一种催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的发酵方法
【专利摘要】本发明涉及一种催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的发酵方法，包括如下步骤：将恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)菌体接种于固体培养基，活化后挑取菌苔在摇床中发酵制备腈水合酶，经光照、温度为30℃，摇床转速200r·min-1，培养96h后得到具有腈水合酶活力的发酵液。本发明的光敏性腈水合酶恶臭假单胞菌菌种，经传统发酵、水合催化合成丙烯酰胺，利用本发明菌株合成的丙烯酰胺水合产物浓度高，减少了浓缩的负担，且无副产物，产品纯度高，适合工业化生产丙烯酰胺。
【专利说明】一种催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的发酵方法
【技术领域】
[0001]本发明属于工业微生物【技术领域】，具体涉及一种催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的发酵方法。
【背景技术】
[0002]丙烯酰胺是一种用途广泛的有机化工原料，以它为单体合成的产品不下百种，其中以聚丙烯酰胺用途最广。聚丙烯酰胺的主要用途是用于油田调整吸水剖面和“三次采油”中，近年来，为适应我国原油“三次采油”对超高分子量聚丙烯酰胺(相对分子质量> 2000万)的需求，丙烯酰胺的生产将有较大的发展。
[0003]丙烯酰胺是以丙烯腈为原料水合而成，从20世纪50年代至今，生产工艺先后经历了硫酸水合、铜系催化的化学水合及微生物腈水合酶生物转化3个发展阶段。1973年，法国研究者Galzy及其研究组发现了一种能催化丙烯腈水合停留在丙烯酰胺的微生物BrevbacteriumR312,从而开始了用微生物生产丙烯酰胺的研究。1985年，日本日东公司建成了世界上第一个微生物法生产丙烯酰胺的工业性装置。上海农药所也在1986年从泰山的土壤中找到了一株产腈水合酶的菌株，并开始了微生物法生产丙烯酰胺的研究。腈水合酶是一种可以把腈化合物的腈基进行水合后转变为酰胺基，制造对应的酰胺化合物的微生物的酶，腈水合酶作为催化剂催化丙烯腈水合成丙烯酰胺的方法正成为主流。与铜系催化法相比，微生物法有许多优点:酶催化反应在常温、常压下进行，提高了生产安全性；丙烯腈的转化率接近100%，不需回收未反应原料；由于省去了铜分离工段，产品中不含铜离子，产品纯度高，特别适合生产超高分子量的聚丙烯酰胺；工艺过程简单，设备投资少，生产经济效益高。微生物法催化生产丙烯酰胺是石油化工骨干产品利用酶催化技术成功的第一范例，具有划时代的意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的发酵方法，本发明的光敏性腈水合酶菌株是一种恶臭假单胞菌，经传统发酵、催化合成丙烯酰胺，利用本发明菌株合成的丙烯酰胺水合产物浓度高，减少了浓缩的负担，无副产物，产品纯度高，适合工业化生产丙烯酰胺。
[0005]本发明所采用的技术方案是:一种催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的发酵方法。
[0006]一:催化剂制备
菌体发酵培养:将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)菌体接种于固体培养基,活化后挑取菌苔在摇床中发酵制备腈水合酶，经光照、温度为30°C,摇床转速200r.mirT1,培养96h后得到具有腈水合酶活力的发酵液，且发酵液的总酶活达800~1200万单位/毫升发酵液；
固体培养基配方为:葡萄糖1%、酵母浸膏0.36%、K2HPO4.3Η200.2 %、NaCl 0.1%, MgSO4?7H20 0.015%，琼脂2%、余量为脱盐水；
发酵培养基配方为:葡萄糖I~3%，酵母浸膏0.5~1%，谷氨酸0.05~0.1%，尿素
0.5 ~1%，K2HPO4.3Η200.03 ~0.1%，KH2PO40.03 ~0.1%，MgSO4.7Η20 0.03 ~0.1%，Fe3+
0.0001~0.003%, pH值7.5~8.5，余量为脱盐水；上述百分比为质量百分比。
[0007]上述发酵过程中添加的Fe3+为FeCl3、Fe2 (SO4) 3、Fe (NO)3中的任意一种。
[0008]上述所述光照条件为培养阶段可见光照射发酵液。
[0009]催化剂悬浮液制备:将发酵液在分离因素> 3000离心分离，去上清液，将细胞悬浮于脱盐水中，配成 菌体细胞与脱盐水体积比为1:100~1:200的催化剂悬浮液备用。
[0010]含有光敏性腈水合酶菌株催化合成丙烯酰胺的方法包括如下步骤:向催化剂悬浮液中缓慢加入丙烯腈，常压，温度为30°c，200r.mirT1的搅拌速度下进行酶催化水合反应，丙烯腈的添加量占反应体系的20~30% (wt)，经过一段时间的反应，获得丙烯酰胺溶液；
本发明所具有的有益效果是:通过在传统发酵培养基中加入Fe3+，并在发酵过程中采用可见光照射发酵液的方法，产生含有腈水合酶的恶臭假单胞菌菌株或其诱变菌株细胞，并将该细胞从培养液中分离制成催化剂悬浮液，催化丙烯腈水合成丙烯酰胺水溶液，丙烯腈的转化率可达99.99%，所获得的丙烯酰胺水溶液经过纳滤、离子交换等工序，即可获得高纯度的丙烯酰胺水溶液。本发明通过在发酵过程中采用光照条件，并在培养基中加入Fe3+，显著提高了腈水合酶的酶活性，将酶活性提高50%以上的同时使发酵的培养周期大大缩短了。利用本发明菌株及催化方法合成的丙烯酰胺水合产物浓度高，减少了浓缩的负担，且无副产物，产品纯度高，适合工业化生产丙烯酰胺。
[0011]本发明中菌株、Fe3+、光照条件互相协调作用才能高效生产含有腈水合酶的恶臭假单胞菌菌株或其诱变菌株细胞，进而催化丙烯腈水合成丙烯酰胺。本发明使用的恶臭假单胞菌菌株及其诱变菌株产生的腈水合酶可将丙烯腈高效转化成丙烯酰胺，其操作过程简单、反应条件温和、对环境污染小、分离提纯简单、丙烯腈转化率高、产品纯度高。
[0012]【具体实施方式】:
实施例1:
(I)、催化剂悬浮液的制取:按前述方法制备催化剂，得含腈水合酶菌株的发酵液。
[0013]发酵培养基:葡萄糖1.5%，酵母浸膏0.5%，谷氨酸0.07%,尿素0.7%，K2HPO4.3Η200.05%, KH2PO40.05%, MgSO4.7Η20 0.05%，Fe3+ 0.001%, pH 值 8，余量为脱盐水；上述百分比为质量百分比。
[0014]通过称量法测定菌株生物量。取IOmL发酵液，在分离因素为3000，离心分离，去上清液，用蒸馏水洗涤三次后，将获得的细胞置于红外干燥箱内，105°C干燥至恒重，取出放入干燥器内，冷却后称量。由上述方法测得的产酶能力为25.3毫克/毫升发酵液。
[0015]采用高压液相色谱法(HPLC)分析丙烯腈及转化产物丙烯酰胺，配制两者的混合溶液做标准曲线，通过外标法定量，测定反应液中腈水合酶活力.由上述方法测得的腈水合酶活力为950u/mL。
[0016]按前述方法制备催化剂悬浮液备用。
[0017](2)、按前述方法催化丙烯腈合成丙烯酰胺，丙烯腈的添加量占反应体系的20%(wt)，经过一段时间的反应，获得浓度为26.75%的丙烯酰胺溶液，丙烯腈转化率99.81%。
[0018]实施例2:(I)、催化剂悬浮液的制取:按前述方法制备催化剂，得含腈水合酶菌株的发酵液。
[0019]发酵培养基:葡萄糖2%，酵母浸膏0.5%，谷氨酸0.075%,尿素0.7%，K2HPO4.3Η200.05%, KH2PO40.05%, MgSO4.7Η20 0.05%, Fe3+ 0.0015%, pH 值 8.4，余量为脱盐水；上述百分比为质量百分比。
[0020]通过上述称量法测定菌株生物量为29.6晕克/毫升发酵液。
[0021]采用高压液相色谱法测得的腈水合酶活力为1207u/mL。
[0022]按前述方法制备催化剂悬浮液备用。
[0023](2)、按前述方法催化丙烯腈合成丙烯酰胺，丙烯腈的添加量占反应体系的25%(wt),经过一段时间的反应，获得浓度为33.5%的丙烯酰胺溶液，丙烯腈转化率99.99%。
[0024]实施例3:
(1)、催化剂悬浮液的制取:按前述方法制备催化剂，得含腈水合酶菌株的发酵液。
[0025]发酵培养基:葡萄糖2%，酵母浸膏0.6%，谷氨酸0.075%,尿素0.75%，K2HPO4.3Η200.05%, KH2PO40.05%, MgSO4.7Η20 0.05%, Fe3+ 0.003%, pH 值 8.4，余量为脱盐水；上述百分比为质量百分比。
[0026]通过上述称量法测定菌株生物量为30.5晕克/毫升发酵液。
[0027]采用高压液相色谱法测得的腈水合酶活力为1000u/mL。
[0028]按前述方法制备催化剂悬浮液备用。
[0029](2)、按前述方法催化丙烯腈合成丙烯酰胺，丙烯腈的添加量占反应体系的30%(wt)，经过一段时间的反应，获得浓度为40.17%的丙烯酰胺溶液，丙烯腈转化率99.93%。
[0030]实施例4:
本实施例在发酵过程中未加入Fe3+，也没有光照条件，以和上述实施例3进行对比。
[0031](I)、催化剂悬浮液的制取:菌体发酵培养:将恶臭假单胞菌体接种于固体培养基，活化后挑取菌苔在摇床中发酵制备腈水合酶，温度为30°C，摇床转速200r.mirT1，培养96h后得到具有腈水合酶活力的发酵液。
[0032]发酵培养基:葡萄糖2%，酵母浸膏0.5%，谷氨酸0.075%,尿素0.7%，K2HPO4.3Η200.05%，KH2PO40.05%，MgSO4.7Η20 0.05%, pH 值 8.4，余量为脱盐水；上述百分比
为质量百分比。
[0033]通过上述称量法测定菌株生物量为13.7晕克/毫升发酵液。
[0034]采用高压液相色谱法测得的腈水合酶活力为289u/mL。
[0035]按前述方法制备催化剂悬浮液备用。
[0036](2)、按前述方法催化丙烯腈合成丙烯酰胺，丙烯腈的添加量占反应体系的30%(wt)，经过一段时间的反应，获得浓度为8.2%的丙烯酰胺溶液，丙烯腈转化率20.4%.。
[0037]本发明与现有技术相比具有以下特点:
现有技术用于催化丙烯腈水合成丙烯酰胺的菌株主要有红球菌属、棒杆菌及其经诱变的菌种。本发明的菌种属于假单胞菌属。该菌株在发酵过程中加入Fe3+，并采用光照的条件时，使该菌种产酶能力大幅度提高，生物量最高达30mg/ml发酵液，而且其单位体积发酵液的总酶活可达1200万单位/毫升发酵液。
【权利要求】
1.一种催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的发酵方法，其特征在于:菌体发酵培养:将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)菌体接种于固体培养基,活化后挑取菌苔在摇床中发酵制备腈水合酶，经光照、温度为30°C，摇床转速200r.mirT1，培养96h后得到具有腈水合酶活力的发酵液，且发酵液的总酶活达800~1200万单位/毫升发酵液；发酵培养基配方为:葡萄糖I~3%，酵母浸膏0.5~1%，谷氨酸0.05~0.1%，尿素0.5~1%，K2HPO4.3Η200.03 ~0.1%，KH2PO40.03 ~0.1%，MgSO4.7Η20 0.03 ~0.1%，Fe3+ 0.0001 ~0.003%, pH值7.5~8.5，余量为脱盐水；上述百分比为质量百分比。
2.权利要求1所述的催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的发酵方法，其特征在于:菌体发酵培养中培养阶段要有可见光照射发酵液。
3.权利要求1所述的催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的发酵方法，其特征在于:所述的Fe3+为FeCl 3' Fe2 (SO4) 3、Fe (NO) 3中的任意一种。
【文档编号】C12P13/02GK103834600SQ201410096647
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月17日 优先权日:2014年3月17日
【发明者】孙安顺 申请人:蔡建华