专利名称：：含活性尿激酶原的组合物、其冻干方法及冻干制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药领域，具体涉及一种含有活性尿激酶原的药物组合物、其冻干方法及冻干制剂。
背景技术：
：由血栓引起的心血管系统疾病严重威胁着人类健康，临床上急需一种溶栓效果好、副作用小的药物。尿激酶原(Pro-uk)可专一地激活血栓表面的纤溶酶原，进而特异性地溶解血栓，与此同时不会破坏纤溶系统，全身出血的副作用小；经过临床前的动物实验和临床试验验证，Pro-uk还具有使用剂量小、使用安全、溶栓效果好、再栓率低、无过敏反应等优点，是一种安全无毒的、理想的生物类溶栓制剂，具有广阔的市场前景。由于天然材料中Pro-uk含量甚微，难以大量制备，人们从二十世纪八十年代开始就开始采用基因工程技术来生产重组Pro-uk，目前，已经在大肠杆菌(HomesWE，etal.Cloningandexpressionofthegeneforpro-urokinaseinEscherichiacoli.Biotechnology，1985；3923；WinklerME，etal.Purificationandcharacterizationofrecombinantsingle-chainurokinaseproducedinEschericheacoli.Biochemistry，1986；254041)、哺乳动物细胞如小鼠IC9细胞、CHO细胞、Namalwa细胞(NolliML，etal.Productionandcharaterisationofhumanrecombinantsinglechainurokinase-typeplasminogenactivatorfrommousecells.Fibnrinolysis，19893101；NellesL，etal.Characterizationofrecombinanthumansinglechainurokinase-typeplasminogenactivatormutantsproducedbysite-specificmutagenesisofLysine.JBiolChem，1987；2625682；李风知等.人尿激酶原全长cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达.生物工程学报，1991；7114；SatohM，etal.Stableproductionofrecombinantpro-urokinasebyhumanlymphoblastoidNamalwaKJM-1cellsHost-celldependencyoftheespressed-proteinstability.Cytotechnology，1993；1379；SatohM，etal.Efficientexpressionofpro-urokinasebyhumanlymphoblastoidNamalwaKJM-1cellsusingMoloneyretroviralpromoter.Cytotechnology，1996；18167)和昆虫细胞(徐杨等.人尿激酶原cDNA在昆虫杆状病毒真核表达系统中的高效表达.生物化学杂志，1993；6709)、骨髓瘤细胞(WeaverWD，etal.Newrecombinantglycosylatedprourokinasefortreatmentofpatientswithacutemyocardialinfarction.JAmCollCardiol，1994；241242)等中都获得了很高的表达并进行了纯化。Pro-uk制剂极不稳定，容易被多种蛋白酶切割成尿激酶(UK)，同时，在液体状态下，即使低温保存也会自动分解(于芳等，重组尿激酶原半成品的稳定性观察，军事医学科学院院刊，2000，24(1)70)；另外，由于实验室测定、临床使用以及日常运输和贮存的需要，通常需要采用干燥的方法稳定其活性防止降解。
发明内容为了解决现有技术中尿激酶原制剂不稳定的问题，本发明的发明人通过长期研究，获得了一种含有活性尿激酶原的组合物，与现有的尿激酶原制剂相比，本发明的组合物可以长期稳定保存。本发明另一方面提供了该尿激酶原组合物的制备方法。本发明药物组合物含有适量的Pro-uk、赋形剂和缓冲溶液和盐类。其中，赋形剂可为糖类和/或多元醇，可选择蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、山梨醇、麦芽糖等中的一种或多种，其中优选甘露醇，因为甘露醇冻干的产品无论从外观形态还是冻干时间都优于其它赋形剂，而且甘露醇已在临床使用多年，价格也较便宜，因此，选择甘露醇可以缩短产品的冻干时间，提高冻干效率，降低成本。甘露醇含量的优选范围为6％-12％(重量/体积比)，从经济角度考虑，最优选6％(重量/体积比)；缓冲液可以为磷酸盐缓冲液和/或Tris-HCl，其中磷酸盐缓冲液的含量的优选范围为8-25mmol/L，Tris-HCl含量的优选范围为0.005-0.015mol/L；在该组合物中，其中的盐类可以为氯化钠，氯化钠含量的优选范围为0.03-0.20mol/L；Pro-uk可以为任何可能的浓度，但为了冻干和医疗上使用的方便，优选浓度范围为1.5-5.5mg/ml。另外，在上述组合物中，如果添加保护剂则可得到更好的冻干效果，保护剂可为蛋白质，优选白蛋白，白蛋白在组合物中含量的优选范围为1.5-7.5‰(重量/体积比)。需要说明的是上述药物组合物中的Pro-uk可按现有技术的方法制备，但并不限于这些方法；溶液可按一般溶液的配制方法配制，但为防止Pro-uk的降解，最好在低温下配制，配制时动作应温和。本发明还提供了含活性Pro-uk的组合物溶液的冷冻干燥方法，该方法包括以下步骤将分装好的Pro-uk产品放入预先降温至-35℃～-45℃的冻干机，预冻2-4h，然后开始抽真空，进行首次升温至-25℃～-30℃，当瓶内水分基本升华后进行第二次升温，使其温度上升至25℃～35℃，稳定后保持0.5h～1.5h，即可结束冻干。生物制品干燥的方法很多，但多数可使蛋白质变性。而冷冻干燥技术利用冷冻的溶液在低温低压条件下，从冻结状态不经过液态直接升华除去水分完成干燥。冷冻干燥技术可以很好地保持药物原有的理化性质和生理活性，且有效成分损失极少。此外，冻干制剂特有的疏松多孔结构，可以使药物易于重新复水而恢复活性，而且冻干制剂含水量低，易于长期保存。因此，冷冻干燥是临床和实验室保存蛋白产品的最佳方法之一。本发明的含活性Pro-uk的药物组合物采用以上方法冻干后，获得了活性Pro-uk的冻干制剂。该冻干制剂外观良好，在-20℃和4℃贮存条件下，保存3年活性无变化；通过加速贮存试验对冻干制剂在不同条件下的长期稳定性进行观察，对贮存寿命进行了估算，结果如下Pro-uk活性损失50％的情况下Pro-uk冻干制剂在37℃可存放173d，25℃存放2.78年，4℃存放70.8年，0℃存放118年；活性损失10％时，Pro-uk冻干制剂在37℃可存放20d，25℃存放100d，4℃存放7.6年，0℃存放11年，足以满足Pro-uk实验室和临床贮存的需要。附图1Pro-uk活性降解速度曲线。附图2Pro-uk的贮存寿命曲线。具体实施例方式以下是实施本发明的具体实施方案的例证。实施例仅用于说明发明的目的，并非意在以任何方式限制本发明的范围。实施例一尿激酶原的制备(参见中国专利重组人糖基化尿激酶原的制备方法，公告号CN1062016C，公告日2001年2月14日)(1)尿激酶原基因的克隆和表达载体的构建采用肉豆寇酯(PMA)诱导Detroit562细胞，提取细胞总RNA，构建cDNA文库，通过筛选获得了含有编码尿激酶基因片段的阳性克隆株，得到人尿激酶原全长cDNA基因，通过多步基因重组技术操作，将表达尿激酶原和二氢叶酸还原酶基因的两个转录单位置于同一载体，分别受金属硫蛋白(MT)和SV40早期启动子控制。(2)转染和筛选高效表达的CHO工程细胞将20-40μgpMTSV-du质粒DNA通过磷酸钙共沉淀法转染CHO-dhfr-细胞，先用HAT选择培养基筛选，10天后换成含1-3×10-8MMTX的选择培养基进行dhfr和MTX双重筛选，并对表达有尿激酶原活性的阳性转化细胞经多次亚克隆和MTX加压扩增基因，锌离子诱导，最终筛选到能高效表达尿激酶原的细胞株。(3)CHO工程细胞的培养和放大采用微载体(Cytopore)灌流培养技术和低血清培养基高密度培养表达尿激酶原的工程细胞株，得到含尿激酶原的原料。(4)重组人尿激酶原的纯化采用四步法，即CM阳离子层析、MPG吸附层析、SephacrylS-200凝胶过滤和对氨基苯甲脒层析，即可得到纯品尿激酶原。实施例二Pro-uk组合物的真空冷冻干燥经分离纯化后的Pro-uk纯品2mg/ml，加甘露醇至6％(重量/体积比)，白蛋白至3‰(重量/体积比)，磷酸盐缓冲液浓度至10mmol/L，氯化钠浓度至0.05mol/L，分装到1ml的安瓿瓶中，放入预先降温至-40℃的冻干机，预冻3h，然后开始抽真空，进行首次升温至-30℃，当瓶内水分基本升华后进行第二次升温，使其温度上升至30℃，稳定后保持1h，即可结束冻干。实施例三Pro-uk组合物的真空冷冻干燥经分离纯化后的Pro-uk纯品4mg/ml，加甘露醇至6％(重量/体积比)，白蛋白至3‰(重量/体积比)，磷酸盐缓冲液浓度至10mmol/L，氯化钠浓度至0.10mol/L，分装到1ml的安瓿瓶中，放入预先降温至-40℃的冻干机，预冻3h，然后开始抽真空，进行首次升温至-30℃，当瓶内水分基本升华后进行第二次升温，使其温度上升至30℃，稳定后保持1h，即可结束冻干。实施例四Pro-uk组合物的真空冷冻干燥经分离纯化后的Pro-uk纯品5mg/ml，加甘露醇至10％(重量/体积比)，白蛋白至7‰(重量/体积比)，磷酸盐缓冲液浓度至20mmol/L，氯化钠浓度至0.20mol/L，分装到1ml的安瓿瓶中，放入预先降温至-40℃的冻干机，预冻4h，然后开始抽真空，进行首次升温至-30℃，当瓶内水分基本升华后进行第二次升温，使其温度上升至35℃，稳定后保持1h，即可结束冻干。实施例五Pro-uk组合物的真空冷冻干燥经分离纯化后的Pro-uk纯品2mg/ml，加甘露醇至6％(重量/体积比)，白蛋白至3‰(重量/体积比)，磷酸盐缓冲液浓度至20mmol/L，氯化钠浓度至0.20mol/L，分装到1ml的安瓿瓶中，放入预先降温至-40℃的冻干机，预冻3h，然后开始抽真空，进行首次升温至-30℃，当瓶内水分基本升华后进行第二次升温，使其温度上升至30℃，稳定后保持1h，即可结束冻干。实施例六Pro-uk组合物的真空冷冻干燥经分离纯化后的Pro-uk纯品2mg/ml，加甘露醇至6％(重量/体积比)，白蛋白至3‰(重量/体积比)，Tris-HCl缓冲液浓度至0.10mol/L，氯化钠浓度至0.05mol/L，分装到1ml的安瓿瓶中，放入预先降温至-40℃的冻干机，预冻3h，然后开始抽真空，进行首次升温至-30℃，当瓶内水分基本升华后进行第二次升温，使其温度上升至30℃，稳定后保持1h，即可结束冻干。实施例七不同浓度赋形剂和保护剂对Pro-uk冻干制剂形态及活性的影响经分离纯化后的Pro-uk纯品2mg/ml，加磷酸盐缓冲液浓度至10mmol/L，氯化钠浓度至0.05mol/L，并加不同浓度赋形剂和保护剂以评价它们对pro-uk冻干制剂形态及活性的影响。Pro-uk的活性测定采用改良的琼脂糖-纤维蛋白溶解圈法(参见XiaoC，HuangZ，LinF，etal.Highdensitycultivationofgenetically-engineeredCHOcelllinewithmicrocarrierculturesystem.ChinMedSciJ，1994，9(2)71-74)。以下未具体说明，则活性测定均采用同样方法。表一不同浓度赋形剂和保护剂对pro-uk冻干制剂形态及活性的影响N＝3++外观形态好，活性损失小；+外观形态好；-不成形实施例八缓冲液类型、缓冲液浓度及氯化钠的浓度对Pro-uk冻干制剂外形的影响含有不同的缓冲液和氯化钠浓度的Pro-uk产品，加入7％的甘露醇、5‰的人血白蛋白使其完全溶解后装入小瓶，每瓶1ml，放入冻干箱内进行冷冻干燥，待干燥完毕后，取出产品进行外观检查，可以看出含有磷酸缓冲液(PB)、Tris-HCl的Pro-uk制剂外观疏松，形态良好(见表二)，加水后溶解迅速而完全、透明度好，立即恢复原来的性状。表二不同缓冲液浓度对pro-uk冻干产品外观形态的影响N＝4++外观形态良好；+外观形态好；-不成形实施例九Pro-uk冻干制剂的稳定性观察经分离纯化后的Pro-uk纯品2mg/ml，加甘露醇至6％(重量/体积比)，白蛋白至3‰(重量/体积比)，磷酸盐缓冲液浓度至10mmol/L，氯化钠浓度至0.05mol/L，分装到1ml的安瓿瓶中，按实施例二的方法冻干。pro-uk冻干制剂放入-20℃、4℃、25℃和37℃下保存，并定期(1月、3月、6月、9月、12月、15月)对其活性的稳定性进行观察。可见在-20℃和4℃下保存，其活性无变化；而在25℃和37℃下保存，其活性分别下降37％和81％(见表三)。表三Pro-uk保存在-20℃、4℃、25℃和37℃时的活性(IU/ml)实施例十Pro-uk冻干产品的加速贮存试验经分离纯化后的Pro-uk纯品2mg/ml，加甘露醇至6％(重量/体积比)，白蛋白至3‰(重量/体积比)，磷酸盐缓冲液浓度至10mmol/L，氯化钠浓度至0.05mol/L，分装到1ml的安瓿瓶中，按实施例二的方法冻干。加速试验采用Greiff等(GriffD，etal，Anacceleratedstoragetestforpredictingthestabilityofsuspensionofmeaslesvirusdriedbysublimationinvacuo.JImmunol，1965；94395)报道的多点等温稳定性试验(MIS)，将冻干后的Pro-uk小瓶分别置于60℃(20瓶)、70℃(12瓶)、80℃(5瓶)的水浴中，每间隔24h从3种不同温度水浴中取一瓶，测pro-uk的活性(表五)。表五MIS试验尿激酶原测定结果数据处理与Greiff等介绍的方法大致相同，将不同温度贮存后测得的Pro-uk效价的对数与各效价相对应的时间、贮存时间的对数与各相对应的Pro-uk活性降解的对数分别输入计算机，即可求出不同贮存时间时Pro-uk活性降解速度〔K1〕分别为-0.068、-0.161和-0.443，其降解速度曲线如附图1。通过该曲线可计算出Pro-uk冻干制剂在37℃、25℃、4℃和0℃时的降解速度分别为-0.00608、-0.00169、-0.00016和-0.00011。据降解速度K1和各K1值相对应的Pro-uk活性降解10％或50％所需的时间，绘制Pro-uk的贮存寿命估算曲线，依据上述两条曲线即可对Pro-uk冻干制剂活性的降解速度和贮存寿命进行估算依据MIS试验计算出Pro-uk冻干制剂在60℃、70℃和80℃贮存时，其活性损失50％时所需时间为6.27d、1.92d和0.48d；活性损失10％时所需时间为0.8d、0.2d和0.04d，并由此可绘制出Pro-uk的贮存寿命曲线(附图2)。由此曲线可估算出Pro-uk活性损失50％的情况下Pro-uk冻干制剂在37℃可存放173d；25℃存放2.78年，4℃存放70.8年，0℃存放118年。同样根据此方法也可推测出活性损失10％时，Pro-uk冻干制剂在37℃可存放20d，25℃存放100d，4℃存放7.6年，0℃存放11年。权利要求1.一种尿激酶原组合物，含有适量的尿激酶原、赋形剂、缓冲溶液和盐类。2.权利要求1所述的组合物，其中还包括保护剂。3.权利要求1或2所述的组合物，其中尿激酶原含量为1.5-5.5mg/ml。4.权利要求2所述的组合物，其中所说的保护剂是浓度为1.5‰-7.5‰(重量/体积比)的白蛋白。5.权利要求1或2所述的组合物，其中的赋形剂是糖类和/或多元醇。6.权利要求6所述的组合物，其中的糖类和/或多元醇选自甘露醇、蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、山梨醇、麦芽糖中的一种或几种。7.权利要求1或2所述的组合物，其中的缓冲溶液是磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。8.权利要求1或2所述的组合物，其中的盐类是浓度为0.03-0.20mol/L的氯化钠。9.权利要求1至8中任意组合物的冷冻干燥方法，该方法包括以下步骤i)取权利要求1至8的任意组合物，放入预先降温至-35℃～-45℃的冻干机，预冻2-4h；ii)然后开始抽真空，升温至-25℃～-35℃；iii)当容器内水分基本升华后进行第二次升温，使其温度上升至-25℃～-35℃，稳定后保持0.5h～1.5h。10.由权利要求9的方法制备得到的尿激酶原冻干制剂。全文摘要本发明涉及医药领域，具体涉及一种含有活性尿激酶原的药物组合物、其冻干方法及冻干制剂。文档编号A61K9/19GK1730098SQ20041005800公开日2006年2月8日申请日期2004年8月6日优先权日2004年8月6日发明者姜燕,胡铁强,肖成祖申请人:上海天士力药业有限公司