专利名称：一种同时检测17个基因的方法
技术领域：
本发明涉及一种同时检测检测17个基因的方法。属于医学分子生物学领域。
背景技术：
近年来，冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary artery disease, CAD)的患病率呈逐年上升趋势，其中相当多比例的患者事先并没有临床症状。冠状动脉粥样硬化只有发展到一定程度并引起心肌缺血时才被临床关注，对冠状动脉粥样硬化的早期诊断，即尚未引起心肌缺血的临床前诊断，无论对于预防冠心病临床事件，还是在高危人群中早期预防性干预治疗，都有重要意义。目前对有高危因素而无临床症状者的冠状动脉粥样硬化情况了解甚少。研究表明血液中血脂的代谢紊乱及炎性因子的变化可导致血管内膜损伤，并逐步发展为动脉粥样硬化。传统的血管造影作为金标准可以观察管腔狭窄程度，但不能评价管壁，不能较好的评价粥样硬化斑块的稳定性，研究表明多数急性冠脉综合征不是因管腔严重狭窄造成的，而主要是由动脉粥样硬化斑块破裂继发血栓造成的(Libby P. Coronary artery injury and the biology of atherosclerosis :inflammation, thrombosis, and stabilization. Am J Cardiol 2000，86 :3J_8J)。斑块的形态、负荷以及进展情况是导致斑块破裂和急性冠脉事件的主要因素(Nissen SE, Tuzcu EM，Schoenhagen P， et al. Effect of intensive compared with moderate lipid-lowering therapy on progression of coronary atherosclerosis :a randomized controlled trial. JAMA 2004,291 :1071-1080)。因此判断斑块的稳定性有必要了解斑块的成分。目前显示斑块成分的主要检查手段包括冠状动脉CT血管成像(Computer Tomography Angiography，CTA)、 iI^ISiiliWitfi^: (Magnetic Resonance Angiography,MRA) ^ifiliW (Intravascular Ultrasound, IVUS)、光学相干断层成像(Optical Coherence Tomography, OCT)等。IVUS 是目前公认的判断冠状动脉粥样硬化斑块成分的金标准。但IVUS是有创检查，需要将可旋转的微型超声探头送入冠状动脉从而获得高分辨力的影像资料，不适合在临床上推广普及。OCT空间分辨率最高(10-20um)，可以显示斑块的成分和纤维帽的厚度，但也是有创检查，为消除红细胞的光散射，在成像过程中需阻断血流，操作过程也有一定要求，且价格昂 it, (Rieber J, Meissner 0， Babaryka, G, et al. Diagnostic accuracy of optical coherence tomography and intravascular ultrasound for the detection and characterization of atherosclerotic plaque composition in ex—vivo coronary specimens -.a comparison with histology. Coronary Artery Disease 2006 ； 17 425-430)。离体冠状动脉MRI可以清晰的显示斑块的成分，但在体冠状动脉MRI由于空间分辨率和时间分辨率低，冠脉成像受呼吸和心脏搏动的影响，难以显示冠脉管壁，因此限制了其在临床的应用。多层螺旋CT(Multi-slice Computed Tomography, MSCT)的出现为无创检查冠状动脉带来了新的希望，尤其是64层螺旋CT和双源CT在时间分辨率和空间分辨率已经有了较大提高，其空间分辨率是0.4mm χ 0.4mm χ 0. 4mm，具有各向同性的优点，且扫描速度快， 允许一次屏气在10秒内显示整个在体冠状动脉树，目前已经广泛应用于临床。Mto等报道了 MSCT在监测动脉粥样硬化斑块进展变化中的作用(Sato Y, Matsumoto N, Inoue F， et al. Computed tomography assessment of the regression of an atherosclerotic coronary artery plaque. Circ J 2005,69:1141-1143)。MSCT 判断斑块的性质主要根据CT值。Schroeder报道脂质斑块的平均CT值为14±^HU，纤维斑块为91 士21HU，钙化斑块为 419士 194HU (Schroeder S, Kopp AF, Baumbach A, et al. Noninvasive detection and evaluation of atherosclerotic coronary plaques with multislice computed tomography. J Am Coll Cardiol 2001,37:1430-1435)。MSCT 能够准确地区分软斑块、纤维斑块和钙化斑块。但是对于有严重钙化的斑块，MSCT由于硬线束伪影和钙化的部分容积效应，可以影响对隐藏在钙化内部的非钙化成分及钙化邻近的非钙化成分的观察。研究表明感染可能是冠心病的重要病因。感染可引起全身的炎症反应，诱发细胞因子如肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-I(IL-I)、白细胞介素-6(IL_6)的升高。 从而造成血管内皮功能异常，促进凝血，加速动脉硬化。Wang YN等的研究发现IL-Ιβ浓度可作为诊断 ACS 的炎症标志物(Wang YN Che SM, Ma AQ, etal. Clinical significance of serum cytokines IL—lbeta, sIL_2R, IL—6,TNF—alpha,and IFN-ν in acute coronary syndrome. Chin Med Sci J2004 Jun ； 19 (2) :120-124)。IL-6 是炎症反应的一个中枢性调节者，可以刺激血管活性物质的释放，诱导纤维蛋白原分泌和肝急性相蛋白(如CRP) 的生成(Hojo Y，Ikeda U，Katsuki T，et al. interleukin6 expression in coronary circulation after coronary angioplasty as a risk factor for restenosis, heart, 2000,84 :83-87)。有研究指出炎症标志物如CRP、IL-6对远期心血管事件具有预测价值 (Marz W, Wieland H. HMG-reductase inhibition :anti inflammatory effects beyond lipid lowering. Herz，2000，25 :117-125)。IL-8 则主要由单核-巨噬细胞产生。在 AS 的早期病变中，MCP-I和IL-8起了重要作用。Aukrust等发现不稳定心绞痛患者MCP-I和 IL-8浓度显著升高，而其抗氧化物和超氧化物水平则分别低于和高于正常(Aukrust P， Berge R K，Ueland T，etal. Interaction between chemokines and oxidative stress possible pathogenic role in acute coronary syndromes. J Am Coll Cardiol,2001 Feb ；37 (2) :485-491)。提示趋化因子与AS病灶的氧化应激之间的相互作用参与了 AS 的病理形成过程。TNF-α来源于各种免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞等。研究发现 TNF-α 参与了冠心病的发生过程(Saadeddin SM et al. Med Sci Monit, 2002,8 (1) =RA 5-12)。PRIME研究发现心绞痛、AMI等事件的发生与ICAM-I的升高有明显相关性(Lug G， AweilerD,EvansA,et al. Circulating soluble adhesion molecules ICAM-I and VCAM-I and incident coronary heart disease :the PRIME Study[J]. Atherosclerosis,2003, 170(1) :169-176)。由于冠状动脉粥样硬化斑块的形成及管腔狭窄，冠状动脉的血流将发生变化。 实验结果显示，血管内血流的变化将导致血管壁亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因表 : 白勺(Pereira AC, Miyakawa AA, Lopes NH, et al. Dynamic regulation of MTHFR mRNA expression and C677T genotype modulate mortality in coronary artery disease patients after revascularization[J]. Thromb Res. 2007,121 (1) :25-32)。
6Peter R等的研究表明外周全血160种基因表达谱的变化和冠心病的严重程度相关(Peter R. Sinnaeve, Mark P. Donahue, Peter Grass, et al. Gene Expression Patterns in Peripheral Blood Correlate with the Extent of Coronary Artery Disease. PLoS ONE. www. plosone. org. September. 2009, Volume 4, Issue 9, e7037)。心血管疾病患处组织不易大量获取用于研究，但是，通过观察全血RNA表达的变化可以为心血管疾病的早期诊断和愈后观察提供新途径。冠心病的形成是多种因素共同作用的结果，无论是我们熟悉的高血压、高血脂、高龄、男性等传统的危险因素还是近年发现的炎症因素、高同型半胱氨酸血症、高尿酸血症等新的危险因素，都是通过流行病学调查进行数据的总结。特别是目前临床上常用影像学征像评价冠状动脉管腔狭窄程度及粥样斑块的形状特征，难以区分斑块的性质及成分。因此利用GeXP高通量分析技术建立一种同时检测17个基因的方法，用于检测斑块的性质及成分，及时预测和评价心血管疾病风险。
发明内容
(一)要解决的技术问题寻找一种微创的检测方法对于心血管疾病的早期诊断具有重要意义。外周血样本相比人体其它组织更容易获得，而且动脉管壁的受损、动脉粥样硬化斑块的形成、粥样硬化斑块的破裂都发生在血液循环的大环境中。外周血流经全身组织器官，必然蕴涵形成冠状动脉粥样硬化斑块的相关信息。近年来有关基因表达谱与动脉粥样硬化之间关系的研究越来越多。因此评价外周血相关基因表达情况有望为评价粥样硬化斑块的性质以及心血管疾病的早期诊断提供有价值的信息。本发明的目的是提供一种同时检测17个基因的方法。我们将采用建立的同时分析17个基因表达的方法分析外周血相关基因的表达情况，以期为评价冠脉粥样硬化斑块提供新的思路。这17个基因是白细胞介素-1 β，血管性血友病因子，白细胞介素-6，亚甲基四氢叶酸还原酶，L-选择素，单核细胞趋化蛋白-1，Y-干扰素， 白细胞介素_8，肿瘤坏死因子-α，泛素，巨噬细胞集落刺激因子，细胞间黏附分子1，DNA结合抑制因子2，血红素加氧酶-1，低密度脂蛋白受体及两个参考基因β-肌动蛋白，人甘油激酶。(二)技术方案本发明每条反向引物在5’末端包含一 19个碱基的通用引物，3’末端包含大约20 个碱基左右与目的基因相互补的通用引物。每条正向引物在5’末端包含一 18个碱基的通用引物，3’末端包含大约20个碱基左右与目的基因相互补的通用引物。为了毛细管电泳能区分开，所有PCR产物设计为相差3个以上碱基。除了感兴趣的15个基因外，每组引物包含2个管家基因和作为外部质控的卡那霉素RNA(Kan RNA)。毛细管电泳后Kan RNA能产生大小为32^ρ的特征峰。此外，对L-选择素设计了两套引物，通过比较产物来检测反应体系的稳定性。本发明所述方法的基本原理为将由多个基因特异引物引发的多重扩增反应转化为只有两条引物引发的通用扩增反应。具体就是在反转录反应中使用基因特异的引物扩增每个目的mRNA。在最初的几个PCR反应中用基因特异的引物扩增。由于在特异引物的5’端连接通用引物，在每一个PCR反应体系中含有高浓度的通用引物，在以后的反应过程中通用引物取代了基因特异的引物。通用引物与反应体系中带有荧光标记的碱基序列互补，扩增产物经毛细管电泳技术分离，不同片段大小的产物对应不同的基因，基因的表达量与荧光值成正比。从而实现同一样本中多个基因的定量分析。(http://www.beckman. com/ products/instrument/geneticanalysis/gexp_inst_dcr. asp)。在多重 PCR 反应体系中存在过高表达的基因和过低表达的基因，通过适当稀释过高表达基因的反转录引物浓度有助于低表达基因产物的检测。本发明所述的方法，它包括下述步骤(1)设计用于扩增含有目的基因的18对反转录引物和PCR引物见表1 (包括15个心血管疾病相关基因，两个管家基因和L-选择素的两套引物共17个基因18对引物)。表1本发明所设计的18对反转录引物和PCR引物
权利要求
1.一种同时检测17个基因的方法，包括下述步骤(1)设计并合成用于扩增17个基因的反转录引物和PCR引物；(2)稀释引物；(3)RNA阳性样本制备，通过单重反应验证每对引物有效；(4)反转录引物的调整及建立多重扩增反应。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测17个基因的方法，其特征在于所述的步骤(1) 中设计用于扩增17个基因的反转录引物和PCR引物序列如下其中，L-选择素设计了两对反转录引物和PCR引物。
3.根据权利要求1所述的一种同时检测17个基因的方法，其特征在于所述的步骤O) 中RT引物浓度为500nmoL/L，PCR引物浓度为200nmoL/L。
4.根据权利要求1所述的一种同时检测17个基因的方法，其特征在于所述的步骤(3) 中将5个冠心病人的RNA与5个正常人的对照RNA混合，先用每对引物做单重反应以确定每对引物有效。
5.根据权利要求1所述的一种同时检测17个基因的方法，其特征在于所述的步骤(4) 中反转录引物的调整浓度如下
全文摘要
本发明涉及一种同时检测17个基因的方法。从PUBMED上查阅白细胞介素-1β(IL-1β，NM_000576)等，人甘油激酶(sapiens glycerol kinase，NM_203391)的mRNA的序列，设计反转录引物和PCR引物，通过反转录、PCR扩增、毛细管电泳，应用Gexp分析系统进行定量分析。本检测方法不仅包含用于监测反应体系的质控基因卡那霉素耐药基因(Kan，R)，而且对L-选择素设计了两个扩增产物，用来检测反应体系的稳定性。本方法具有所需样本量低、灵敏度及准确性高的优点。该方法通过检测外周血相关基因的表达情况来分析动脉粥样硬化斑块的性质及成分，为批量筛选心血管疾病和对照之间的差异基因奠定了技术平台。
文档编号C12Q1/68GK102251036SQ20111018932
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月7日 优先权日2011年7月7日
发明者田亚平, 贾兴旺 申请人:中国人民解放军总医院