专利名称：重组融合Tat人源细胞球蛋白及其在治疗肝癌中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及重组融合Tat人源细胞球蛋白；本发明还涉及所述融合蛋白在治疗肝癌中的应用；本发明还涉及所述融合蛋白在抗氧化中的应用。
背景技术：
肝癌是一种产生于肝脏的癌症，是世界上五大癌症之一，死亡人数居所有癌症的 第四位。肝癌的发生率逐年递增，并且这种增长是世界范围的，包括了发达国家和发展中国 家。2000年新增了 564，000病例，其中包括男性癌症中的7. 5%和女性癌症中的2.5%。全 世界每年新增62万多例肝癌患者，其中55%发生在中国。鉴于如此严峻的形势，大力开展 对肝癌的研究刻不容缓。细胞球蛋白(Cytoglobin，Cygb)，是近几年来在脊椎动物中发现的六配位血红素 球蛋白(hxHb)超家族中的新成员，在多种生物及组织中表达。已有多项研究初步表明，细 胞球蛋白Cygb可能与癌症的发生有关。食管癌、肺癌及结肠癌等恶性肿瘤中，Cygb的表达 常常是被抑制的；通过基因治疗的方法表达Cygb，能够抑制肺癌细胞的正常生长。Tat是近年研究较深入的细胞穿膜肽，通过与生物大分子(如核酸或蛋白质)的融 合，能够使融合蛋白转导真核细胞膜并进入细胞内。发明人通过构建基因工程菌pET22b-Tat-Cygb/大肠杆菌Ε. coli. BL21，筛选高表 达Tat-Cygb菌株，分离纯化鉴定得到高纯度重组Tat-Cygb。利用体外肝癌增殖实验，研究 了 Tat-Cygb抗肝癌细胞的功能，探讨了 Tat-Cygb在抗肝癌方面的作用。本发明所述重组 融合Tat人源细胞球蛋白(Tat-Cygb)及其在治疗肝癌和抗氧化中的应用，迄今尚未见有相 关报道。
发明内容
本发明提供了一种重组融合Tat人源细胞球蛋白(Tat-Cygb)；本发明还提供了所述重组融合Tat人源细胞球蛋白在治疗肝癌中的应用；本发明还提供了所述重组融合Tat人源细胞球蛋白在抗氧化中的应用。本发明所述的重组融合Tat人源细胞球蛋白，系由细胞膜穿透肽Tat和人源细胞 球蛋白Cygb组成，其分子量为23kDa。本发明所述重组融合Tat人源细胞球蛋白Tat-Cygb的制备步骤如下(1)采用基因工程的方法，构建高效表达重组融合Tat人源细胞球蛋白的基因工 程菌 pET22b-Tat-Cygb/E. coli. BL21 (DE3)；(2)基因工程菌经大量培养，离心得到菌体沉淀经反复冻融后，重悬得粗蛋白提取 液，上清总蛋白分别经CM-S印hadex CL-6B离子交换柱层析、Amicon Ultra-15超滤管浓缩 并脱盐纯化，得到高纯度重组融合Tat人源细胞球蛋白，通过Western Blotting，鉴定纯化 后重组融合Tat人源细胞球蛋白的准确性。
本发明还包括，用本发明的融合Tat人源细胞球蛋白作为药物活性成分制备的药 物组合物。本发明的药物组合物，根据需要可以含有药学上可接受的载体，其中所述重 组融合Tat人源细胞球蛋白作为药物活性成分，其在制剂中所占重量百分比可以是 0.01-99. 99%，其余为药物可接受的载体。本发明的药物组合物，以单位剂量形式存在，所 述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒，口服液的每瓶，颗粒剂的每 袋，注射剂的每支等。
图1重组Tat-Cygb蛋白的纯化图2重组Tat-Cygb蛋白的凝胶电泳图3重组Tat-Cygb蛋白穿膜活性的测定图4重组Tat-Cygb蛋白抗H202细胞氧化应激损伤功能
图5重组Tat-Cygb预处理抗H202细胞氧化应激损伤功能图6重组Tat-Cygb对SMMC-7721细胞增殖影响图7重组Tat-Cygb抗SMMC-7721细胞增殖功能研究图8重组Tat-Cygb抗BEL-7402细胞增殖功能研究
具体实施例方式通过以下具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限制。《实施例 1》、重组Tat-Cygb的制备及其生物学特性(1)采用基因工程的方法构建高效表达重组Tat-Cygb的基因工程菌 pET22b-Tat-Cygb/ 大肠杆菌 E. coli. BL21 (DE3)；(2)基因工程菌经大量培养后，离心得到菌体沉淀经反复冻融后，重悬得粗蛋白提 取液，上清总蛋白分别经CM-S印hadex CL-6B离子交换柱层析及Amicon Ultra-15超滤管 浓缩及脱盐纯化，得到高纯度重组Tat-Cygb蛋白；(3)重组Tat-Cygb蛋白的特性检测。重组Tat-Cygb原核表达载体的构建提取含Cygb基因[专利号200510094205]的质粒，经PCR后将Tat基因与Cygb 基因连接，得到约720bp左右的条带，。回收Tat-Cygb基因PCR产物与表达载体pET22b均 经内切酶Nde I /EcoR I双酶切后，将两双酶切产物连接并电泳鉴定，将连接产物经过菌落 PCR和EcoR I /Nde I双酶切鉴定，证明表达载体pET22B-Tat-Cygb构建成功。接下来将 重组的连接产物pET22b-Tat-Cygb转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞并涂平板，挑取多个单 克隆接种到含氨卞青霉素Amp (50 100μ g/ml)的LB液体培养基中，37°C，238rpm过夜培 养，提取质粒pET22b-Tat-Cygb，通过菌落PCR及DNA测序证实质粒中含有正确的目的基因 Tat-Cygb，确定重组Tat-Cygb表达载体构建正确。 重组Tat-Cygb的诱导表达及纯化 将所得质粒转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3)并挑取阳性克隆，经菌落PCR鉴定。 取pET22b-Tat-Cygb/E. coli BL21高表达基因工程菌接种到含25 μ g/ml Amp的LB液体培养基中，于37°C，238r · mirT1摇床过夜培养，转接至含Amp的乳糖诱导FML培养基中，与上同样条件下继续诱导培养12 16h，诱导获得得Tat-Cygb蛋白。菌液离心后获得总蛋白 沉淀并在4°C和-20°C中反复冻融2 3次，然后用lOmmol/L Tris-HCl缓冲液按照质量比 1 10溶解沉淀，11000rpm，4°C离心获得可溶性上清总蛋白。上清总蛋白以流速5ml/min上样到平衡至OD28tl基线的CM-S印hadex CL-6B离子交 换层析柱中，上样完毕后，首先用不含盐的lOmmol/LTris-HCl缓冲液(pH8. 0)洗脱到OD28tl 基线，然后依次用含NaCl浓度为100mM、500mM的10mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8. 0)洗脱。 从含500mM的IOmmol/L Tris-HCl缓冲液(ρΗ8· 0)洗脱时出现蛋白峰(图1中约230min)， 通过电泳检测发现此峰蛋白Tat-Cygb纯度较高，。将收集到的目的蛋白峰加入超滤管Amicon Ultra-15 (NMWL 3kDa)中，4°C 4000g/ min离心30min，浓缩目的蛋白。将浓缩后蛋白用pH 7. 220mM Tris-HCl稀释后，重复离心 浓缩，反复3次，完成脱盐。经过电泳检测，可发现蛋白即为目的Tat-Cygb蛋白(图2。纯 化 Tat-Cygb 的 western blot 鉴定经纯化后脱盐的样品蛋白峰首先经过15% SDS-PAGE电泳，转PVDF膜进行Western blot检测，表明重组蛋白Tat-Cygb分子量为23kDa，与预期相符，说明粗蛋白经过多步层析 最后获得了很高纯度的目的重组蛋白Tat-Cygb，且该蛋白能与Cygb抗体结合。利用BCA法测定其蛋白浓度，根据标准曲线方程计算，可以得出纯化的重组蛋白 Tat-Cygb 的浓度为 3426 μ g/ml。根据愈创木酚法测定纯化Tat-Cygb的过氧化物酶活性单位，波长470nm处反应体 系每min吸光度A值变化0. 01定义为一个过氧化物酶活性单位(U/mg · mirT1)。得出纯化 Tat-Cygb的过氧化物酶活性单位为695. 3U/mg · mirT1，与Cygb的酶活力690. 0U/mg · mirT1 没有明显区别。纯化的Tat-Cygb穿膜活性测定肝细胞经含10 μ mol/1 Tat-Cygb蛋白的无血清培养基作用Ih (图3. C)，对照组 经ΙΟμπιοΙ/l Cygb蛋白的无血清培养基作用Ih(图3.Β)，空白组为无血清培养基作用(图 3.Α)。PBS洗涤3次，每次5min。利用抗体进行免疫细胞化学，并经DAB显色。从图3. A中 可看出，只加无血清培养基作用的肝细胞上带有略微的淡棕黄色，说明肝细胞中存在内源 性Cygb蛋白，与文献报道的细胞质和细胞核中均存在Cygb的结论一致。从图3. B中可以 看出经过Cygb处理后，肝细胞着色与空白组相比变化不大，表明细胞内的Cygb表达水平 与空白对照接近，说明细胞内Cygb的含量变化不大。虽然肝细胞经Cygb作用，但细胞内的 Cygb并无明显增多，说明Cygb无法穿透细胞膜进入进入到肝细胞中。从图3. C中可以看 出，经过Tat-Cygb处理后，与空白组相比，肝细胞着色程度明显变深许多，说明肝细胞里面 含有的Cygb量比其自身表达水平高，且明显高于Cygb对照组，显示穿膜肽Tat-Cygb有较 好的穿膜活性。《实施例二》重组Tat-Cygb抗细胞氧化损伤功能研究将Chang Liver接种于96孔板中，待细胞贴壁后，开始实验处理。实验分为空 白对照组，模型组(H2O2处理组)，实验组(Tat-Cygb作用组，终浓度为0. 5 μ mol/L)，对照 组(Cygb作用组，终浓度为0. 5 μ mol/L)，每组设立6个平行孔，实验组和对照组分别加入 Tat-Cygb和Cygb的同时用H2O2处理(800 μ mol/1，6h)，模型组只用H2O2处理。
模型组Chang Liver细胞经800 μ mol/1 H2O2处理6h后产生明显细胞毒性，RGR 下降至(45. 40士7. 77) %；0. 5 μ mol/L重组Cygb能保护Chang Liver并显著降低H2O2对细 胞的毒性，RGR 增加至(119. 53士 11. 00) % (P < 0. 01) ；0. 5 μ mol/L 重组 Tat-Cygb 也能发 挥抗氧化作用，RGR增加至(91. 93士 13. 03) % (P < 0. 01)。证明重组Tat-Cygb和Cygb都 能明显减轻H2O2对细胞的氧化应激损伤(图4)。
*重组Tat-Cygb预处理抗H2O2细胞氧化应激损伤功能研究将人正常肝细胞Chang Liver接种于96孔板中，待细胞贴壁后，开始实验处理。实 验分为空白对照组，模型组(H2O2处理组)，实验组(Tat-Cygb作用组，终浓度为0. 5 μ mol/ L)，对照组(Cygb作用组，终浓度为0. 5 μ mol/L)，每组设立6个平行孔，实验组和对照组分 别加Tat-Cygb和Cygb进行预处理，然后用H2O2处理(800 μ m, 6h)，模型组只用H2O2处理。模型组Chang Liver细胞经600 μ mol/1 H2O2处理6h后产生明显细胞毒性， RGR下降至(73. 71 士 17. 37) % ；Cygb预处理组能略微降低H2O2对细胞的毒性，RGR为 (81. 14士7. 87) % ；Tat-Cygb 能明显降低 H2O2 对细胞的毒性，RGR 为(90. 36士 13. 25) % (P < 0. 05)。证明重组Tat-Cygb预处理后，能明显减轻H2O2对细胞的氧化应激损伤，效果优 于Cygb组(图5)。《实施例三》重组Tat-Cygb对肝癌细胞增殖影响研究*重组Cygb对SMMC-7721细胞增殖的影响将肝癌细胞系SMMC-7721接种于96孔板中，待细胞贴壁后，开始实验处理。实验 分为空白对照组，实验组(Tat-Cygb作用组，终浓度分别为0. 005，0. 05，0. 5，5 μ mol/L)，每 组设立6个平行孔，作用24h。0. 005 μ mol/L 作用组 RGR 为(103. 81 士6. 22) % ；0. 05 μ mol/L 作用组 RGR 为 (103. 35士 1. 43) % ；0. 5μ mol/L 作用组 RGR 为(103. 07士3. 82) % ;5μ mol/L 作用组 RGR 为 (106. 81 士7. 80) %。说明重组Tat-Cygb并不会对SMMC-7721的增殖产生明显作用(图6)。*重组Tat-Cygb抗SMMC-7721细胞增殖功能研究将肝癌细胞系SMMC-7721接种于96孔板中，待细胞贴壁后，开始实验处理。实验 分为空白对照组，实验组(Tat-Cygb作用组，终浓度分别为0. 5，1，2. 5，5 μ mol/L)，阴性对 照组(Tat-EGFP作用组，终浓度分别为0. 5，1，2. 5，5 μ mol/L)，每组设立6个平行孔，作用 24h。Tat-EGFP(表皮生长因子)对细胞的增殖没有明显作用，而低浓度的Tat-Cygb 能抑制细胞增殖，
,高浓度的Tat-Cygb对细胞的增殖则作用不大[5 μ mol/L Tat-Cygb 作用组RGR 为 103. 35士9. 27) %, 5 μ mol/L Tat-EGFP 作用组RGR 为(90. 28士8. 28) % ](图 7)。*重组Tat-Cygb抗BEL-7402细胞增殖功能研究将肝癌细胞系BEL-7402接种于96孔板中，待细胞贴壁后，开始实验处理。实验 分为空白对照组，实验组(Tat-Cygb作用组，终浓度分别为0. 5，1，2. 5，5 μ mol/L)，阴性对照组(Tat-EGFP作用组，终浓度分别为0. 5，1，2. 5，5 μ mol/L)，每组设立6个平行孔，作用 24h (图 8)。
从图7、8可以看出，经过作用24h后，Tat-EGFP作用组与空白对照相比细胞数略 微减少，而Tat-Cygb作用组细胞略多，对于BEL-7402细胞并没有类似SMMC-7721细胞抑制 的作用。
权利要求
一种重组融合Tat人源细胞球蛋白Tat-Cygb，它是由细胞膜穿透肽Tat与人源细胞球蛋白Cygb抗体组成的，其分子量为23kDa。
2.制备权利要求1所述重组融合蛋白Tat-Cygb的方法，具体包括以下步骤(1)采用分子生物学及基因工程方法，构建基因工程重组菌pET22b-Tat-Cygb/ Ε. coli. BL21 ；(2)培养后，经离心得到菌体沉淀，反复冻融后，重悬得粗蛋白提取液，上清总蛋白分别 经CM-S印hadex CL-6B离子交换柱层析及AmiconUltra_15超滤管浓缩与脱盐纯化，得到高 纯度重组Tat-Cygb蛋白。
3.权利要求1所述重组球蛋白Tat-Cygb的药物组合物，是以所述重组球蛋白 Tat-Cygb为药物活性成分，与药学上可接受的载体所组成。
4.权利要求1所述重组融合蛋白Tat-Cygb在制备抗肝癌药物中的应用。
5.权利要求1所述重组融合蛋白Tat-Cygb在制备减轻细胞氧化损伤药物中的应用。
6.权利要求1所述重组融合蛋白Tat-Cygb在制备提高细胞抗氧化能力药物中的应用。
7.权利要求3所述组合物在制备抗肝癌药物中的应用。权利要求3所述组合物在制备减轻细胞氧化损伤药物中的应用。
8.权利要求3所述组合物在制备提高细胞抗氧化能力药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种重组融合Tat人源细胞球蛋白Tat-Cygb及其在抗肝癌细胞及细胞抗氧化中的应用，所述重组融合蛋白Tat-Cygb，系通过构建基因工程菌pET22b-Tat-hCygb/E.coli.BL21(DE3)，筛选高表达重组融合Tat人源细胞球蛋白菌株，分离纯化鉴定得到高纯度融合蛋白Tat-Cygb。
文档编号A61K47/48GK101863985SQ20101020298
公开日2010年10月20日 申请日期2010年6月18日 优先权日2010年6月18日
发明者施伟杰, 许瑞安 申请人:许瑞安