一组评估乳腺癌风险的突变基因群及其检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一组可用于乳腺癌风险评估的突变基因群及其检测试剂盒，所述突变基因群是包含以下七条基因的突变基因的集合，所述七条基因是：BRCA1基因、BRCA2基因、TP53基因、MLH1基因、MLH3基因、MSH3基因和CDH1基因，所述七条基因的突变基因中总携带25个突变位点，该突变位点如表3所示。本发明还公开了一种评估乳腺癌风险的突变基因群的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：检测本发明所述的突变基因群中的突变基因的探针或引物。本发明提供的评估乳腺癌风险的突变基因群的检测试剂盒具有检测效率高，检测速度快，检出率高等优点。
【专利说明】一组评估乳腺癌风险的突变基因群及其检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一组评估乳腺癌风险的突变基因群及其检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]遗传性乳腺癌最常见病因是BRCAl和BRCA2基因的突变，目前已证实对突变携带者的早期诊断和预防性干预能提高乳腺癌的生存率。但BRCA1/2基因突变只能解释一小部分遗传性乳腺癌的病因，其它在乳腺癌的遗传病因中扮演重要角色的高显性基因还包括TP53、PTEN和⑶Hl等，另外还有很多中显性和低显性基因也能导致遗传性乳腺癌。
[0003]在临床上，很多以乳腺癌为先证者的肿瘤家系中，往往合并各种不同的恶性肿瘤，而不仅仅是乳腺癌和卵巢癌。同时乳腺癌与很多其它遗传性肿瘤综合症的相关性仍不明确，在很多不以乳腺癌为主要表型的遗传性肿瘤综合症中也经常会出现乳腺癌患者(例如:MMR基因)。因此在传统的肿瘤遗传咨询中，在基因检测前先根据先证者以及家族史中肿瘤的不同类型和特征来划分不同的遗传性肿瘤综合症，然后进行相关基因的突变检测以明确病因。这种方法便于确定高危人群，明确易感基因，提高了检测效率，但同样有可能出现遗漏。目前在中国尚没有成熟的肿瘤遗传咨询系统，同时也缺少相关的系统性研究。
[0004]近年来高通量测序技术的飞速发展使同时对多个特定的基因进行序列测定和突变检测成为可能，同时其成本与传统测序技术中单个基因的序列测定相当。然而，如何应用高通量测序技术进行胚系突变的检测对不同家族史中恶性肿瘤类型做出限定，特别是针对亚洲人群和中国人群中家 族型乳腺癌易感基因方面的研究非常有限。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是针对目前评估乳腺癌患病风险的方法较为局限，特别是针对亚洲人群和中国人群中家族型乳腺癌易感基因突变体与乳腺癌患病风险之间关系的研究非常有限的问题，提供了一组评估乳腺癌风险的突变基因群及其检测试剂盒。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为:一组评估乳腺癌风险的突变基因群，所述突变基因群是包含以下七条基因的突变基因的集合，所述七条基因是:BRCAl基因、BRCA2基因、TP53基因、MLHl基因、MLH3基因、MSH3基因和CDHl基因。
[0007]本发明所述突变基因群是由携带突变位点的基因组成。其中所述突变位点为本领域常规的突变位点，较佳地包括indel突变位点(插入或缺失引起的序列改变insertionor deletion, indel)、无义突变位点、拼接区突变位点或错义突变位点,更佳地本发明所述七条基因的突变基因中总携带25个突变位点，该突变位点如表3所示。上述突变位点可以用本领域常规的测序方法检测，所述测序方法较佳地为一代测序方法或二代测序方法，优选地为二代测序方法。
[0008]为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二为:一组评估乳腺癌风险的突变基因群，所述突变基因群是包含以下二十二条基因的突变基因的集合，所述二十二条基因是:BRCA1基因、BRCA2基因、TP53基因、MLHl基因、MLH3基因、MSH3基因、CDHl基因、PALB2 基因、FANCD2 基因、FANCI 基因、SLX4 基因、RAD51C 基因、RAD50 基因、CDKN2A 基因、CYP17AI 基因、RGSLI 基因、FGFR3 基因、WRN 基因、UGTIA4 基因、TNFRSF13B 基因、MUTYH 基因和SPINKl基因。
[0009] 较佳地，所述二十二条基因的突变基因中总携带41个突变位点，该突变位点如表4所示。
[0010]为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三为:一种乳腺癌突变基因，所述乳腺癌突变基因的核苷酸序列是表5所示的22个携带突变位点的基因中的任意一个。
[0011]本发明所述乳腺癌突变基因是指携带有突变位点的基因，所述携带突变位点的突变基因如表5所示。
[0012]为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之四为:一种评估乳腺癌风险的突变基因群的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括:检测如本发明所述的突变基因群中的突变基因的探针以及用于二代测序的试剂。
[0013]本发明提供一组检测本发明所述突变基因群的探针，所述探针是包含能够与本发明所述突变基因群中的全部突变基因发生杂交反应的探针的集合。利用本发明提供的探针，结合二代测序技术，能够检测本发明所述突变基因群中的全部突变基因。
[0014]本发明所述的探针为本领域常规的探针,所述探针较佳地为带有示踪物(或标记物)的寡聚核苷酸片段，只要该探针能与本发明所述的突变基因群中的突变基因杂交即可。本发明所述探针的制备方法为本领域常规制备方法，所述探针的制备方法较佳地包括:采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或其他适宜方法纯化即得。本发明所述探针的设计方法优选地为:选取待测基因的外显子编码区以及侧翼的部分内含子区域，利用 Agilent Sureselect XT Custom Kit (700Kb_34Mb)设计探针。
[0015]其中所述用于二代测序的试剂为本领域常规使用的试剂，只要能够满足对所得序列进行二代测序的要求即可。所述试剂制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为市售可得。
[0016]本发明所述的检测试剂盒更佳地还包括将从检测对象中提取的基因组DNA制成可供测序使用的文库的试剂。
[0017]为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之五为:一种评估乳腺癌风险的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括:扩增本发明所述的突变基因群中突变基因的引物，所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1~SEQ ID N0:96所示。
[0018]为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之六为:一种评估乳腺癌风险的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括:扩增本发明所述的突变基因群中突变基因的引物，所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 152所示。
[0019]本发明提供一组检测本发明所述突变基因群的引物，所述引物是能够扩增出本发明所述突变基因群中的全部突变基因的引物的集合。利用本发明提供的引物，结合一代测序技术，能够检测本发明所述的突变基因群中的全部基因突变。
[0020]本发明所述引物只要能与本发明所述突变基因群中的突变基因部分序列互补，并扩增出本发明所述突变基因群中的突变基因即可，本发明所述引物的序列较佳地为:如序列表中 SEQ ID NO:1 ~SEQ ID NO: 152 所示。[0021]本发明所述引物的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地为人工合成全序列。
[0022]本发明所述检测试剂盒较佳地还包括:dNTP溶液，DNA聚合酶，用于核酸分离或纯化的试剂，阳性对照或阴性对照。
[0023]本发明所述的用于核酸分离或纯化的试剂更佳地为抽提所述检测对象中的基因组DNA的试剂，所述试剂较佳地包括:蛋白酶、饱和酚、氯仿:异戊醇(24:1)、醋酸钠、无水乙醇、70%乙醇、TE溶液等，优选地利用Qiagen公司生产的DNA抽提试剂盒来提取血浆中的DNA以及其它任何可以用于进行DNA提取的试剂或容器。
[0024]本发明所述的阳性对照为本领域常规的阳性对照，较佳地为包含本发明所述突变基因群中突变基因序列的基因组DNA储备液或包含相应突变基因群中突变基因序列的质粒作为阳性对照。
[0025]本发明所述的阴性对照为本领域常规的阴性对照，较佳地为源于健康人经确认不包含突变基因序列的野生型基因组DNA序列储存液。
[0026]本发明所述的检测试剂盒，更佳地还包括从检测对象或肿瘤患者体内提取组织或血液的器械，所述器械较佳地包括:任何能用于取血的釆血针、注射器等。
[0027]本发明所述的检测样本较佳地为来自检测对象的组织,只要能从检测样本中抽提检测对象的基因组DNA即可。所述检测样本较佳地为血液、血浆、组织样本和体液中的一种或几种，更佳地为血液或组织样本，优选地为血液。
[0028]一种本发明所述 检测试剂盒的使用方法，其包括以下步骤:
[0029](I)利用本发明所述检测试剂盒抽取检测对象外周血提取基因组DNA ；
[0030](2)将所得基因组DNA制成可供双端短序列测序、单端长序列测序或单端短序列测序的文库；
[0031](3)对步骤⑵所得DNA测序文库进行测序即得。
[0032]其中步骤(1)所述的抽取检测对象外周的方法为本领域常规方法，较佳地为利用检测试剂盒中的采血针抽取检测对象5ml外周血提取基因组DNA。
[0033]其中所述提取基因组DNA的方法为本领域常规提取基因组DNA的方法，较佳地为利用Qiagen公司生产的DNA抽提试剂盒来提取血浆中的DNA(产品号为57704)。
[0034]其中步骤(2)所述文库的构建方法为本领域常规的文库构建方法，所述文库的构建方法较佳地包括以下步骤:
[0035]将提取的基因组DNA末端补平并进行5’端磷酸化，将30 μ 1DNA、45 μ I纯水、
10μ I 具有 IOmM ATP 的 T4DNA 连接酶缓冲液、4 μ I 包含 IOmM dNTP Mix、5 μ 1T4DNA 聚合酶、I μ IKlenow酶、5 μ I Τ4连接酶混合后，在20°C温浴30分钟(试剂来自Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001)，温浴后釆用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒(part#28104)纯化DNA。末端悬A:将上步的产物溶解在32 μ I缓冲液中，加入Klenow缓冲液5 μ 1，ImMdATPlOy K KlenowE χ ο-3 μ 1，在37°C保持30分钟(试剂来自Illumina样本准备试剂盒)，产物由QIAGEN MinElute PCR纯化试剂盒(part#28004)连接:DNA溶解在10 μ I缓冲液中，加入DNA连接酶缓冲液2 χ 25 μ 1、PE Adapter Oligo MixlO μ 1，DNA连接酶5 μ 1，在20°C保持15分钟(试剂为Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001)，温浴后釆用QIAGENQIAquick PCR纯化试剂盒(part#28104)纯化DNA即得文库。[0036]其中步骤(3)所述测序的方法为本领域常规的测序方法，较佳地为利用IlluminaHiSeq2000测序仪进行二代测序。利用试剂盒中的探针对表1所示基因捕获目标区域的目标基因进行扩增，根据步骤(2)所制备的文库的不同，可以对所得目标基因序列分别进行双端短序列测序、单端长序列测序或单端短序列测序。用Illumina HiSeq2000测序仪进行双端测序。此过程均由仪器本身自动完成。
[0037]本发明所述检测试剂盒的使用方法较佳地还包括步骤(4)，将所得测序结果进行统计分析，利用软件Chromas Vl.45对将所得测序结果DNA片段进行分析即得。
[0038]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0039]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0040]本发明的积极进步效果在于:利用本发明提供的可用于乳腺癌风险评估的突变基因群，结合高通量测序技术，可以实现在全基因组范围内对与遗传性乳腺癌相关基因进行比较研究，特别是对于评估乳腺癌的发生的风险、以及该疾病在发展过程中涉及复杂生物学过程的多基因异常改变现象具有特殊的优势。本发明提供的用于评估乳腺癌风险的突变基因群的检测试剂盒具有检测效率高，检测速度快，检出率高等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]图1为第49号家系 遗传分析图谱。
[0042]图2为第22号家系遗传分析图谱。
【具体实施方式】
[0043]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0044]实施例1中国人群遗传性乳腺癌易感基因的筛选
[0045]材料和方法:
[0046]从2011年6月到2012年7月，在复旦大学附属肿瘤医院就诊的乳腺癌患者中，根据以下入选标准，我们进行连续性入组。
[0047]入选标准为:乳腺癌患者发病年龄< 35岁，同时至少有一名具有血缘关系的亲属也为恶性肿瘤患者；乳腺癌发病年龄> 35岁，但< 50岁，同时至少有2名同一侧(父系或母系)的具有血缘关系的亲属也为恶性肿瘤；乳腺癌发病年龄> 50岁，同时至少有3名同一侧(父系或母系)的具有血缘关系的亲属也为恶性肿瘤。
[0048]通过问卷的方法收集患者的病史和家族史，并收集5ml外周血提取基因组DNA待测，该检测经过复旦大学附属肿瘤医院伦理委员会批准。
[0049]样本处理:样本中基因组利用STAR DNA Blood7k Kit (购买自Hamilton,Germany)进行抽提，具体操作方法请参见该试剂盒的使用说明书。
[0050]将基因组DNA切成片段后进行建库。选取待测基因的外显子编码区以及侧翼的部分内含子区域，利用Agilent Sureselect XT Custom Kit (700Kb_34Mb)(该试剂盒购买自Agilent Technologies公司)设计探针对基因组DNA进行捕获,探针的设计方法请参考该试剂盒的使用说明书。基因捕获目标区域如表1所示:
[0051]表1基因捕获目标区域
[0052]
【权利要求】
1.一组评估乳腺癌风险的突变基因群，其特征在于，所述突变基因群是包含以下七条基因的突变基因的集合，所述七条基因是=BRCAl基因、BRCA2基因、TP53基因、MLHl基因、MLH3基因、MSH3基因和⑶Hl基因。
2.如权利要求1所述的突变基因群，其特征在于，所述七条基因的突变基因中总携带25个突变位点，该突变位点如表3所示。
3.一组评估乳腺癌风险的突变基因群，其特征在于，所述突变基因群是包含以下二十二条基因的突变基因的集合，所述二十二条基因是=BRCAl基因、BRCA2基因、TP53基因、MLHl基因、MLH3基因、MSH3基因、CDHl基因、PALB2基因、FANCD2基因、FANCI基因、SLX4基因、RAD51C 基因、RAD50 基因、CDKN2A 基因、CYP17A1 基因、RGSLl 基因、FGFR3 基因、WRN基因、UGT1A4基因、TNFRSF13B基因、MUTYH基因和SPINKl基因。
4.如权利要求3所述的突变基因群，其特征在于，所述二十二条基因的突变基因中总携带41个突变位点,该突变位点如表4所示。
5.一种乳腺癌突变基因，其特征在于，所述乳腺癌突变基因的核苷酸序列是表5所示的22个携带突变位点的基因中的任意一个。
6.一种评估乳腺癌风险的突变基因群的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括:检测如权利要求1~4中任一项所述的突变基因群中的突变基因的探针以及用于二代测序的试剂。
7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括将检测对象中抽提出的基因组DNA制成可供测序的文库的试剂。
8.一种评估乳腺癌风险的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括:扩增权利要求I或权利要求2所述的突变基因群中突变基因的引物，所述引物的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO:1 ~SEQ ID NO:96 所示。
9.一种评估乳腺癌风险的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括:扩增权利要求3或权利要求4所述的突变基因群中突变基因的引物，所述引物的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO:1 ~SEQ ID NO: 152 所示。
10.如权利要求8或9所述的检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒还包括:dNTP溶液，DNA聚合酶，用于分离或纯化核酸的试剂，阳性对照或阴性对照。
【文档编号】C12N15/11GK103981273SQ201410239196
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月30日 优先权日:2014年5月30日
【发明者】胡震, 杨晓晨, 吴炅, 邵志敏 申请人:复旦大学附属肿瘤医院