所述。在一个具体实施方案中，聚合酶链式反应的热曲线包括40-50个重复，优选地为 45个如下循环(a)约 50°C，约 2 分钟(b)约 95°C，约 10 分钟(c)约 ％°C，约 I5 秒(d)约 57°C，约 1 分钟本发明方法中显示出产生特异性和灵敏性结果的优选反应设计为第1阶段50°C 2 分钟；第2阶段95°C 10分钟；第3阶段95°C 15秒、57°C 30秒、57°C 30秒(=平台-数据采集)共45个循环。本发明方法可用于在同一反应中检测多于一种目的基因。通过若干特异性引物组，数种核酸靶标的扩增可在同一反应混合物中进行。这可被称为“多重反应”。在一个优选的实施方案中，用于每种靶标的引物之一或之二可以是用形成FRET对的荧光部分和猝灭部分标记的发夹引物。数种核酸靶标的扩增需要将具有不同发射波长的不同荧光供体和 /或受体部分用于标记每组引物。在扩增后的检测和分析过程中，反应混合物受到光照，并在反应所用每组引物的特征波长下读数。由此可确定混合物中何种特异的靶标DNA被扩增和标记了。在一个具体实施方案中，使用了分别扩增不同靶标序列两个或多个引物对。因此可在单个含DNA样品中检测一系列甲基化/未甲基化目的基因的存在情况和/或数量。多重反应还可用于在同一反应中同时检测目的基因和参照基因。此外，用适当的可区分供体和/或受体部分标记的引物使得目的基因和参照基因分别扩增产生的信号能够区分开来。在一个实施方案中，使用了通用的猝灭剂和各自具有可区分的最大发射波长的适当的荧光团供体。一种特别优选的猝灭剂为DABCYL。如下荧光团可各自与猝灭剂DABCYL共同使用以允许多重反应香豆素(最大发射波长为475nm) ,EDANS (491nm)、荧光素(515nm)， 荧光黄(523nm), BODIPY(525nm)、伊红(543nm)、四甲基罗达明(575nm)和德克萨斯红 (615nm) (Tyagi 等.，Nature Biotechnology, Vol. 16, Jan 1998 ;49_53)。本文讨论了其他优选的组合。在另一实施方案中，含DNA样品可拆分并对样品的适当部分实施本发明的方法， 以直接获得可比较的结果。因此，检测目的基因和参照基因两者时，样品可分为两组以允许在一部分样品中对目的基因扩增进行实时检测，而在另一部分样品中对参照基因的扩增进行实时检测。样品根据需要可进一步拆分以允许进行适当的对照反应。这种设计的好处是可使用通用的FRET对来标记每个引物对，并免除了在一系列波长下检测发射光的必要。不过，此方法依赖于获得最初允许拆分的样品。可使用任意适当的反应体积，但一个具体实施方案中，扩增步骤所用总反应体积约为10-40 μ 1，更优选地为约10-30 μ 1，最优选地为约 12μ 1。一方面，本发明的寡核苷酸、引物或探针、引物对、试剂盒或方法被用于诊断癌症或癌症素因，其中样品中未甲基化(或低甲基化)CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3的存在指示癌症或癌症素因。因此，本发明提供了用于诊断癌症或癌症素因的试剂盒、方法和引物。“诊断”在本文中定义为包括筛查疾病或疾病前期(pre-stadia)、鉴定疾病或疾病前期、监测疾病的分期和状态以及进展、检查治疗后疾病复发，以及监测特定治疗的成功。 该测试还可具有预后价值，这一点包括在“诊断”的定义。测试的预后价值可用作潜在癌症易感性的标志物或癌症进展的标志物。因此，可在疾病有机会在患者中表现出可鉴定症状之前鉴别出有风险的患者。在一个优选的实施方案中，所述癌症选自肺癌、黑色素瘤或乳腺癌。在一个优选的实施方案中，用于诊断的方法和测定利用至少一种包含SEQ ID NO. 1、2、 3、4、5、6、7或8中任意核苷酸序列或基本由其组成或由其组成的寡核苷酸作为CTAGlB的标记。用于诊断的方法和测定利用至少一种包含SEQ ID NO. SEQ ID NO 9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18或19中任意核苷酸序列或基本由其组成或由其组成的寡核苷酸作为CTAG2的标记。用于诊断的方法和测定利用至少一种包含SEQ ID NO 20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40中任意核苷酸序列或基本由其组成或由其组成的寡核苷酸作为PRAME的标记。在一个优选的实施方案中，癌症或癌症素因的诊断利用包含 SEQ ID NO. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 和 40 中任意核苷酸序列或基本由其组成或由其组成的寡核苷酸，并检测基因的未甲基化形式。测试可以诊断方式进行，或与治疗方案共同进行。确定CTAG1B、CTAG2和/或PRAME 表达在NSCLC、乳腺癌或黑色素瘤中的预测价值的RT-PCR测定可用于选择适于用CTAG1B、 CTAG2,PRAME和/或MageA3免疫治疗进行治疗的患者。本发明人已表明，为检测未甲基化 CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3设计的利用本发明寡核苷酸、引物或探针、引物对或试剂盒的测定能够可靠地以CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3表达将样品分类。低甲基化测试所得甲基化状态结果与用RNA样品进行的CTAG1B、CTAG2和/或PRAME的现有RT-PCR 测试所得结果具有良好一致性。当样品(例如从非小细胞肺癌取得的细针穿刺活检样品)难以用qRT-PCR进行分析时，通过检测MageA3的甲基化状态确定的蛋白表达提供了有价值的替代方案。因此，甲基化测试具有临床应用前景。因此，本发明中所有方法可应用于细针活检穿刺样品。在一些具体实施方案中，测定了 MAGE-A3基因的甲基化状态。如上所述，此类样品不适用于以其他检测(MAGE-AIB)表达的方法。这些样品可能仅含有很少的细胞并因此含有极低的DNA水平。例如，此类样品可能仅允许约70-150 μ g的DNA输入用于每个测定。如实施例4所述， 本发明的方法对细针穿刺活检样品很有效。本发明的另一方面提供了预测成功治疗受试者的癌症的可能性的方法，包括(a)用选择性修饰DNA中未甲基化胞嘧啶残基以产生可检测的修饰残基但不修饰甲基化胞嘧啶残基的试剂接触/处理从受试者获得的含DNA的测试样品；(b)用至少一个引物对扩增未甲基化CTAG1B、CTAG2和/或PRAME基因的至少一部分，所述引物对中至少一种引物设计成仅与用试剂处理后的甲基化或未甲基化DNA序列结合，其中所述引物对中至少一种引物包含SEQ ID NO. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、44、60和61中任一核苷酸序列，或基本由其组成，或由其组成。
(c)确定CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的甲基化状态。其中样品中未甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3的存在表明以CTAG1B、 CTAG2、PRAME和/或MageA3免疫疗法成功治疗的可能性高于检测到未甲基化CTAG1B、 CTAG2、PRAME和/或MageA3不存在或以低水平存在的情况。步骤(c)包括鉴定扩增产物是否形成。鉴定到扩增产物(利用本文所述任意适当技术)表明样品中存在未甲基化或低甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3。当然，相反的情况也适用，所以本发明的方法同样可用于检测是否可能对以 CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3免疫治疗剂的治疗有抗性或不成功——样品中不存在未甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3表明很可能对治疗有抗性和/或治疗很可能不成功。在一些实施方案中，甲基化DNA的特异性引物也可用于补充方法。本发明的方法还可用于为患者选择适合的治疗过程——未甲基化CTAG1B、CTAG2、 PRAME和/或MageA3的存在表示可以有益地施用CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3免疫治疗剂，而未甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3不存在或以低水平存在则表示免疫治疗试剂为禁忌。对本发明寡核苷酸、引物或探针、引物对、试剂盒或方法的讨论加以必要修改后也适用于这一方面，因此所有实施方案适当时均考虑用于本发明的这一方面。“成功治疗的可能性”意为用任意一个或多个所列治疗剂成功治疗癌症的可能性，所述治疗剂优选地为CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3免疫治疗剂或包含CTAG1B、 CTAG2、PRAME 和 / 或 MageA3 的组合物。“抗性”定义为利用任一特定免疫治疗剂成功治疗癌症的可能性降低和/或为达到
治疗效果需要更高剂量。CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3的低甲基化可与特定癌症类型相联系。据此， 一个具体实施方案中，本发明提供了检测样品中乳腺癌、肺癌(包括NSCLC)或黑色素瘤的素因或发病的方法，所述方法包括利用本发明所述寡核苷酸、引物或探针、引物对、试剂盒或方法检测CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的甲基化状态，其中样品中检测到未甲基化GTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3指示癌症的素因或发病，尤其是黑色素瘤、包括非小细胞肺癌(NSCLC)的肺癌或乳腺癌。在另一实施方案中，肿瘤或癌症选自前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、头颈癌(包括食管癌)、宫颈癌、结肠直肠癌、鳞状细胞癌，肝癌，多发性骨髓瘤和结肠直肠癌。另一方面，提供了一种确定CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3阳性肿瘤存在的方法，包括利用本文所述的寡核苷酸、引物或探针、引物对、试剂盒或方法检测样品中 CTAGIB, CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的甲基化状态，其中未甲基化CTAG1B、CTAG2、 PRAME和/或MageA3的存在表明存在CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3阳性肿瘤。测试可以诊断方式进行，或与治疗方案共同进行。测试还可用于确定对患者采用何种治疗或预防方案以及用于监测治疗方案的有效性。因此，本发明还提供了用于鉴定和/或选择适宜于CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或 MageA3免疫疗法的患者的方法，包括利用本文所述的寡核苷酸、引物或探针、引物对、试剂盒或方法检测患者样品中CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的甲基化状态，其中如果CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因为未甲基化的，则该受试者被鉴定和/或选择为用CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3免疫疗法治疗。
或者，如果基因不是未甲基化的，则该受试者优选地不被鉴定和/或选择为以 CTAG1B、CTAG2、PRAME 和 / 或 MageA3 免疫疗法治疗。在一个相关方面中，本发明提供了预测成功治疗癌症的可能性的方法，包括利用本文所述寡核苷酸、引物或探针、引物对、试剂盒或方法检测患者样品中CTAG1B、CTAG2、 PRAME和/或MageA3基因的甲基化状态，其中如果基因为未甲基化，则以CTAG1B、CTAG2、 PRAME和/或MageA3免疫疗法成功治疗的可能性高于基因甲基化的情况。或者，样品中不存在未甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3表明对CTAG1B、 CTAG2、PRAME和/或MageA3免疫疗法治疗有抗性的可能性高于基因未甲基化的情况。因此，检测到甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因(或未检测到低甲基化基因) 指示以免疫疗法进行成功治疗的可能性很低。因此，患者群体可基于其CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的甲基化状态而被选择用于治疗。这就产生更有针对性和个性化形式的医疗，从而因为患者将以最有可能有效的药物进行治疗，而带来更高的成功率。在另一个相关方面中，本发明提供了选择适用的癌症治疗方案的方法，包括利用本文所述寡核苷酸、引物或探针、引物对、试剂盒或方法检测患者样品中CTAG1B、CTAG2、 PRAME和/或MageA3基因的甲基化状态，其中如果基因为未甲基化，则选择免疫疗法(尤其是CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3免疫疗法)进行治疗。或者，如果基因不是未甲基化状态，则禁用免疫疗法。本发明还提供了治疗受试者的癌症的方法，包括施用免疫疗法，其中所述受试者已根据本发明任一方法或利用本文所述寡核苷酸、引物或探针、引物对、试剂盒或方法，基于检测CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因甲基化状态而进行了选择。优选地，对本文所述所有不同的方面，检测到未甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因均对应于CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3蛋白水平的提高。可用于本发明的CTAG1B、CTAG2、MAGE-A3和/或PRAME免疫疗法包括基于CTAG1B、 CTAG2、MAGE-A3 禾口 / 或 PRAME 的组合物。包含 CTAG1B、CTAG2、MAGE-A3 禾口 / 或 PRAME 的组合物的实例包括包含全长CTAG1B、CTAG2、MAGE-A3和/或PRAME、基本全长的CTAG1B、 CTAG2、MAGE-A3 和 / 或 PRAME 或是 CTAG1B、CTAG2、MAGE_A3 和 / 或 PRAME 片段的组合物，例如 CTAG1B、CTAG2、MAGE—A3 禾口 / 或 PRAME 的月太。可用于本发明的肽的实例包括如下MAGE-A3肽
SEQ ID NO肽序列SEQ ID NO64FLWGPRALVSEQ ID NO65EVDPIGHLYSEQ ID NO66MEVDPIGHLYSEQ ID NO 67VHFLLLKYRA
权利要求
1.寡核苷酸、引物或探针，其包含SEQ ID NO. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、 40、41、42、44、61、62或63中任何核苷酸序列，或基本由其组成，或由其组成，所述寡核苷酸、引物或探针可用于检测基因的甲基化状态。
2.权利要求1的寡核苷酸、引物或探针，其包含SEQID NO. 9至12和SEQ ID NO. 21至 40中任何核苷酸序列，或基本由其组成，或由其组成，所述寡核苷酸、引物或探针可用于检测基因的甲基化状态。
3.权利要求1的寡核苷酸、引物或探针，其按照5'至3'的顺序包含以下邻接序列，或基本由其组成，或由其组成(a)约6至30个核苷酸的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列中的核苷酸用第一部分进行标记，所述第一部分选自分子能量转移对中的供体部分和受体部分，其中所述供体部分在受到激发时在一个或多个特定波长下发射荧光，所述受体部分吸收和/或猝灭由所述供体部分所发射的荧光；(b)单链的第二核苷酸序列，其包含约3至20个核苷酸，或基本由其组成，或由其组成；(c)第三核苷酸序列，其包含约6至30个核苷酸，或基本由其组成，或由其组成，其中所述第三核苷酸序列中的核苷酸用选自所述供体部分和所述受体部分的第二部分进行标记， 且所述第二部分是所述组中未用于标记所述第一核苷酸序列的成员，其中所述第三核苷酸序列与所述第一核苷酸序列反向互补，以使得所述第一核苷酸序列与所述第三核苷酸序列之间可形成双链体而使所述第一部分与第二部分接近，从而当该供体部分受到激发并发射荧光时，该受体部分吸收并猝灭由所述供体部分发射的所述荧光；和(d)在该引物的3'末端的单链的第四核苷酸序列，其包含约8至40个核苷酸，或基本由其组成，或由其组成，其在3'末端包含SEQ ID NO. 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、 26、沘、30、32、34、36、38、40、42、44、61和63中任何核苷酸序列，或基本由其组成，或由其组成(并能够引发由核酸聚合酶合成核苷酸序列，所述核苷酸序列与包含CTAG1B、CTAG2、 MageA3和/或PRAME基因的未甲基化DNA的一部分的核酸链互补)；其中在未形成所述双链体时，所述第一部分和所述第二部分分开至阻止了所述第一和第二部分之间发生分子能量转移的距离。
4.引物对，其包含前述权利要求中任一项的引物。
5.权利要求4的引物对，其包含权利要求3的引物。
6.引物对，其包含以下核苷酸序列，或基本由其组成，或由其组成SEQID N0.9和SEQ ID NO. 10 ； SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID N0. 12 ； SEQ ID N0. 21 和 SEQ ID N0. 22 ； SEQ ID N0. 23 和 SEQ ID N0. 24 ； SEQ ID N0. 25 和 SEQ ID N0. 26 ；SEQ ID N0. 27 和 SEQ ID N0. 28 ； SEQ ID N0. 29 和 SEQ ID N0. 30 ； SEQ ID N0. 31 和 SEQ ID N0. 32 ； SEQ ID N0. 33 和 SEQ ID N0. 34 ； SEQ ID N0. 35 和 SEQ ID N0. 36 ； SEQ ID N0. 37 和 SEQ ID N0. 38 ； SEQ ID N0. 39 和 SEQ ID N0. 40，或 SEQ ID N0. 61 和 62。
7.用于检测基因甲基化状态的试剂盒，其包含至少一种权利要求1至3中任一项所定义的寡核苷酸、引物或探针或者权利要求4至6中任一项所定义的引物对。
8.权利要求1至3中任一项所定义的寡核苷酸、引物或探针或者权利要求4至6中任一项所定义的引物对或者权利要求7所定义的试剂盒，其中所述基因为CTAG1B、CTAG2、 MageA3 禾口 / 或 PRAME 基因。
9.检测含有DNA的样品中未甲基化CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME基因的存在情况和/或量的方法，包括(a)用试剂接触/处理所述含有DNA的样品，所述试剂选择性修饰DNA中未甲基化的胞嘧啶残基以产生可检测的修饰残基，但不修饰甲基化的胞嘧啶残基；(b)用至少一个引物对扩增未甲基化目的基因的至少一部分，所述引物对中至少一种引物被设计成仅与经该试剂处理后的未甲基化DNA的序列结合。
10.根据权利要求9的方法，其中所述引物对中至少一种引物包含SEQID NO. 1至40 或SEQ ID NO. 61至63中任何核苷酸序列，或基本由其组成，或由其组成。
11.诊断癌症或癌症素因的方法，包括通过利用权利要求1至3或8中任一项所定义寡核苷酸、引物或探针、权利要求4至6或8中任一项所定义引物对、权利要求7或8的试剂盒或者权利要求9至10中任一项的方法检测样品中CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME 基因中至少一种的甲基化状态，其中所述样品存在未甲基化CTAGlB、CTAG2、MageA3和/或 PRAME是癌症或癌症素因的指示。
12.用于鉴定和/或选择适于用CTAGlB、CTAG2、MageA3和/或PRAME免疫疗法治疗的患者的方法，包括利用权利要求1至3或8中任一项所定义寡核苷酸、引物或探针、权利要求4至6或8中任一项所定义的引物对、权利要求7或8的试剂盒或者权利要求9至10中任一项的方法检测患者样品中CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME基因的甲基化状态，其中如果CTAGlB、CTAG2、MageA3和/或PRAME基因是未甲基化的，则该受试者鉴定和/或选择为用CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME免疫疗法进行治疗。
13.用于预测成功治疗癌症的可能性的方法，包括利用权利要求1至3或8中任一项所定义寡核苷酸、引物或探针、权利要求4至6或8中任一项所定义的引物对、权利要求7或8 的试剂盒或者权利要求9至10中任一项的方法检测患者样品中CTAGlB、CTAG2、MageA3和/ 或PRAME基因的甲基化状态，其中如果所述基因是未甲基化的，则以CTAGIB、CTAG2、MageA3 和/或PRAME免疫疗法成功治疗的可能性高于所述基因发生甲基化的情况。
14.选择适用的癌症治疗方案的方法，包括利用权利要求1至3或8中任一项所定义寡核苷酸、引物或探针、权利要求4至6或8中任一项所定义的引物对、权利要求7或8的试剂盒或者权利要求9至10中任一项的方法检测患者样品中CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或 PRAME基因的甲基化状态，其中如果所述基因是未甲基化的，则选择免疫疗法进行治疗。
15.治疗受试者的癌症的方法，包括施用包含或编码CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或 PRAME的组合物，其中所述受试者已基于利用权利要求1至3或8中任一项所定义寡核苷酸、引物或探针、权利要求4至6或8中任一项所定义的引物对、权利要求7或8的试剂盒或权利要求9至10中任一项的方法对CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME基因甲基化状态进行测定而被选择进行治疗。
16.治疗患者的方法，包括利用权利要求1至3或8中任一项所定义寡核苷酸、引物或探针、权利要求4至6或8中任一项所定义的引物对、权利要求7或8的试剂盒或者权利要求9至10中任一项的方法检测CTAGlB、CTAG2、MageA3和/或PRAME基因的甲基化状态， 然后向该患者施用包含或编码CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME的组合物。
17.治疗容易复发表达CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME的肿瘤的患者，所述患者已经治疗而除去肿瘤组织，所述方法包括利用权利要求1至3或8中任一项所定义寡核苷酸、引物或探针、权利要求4至6或8中任一项所定义的引物对、权利要求7或8的试剂盒或者权利要求9至10中任一项的方法测定所述肿瘤组织中CTAG1B、CTAG2、MageA3和/ 或PRAME基因的甲基化状态，然后向该患者施用包含或编码CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或 PRAME的组合物。
18.包含或编码CTAGlB、CTAG2、MageA3和/或PRAME的组合物在制备用于治疗肿瘤患者的药物中的用途，其中所述患者已基于利用权利要求1至3或8中任一项所定义寡核苷酸、引物或探针、权利要求4至6或8中任一项所定义的引物对、权利要求7或8的试剂盒或权利要求9至10中任一项的方法对CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME基因甲基化状态进行测定而被选择进行治疗。
19.包含或编码CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME的组合物在制备药物中的用途， 所述药物用于治疗容易复发表达CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME的肿瘤的患者，其中所述患者已基于利用权利要求1至3或8中任一项所定义寡核苷酸、引物或探针、权利要求 4至6或8中任一项所定义的引物对、权利要求7或8的试剂盒或者权利要求9至10中任一项的方法对CTAGlB、CTAG2、MageA3和/或PRAME基因甲基化状态进行测定而被选择进行治疗。
20.权利要求16至19中任一项的方法或用途，其中所述组合物包含CTAG1B、CTAG2、 MageA3和/或PRAME，包含全长CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME，基本上为全长的 CTAGlB、CTAG2、MageA3 和 / 或 PRAME，或者 CTAG1B、CTAG2、MageA3 和 / 或 PRAME 片段，例如 CTAG1B、CTAG2、MageA3 禾口 / 或 PRAME 的肽。
21.权利要求20的方法或用途，其中所述CTAGlB为全长CTAGlB中包括HLA-A2结合基序的片段，其选自肽157-167、157-165和155-163。
22.权利要求20的方法或用途，其中所述CTAGlB为全长CTAGlB中包括一个或多个1 类或2类MHC表位的片段，所述表位选自W02008/089074中所述A31、DRl、DR2、DR4、DR7、 DP4、B35、B51、Cw3、Cw6 禾口 A2。
23.权利要求15至22的方法或用途，其中所述CTAG1B、CTAG2和/或PRAME蛋白、片段或肽与融合伴侣蛋白相连接。
24.权利要求23的方法或用途，其中所述融合伴侣蛋白为蛋白D，其为一种革兰氏阴性菌乙型流感嗜血杆菌的表面蛋白或其衍生物。
25.权利要求23的方法或用途，其中所述融合伴侣蛋白为LytA或其衍生物，所述衍生物包含可见于LytA分子C端始于178位残基的重复部分或基本由其组成或由其组成，或包含188-305位残基。
26.权利要求23的方法或用途，其中所述融合伴侣蛋白为NSl(血细胞凝集素)，或其包含NSl的N端81个氨基酸的衍生物。
27.权利要求15至沈中任一项的方法或用途，其中所述组合物包含编码CTAG1B、 CTAG2和/或PRAME蛋白、片段或肽或其融合蛋白的核酸分子。
28.权利要求27的方法或用途，其中所述核酸分子在表达载体中提供。
29.权利要求15至28中任一项的方法或用途，其中所述含有CTAG1B、CTAG2和/或PRAME蛋白、片段或肽的组合物或者含有核酸的组合物还包含佐剂、免疫刺激性细胞因子和趋化因子中的一种或多种。
30.权利要求四的方法或用途，其中所述佐剂包含单磷酰脂质A或其衍生物、皂苷或其衍生物和TLR9拮抗剂中的一种或多种。
31.权利要求30的方法或用途，其中所述TLR9拮抗剂是含有CpG的寡核苷酸。
32.权利要求四至31中任一项的方法，其中所述佐剂制备在水包油乳剂或油包水乳剂中，任选地包含胆固醇和/或生育酚，或者制备在脂质体组合物中。
33.权利要求9至19中任一项的方法，其中所述基因为MageA3基因，所述样品或肿瘤组织通过细针穿刺活检获得。
全文摘要
包含SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、61、62或63中任一核苷酸序列的寡核苷酸、引物或探针。所述寡核苷酸、引物或探针可用于检测基因的甲基化状态。所述寡核苷酸可用于癌症的诊断和治疗。
文档编号C12Q1/68GK102575284SQ201080021497
公开日2012年7月11日 申请日期2010年3月17日 优先权日2009年3月17日
发明者凯瑟琳·博维耶, 加埃唐·欧托 申请人:MDx健康公司, 葛兰素史克生物公司