脂质体制剂的制作方法

脂质体制剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及脂质体疫苗组合物、其制备方法及使用其在动物中刺激免疫反应的方法。所述组合物包含由二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱("DMPC")、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油("DMPG")或二肉豆蔻酰基三甲基铵丙烷("DMTAP")或DMPC和DMTAP两者、和至少一种甾醇，以及抗原多肽形成的脂质体，所述抗原多肽包含第一多肽序列和与所述第一多肽序列异源的第二多肽序列，所述第二多肽序列包含得自膜蛋白的跨膜序列，所述跨膜序列具有足以跨过脂质双层的多个残基，经预测其至少九个连续残基形成具有约0.7或更高的疏水性评分的α螺旋。
【专利说明】脂质体制剂
[0001]相关申请案
[0002]本发明要求2011年4月26日提交的美国临时专利申请号61/479，302的优先权，所述临时专利申请据此整体(包括所有表格、附图和权利要求书)并入本文。
[0003]发明背景
[0004]关于联邦政府资助研究的声明
[0005]按照美国国家过敏症和传染病研究所(NIH)资助号U01A1074508和1R43A1078654的条款规定，美国政府拥有本发明的已付清许可以及在有限情况下要求专利所有人就合理条款许可他人的权利。
[0006]提供以下对发明背景的讨论仅仅是为了有助于读者理解本发明，并不承认描述或构成本发明的现有技术。
[0007]脂质体是由一个(“单层”)或多个(“多层”)磷脂层形成的囊泡。由于磷脂基本单元的两亲特性，脂质体通常包含呈现出亲水外表面并封闭亲水芯的亲水层。脂质体在结合亲水/疏水组分中的多能性、它们的无毒性质、生物降解性、生物相容性、佐剂性、诱导细胞免疫、持续释放特性以及被巨噬细胞的迅速摄取使得它们成为具有吸引力的用于递送抗原的候选物。
[0008]已证实脂质体可 同时诱导对大部分细菌、原虫、病毒和肿瘤细胞抗原的体液和细胞介导的免疫。虽然一直期待脂质体疫苗的广泛使用，但是此类疫苗很少得到商业开发。月旨质体的免疫佐剂作用取决于许多结构特性。此类特性包括脂质体呈递的抗原的三维构象，这种构象可能并不总是模拟抗原的天然构象。
[0009]例如，HIV gp41的膜近侧区(MPR)(由跨膜域N端的大约35个氨基酸构成的片段)已被视为可取的疫苗靶点，因为它在病毒分支中高度保守并且对于病毒-细胞融合必不可少。然而，在引发有用的免疫反应中迄今为止的努力尚未取得成功，并且尝试呈递结构约束性表位(偶联到载体蛋白或接枝到重组构建体上)尚未得到中和抗体。除了缺乏关于表位结构的一致性外,MPR相对弱的免疫原性还可导致对重组包膜免疫原的免疫反应，所述重组包膜免疫原针对掩蔽MPR以避免抗体识别的gp41上的免疫优势区。
[0010]此外，在形成脂质体前将抗原与脂质体相关联的方法通常将抗原暴露于洗涤剂和/或有机溶剂。相比之下，在形成之后将抗原与脂质体相关联的方法会将脂质体暴露于不利的化学处理。脂质体还可被网状内皮系统和巨噬细胞快速清除，从而降低脂质体作为疫苗的效率。
[0011]此外，此类特性还可以包括在体内控制囊泡命运的因素。在形成脂质体前将抗原与脂质体相关联的方法通常将抗原暴露于洗涤剂和/或有机溶剂。相比之下，在形成之后将抗原与脂质体相关联的方法会将脂质体暴露于不利的化学处理。脂质体可被网状内皮系统和巨噬细胞快速清除，从而降低脂质体作为疫苗的效率。
[0012]本领域仍然需要可提供脂质体疫苗的方法和组合物，所述脂质体疫苗以可用于刺激免疫反应的方式递送抗原。
[0013]发明概述[0014]本发明的目的是提供脂质体组合物、其制备方法及其使用方法。此类组合物可用作疫苗制剂以刺激动物中的免疫反应。
[0015]在一个方面，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含:
[0016]a)水性媒介物；以及
[0017]b)脂质体，所述脂质体包含:
[0018]⑴二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱(“DMPC” )、
[0019](ii) 二肉豆蘧酰磷脂酰甘油(“DMPG”)、二肉豆蘧酰基三甲基铵丙烷(“DMTAP”)或DMPG和DMTAP两者、
[0020](iii)至少一种甾醇；以及
[0021]iv)抗原多肽序列，以及
[0022]包含天然存在的异源膜蛋白的跨膜序列或从天然存在的异源膜蛋白衍生的跨膜序列的第二多肽序列，所述第二多肽序列具有足以跨过脂质双层的多个残基，经预测其至少九个连续残基形成具有约0.7或更高的疏水性评分的α螺旋，
[0023]其中所述抗原多肽序列直接或间接偶合到所述第二多肽序列的N端或C端以提供水溶性融合多肽，并且其中融合多肽的抗原多肽序列展示在脂质体的外表面上。[0024]在此上下文中的术语“约”是指给定测量值的+ / -10%。
[0025]出于本发明的目的，多肽序列的α螺旋性和疏水性使用Esienberg等，J.Mol.Biol.(1984) 179:125-142的方法采用以下参数进行计算:9的窗口大小、边缘100%的相对权重、线性权重差异以及如下氨基酸量表值:
[0026]Ala:0.620 Arg:_2.530 Asn:_0.780 Asp:_0.900 Cys:0.290 Gln:-0.850Glu:-0.740
[0027]Gly:0.480 His:-0.400 lie:1.380 Leu:1.060 Lys:-1.500 Met:0.640 Phe:
1.190
[0028]Pro:0.120 Ser:_0.180 Thr:_0.050 Trp:0.810 Tyr:0.260 Val:1.080.[0029]如上所述，合适的疏水序列通常具有跨过脂质双层的足够长度(约15-30个残基；更优选地约18-25个残基)，经预测其至少9个连续残基形成具有约+0.7的疏水性(Esienberg评分)的α螺旋。
[0030]在前述某些实施方案中，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含:
[0031]a)水性媒介物；以及
[0032]b)脂质体，所述脂质体包含:
[0033]⑴二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱(“DMPC” )、
[0034](ii) 二肉豆蘧酰磷脂酰甘油(“DMPG”)、二肉豆蘧酰基三甲基铵丙烷(“DMTAP”)或DMPG和DMTAP两者、
[0035](ill)至少一种甾醇；以及
[0036]iv)包含含有M2胞外域的至少10个连续残基的第一多肽序列的抗原多肽，所述序列经修饰以移除天然存在于所述M2胞外域中的一个或多个半胱氨酸残基，以及
[0037]包含天然存在的异源膜蛋白的跨膜序列或从天然存在的异源膜蛋白衍生的跨膜序列的第二多肽序列，所述第二多肽序列具有足以跨过脂质双层的多个残基，经预测其至少九个连续残基形成具有约0.7或更高的疏水性评分的α螺旋，[0038]其中所述抗原多肽序列直接或间接偶合到所述第二多肽序列的N端或C端以提供水溶性融合多肽，并且其中融合多肽的抗原多肽序列展示在脂质体的外表面上。
[0039]如本文所用的术语“M2胞外域”是指衍生自IAV M2蛋白的多肽，其包含得自天然或共有M2蛋白序列胞外域的至少10个氨基酸残基，并且不含M2蛋白跨膜域的全部或一部分，所得的M2胞外域多肽因而可溶于水性介质。
[0040]天然IAV M2蛋白序列的实例包括:
[0041]
【权利要求】
1.一种组合物，其包含: 水性媒介物；和 脂质体，所述脂质体包含: (i) 二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)、 (?) 二肉豆蘧酰磷脂酰甘油(“DMPG”)、 二肉豆蘧酰基三甲基铵丙烷(“DMTAP”)或DMPG和DMTAP两者、 (iii)至少一种甾醇；以及 iv)包含T细胞抗原序列的第一多肽序列，以及 包含天然存在的异源膜蛋白的跨膜序列或从天然存在的异源膜蛋白衍生的跨膜序列的第二多肽序列，所述第二多肽序列具有足以跨过脂质双层的多个残基，经预测其至少九个连续残基形成具有约0.7或更高的疏水性评分的α螺旋， 其中所述抗原多肽序列直接或间接偶合到所述第二多肽序列的N端或C端以提供水溶性融合多肽，并且其中所述融合多肽的抗原多肽序列展示在所述脂质体的外表面上。
2.一种组合物，其包含: 水性媒介物；和 脂质体，所述脂质体包含: 二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)、 二肉豆蘧酰磷脂酰甘油(“DMPG”)、 二肉豆蘧酰基三甲基铵丙烷(“DMTAP”)或DMPG和DMTAP两者、 至少一种留醇；以及 抗原多肽，所述抗原多肽包含: 含有甲型流感M2胞外域的至少10个连续残基的第一多肽序列，所述序列经修饰以移除天然存在于所述M2胞外域中的一个或多个半胱氨酸残基，以及 包含来自膜蛋白的跨膜序列的与甲型流感M2异源的第二多肽序列， 包含与甲型流感M2异源的天然存在的异源膜蛋白的跨膜序列或从所述天然存在的异源膜蛋白衍生的跨膜序列的第二多肽序列，所述第二多肽序列具有足以跨过脂质双层的多个残基，经预测其至少九个连续残基形成具有约0.7或更高的疏水性评分的α螺旋， 其中所述第一抗原多肽序列直接或间接偶合到所述第二多肽序列的N端或C端以提供水溶性融合多肽，并且其中所述融合多肽的所述第一多肽序列展示在脂质体的外表面上。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中DMPC、DMPG/DMTAP和甾醇的相对百分比为50% 至 98% 的 DMPC: 1% 至 25% 的 DMPG/DMTAP: 1% 至 25% 的甾醇。
4.根据权利要求1或2所述的组合物，其中DMPC、DMPG/DMTAP和甾醇的相对百分比为70% 至 98% 的 DMPC: 1% 至 15% 的 DMPG/DMTAP: 1% 至 15% 的甾醇。
5.根据权利要求1或2所述的组合物，其中DMPC、DMPG/DMTAP和甾醇的相对百分比为70% 至 85% 的 DMPC: 5% 至 15% 的 DMPG/DMTAP: 10% 至 15% 的甾醇。
6.根据权利要求1或2所述的组合物，其中DMPC、DMPG/DMTAP和甾醇的相对百分比为约75%的DMPC、约10%的DMPG/DMTAP和约15%的甾醇。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述脂质体包含DMPG。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述脂质体不含DMTAP。
9.根据权利要求1-8之一所述的组合物，还包含选自以下的一种或多种另外的组分:肽聚糖、脂肽、脂多糖、单磷酰脂A、脂磷壁酸、瑞喹莫德、咪喹莫特、鞭毛蛋白、含未甲基化CpG基序的寡核苷酸、α -半乳糖神经酰胺、胞壁酰二肽、全反式维甲酸、双链病毒RNA、热休克蛋白、二(十八烷基)二甲基溴化铵、阳离子表面活性剂、toll样受体激动剂、二肉豆蘧酰基三甲基铵丙烷和nod样受体激动剂。
10.根据权利要求1-9之一所述的组合物，其中所述组合物包含选自以下的甾醇:胆固醇、胆固醇氯甲酸酯、豆留醇、谷留醇、麦角固醇、羊毛留醇、链留醇和菜油甾醇。
11.根据权利要求1-10之一所述的组合物，其中所述第一多肽序列包含得自SEQIDNO: 1-9之一的第2-22位残基的至少10个连续残基。
12.根据权利要求1-10之一所述的组合物，其中所述第一多肽序列包含得自SEQIDNO: 10-12之一的至少10个连续残基。
13.根据权利要求1-12之一所述的组合物，其中一个或多个半胱氨酸残基通过使目标半胱氨酸残基突变成另一残基或在所述目标半胱氨酸残基之前截短胞外域序列而从甲型流感M2胞外域序列移除。
14.根据权利要求1-10之一所述的组合物，其中所述第一多肽序列包含得自SEQIDNO: 13-15之一的至少10个连续残基。
15.根据权利要求1-10之一所述的组合物，其中所述第一多肽序列包括SEQIDNO:16。
16.根据权利要求1-15之一所述的组合物，其中所述第二多肽序列包括通过选自以下的蛋白编码的跨膜序列:细胞色素b5、粘蛋白-4β链、转铁蛋白受体、TNFRSF13B、氨肽酶N、二肽基肽酶4、肿瘤坏死因子突触融合蛋白3、BclXL和R9AP。
17.根据权利要求1-15之一所述的组合物，其中所述第二多肽序列包含得自SEQIDNO: 17-25之一的至少10个连续残基。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述第二多肽序列包括通过细胞色素b5蛋白编码的跨膜序列。
19.根据权利要求16所述的组合物，其中所述第二多肽序列包括通过SEQIDNO:26-42之一编码的跨膜序列。
20.根据权利要求1、3-10或16之一所述的组合物，其中所述第一多肽序列包括选自SEQ ID NO:60-81的一个或多个序列。
21.一种使动物免疫的方法，所述方法包括: 通过肠胃外途径向所述动物施用根据权利要求1-20之一的组合物。
22.—种制备根据权利要求1或2的脂质体组合物的方法，其包括: 重组表达或通过化学方法合成所述抗原多肽，其中所述抗原多肽在非变性条件下为单体形式； 将所述抗原多肽纯化到水溶液中； 向包含所述抗原多肽的所述水溶液添加包含(i)DMPC、(ii)DMPG、DMTAP或DMPG和DMTAP两者以及(iii)至少一种留醇的脂质混合物； 干燥所述抗原多肽和脂质混合物；以及 对所述干燥的抗原多肽和脂质混合物在存在水性媒介物的情况下进行超声处理以形成脂质体。
23.—种编码融合蛋白的分离的核酸序列，所述序列包含: 编码硫氧还蛋白的第一核酸序列； 编码目标多肽序列的第二核酸序列；以及 编码天然存在的异源膜蛋白的跨膜序列或从天然存在的异源膜蛋白衍生的跨膜序列的第三核酸序列，所述第二多肽序列具有足以跨过脂质双层的多个残基，经预测其至少九个连续残基形成具有约0.7或更高的疏水性评分的α螺旋， 其中所述核酸序列被构造成使得在表达所述核酸时，硫氧还蛋白在所述跨膜序列的N端表达。
24.根据权利要求2 3所述的分离的核酸序列，还包含可操作地连接到编码所述融合蛋白的所述核酸序列的表达控制序列。
25.根据权利要求23或24所述的分离的核酸序列，还包含编码亲和标记的一个或多个另外的核酸序列。
26.根据权利要求23-25之一所述的分离的核酸序列，还包含编码蛋白酶裂解位点的一个或多个另外的核酸序列。
27.根据权利要求23-26之一所述的分离的核酸序列，其中对所述分离的核酸序列的至少一部分进行密码子优化以在宿主细胞中表达。
28.根据权利要求27所述的分离的核酸序列，其中对所述分离的核酸序列的至少一部分进行密码子优化以在大肠杆菌中表达。
29.根据权利要求23-28之一的分离的核酸序列，其中所述第二核酸序列编码抗原序列、多肽靶向配体或融合多肽序列。
30.根据权利要求23-29之一所述的组合物，其中所述第三核酸序列编码通过选自以下的蛋白编码的跨膜序列:细胞色素b5、粘蛋白-4β链、转铁蛋白受体、TNFRSF13B、氨肽酶N、二肽基肽酶4、肿瘤坏死因子突触融合蛋白3、BclXL和R9AP。
31.根据权利要求23-29之一所述的组合物，其中所述第三核酸序列包含得自SEQIDNO: 17-25之一的至少10个连续残基。
32.根据权利要求30所述的组合物，其中所述第三核酸序列包括通过细胞色素b5蛋白编码的跨膜序列。
33.根据权利要求30所述的组合物，其中所述第三核酸序列包括通过SEQIDNO: 26-42之一编码的跨膜序列。
34.一种宿主细胞，其通过根据权利要求23-33之一所述的分离的核酸转化。
35.一种获得目标多肽序列的方法，其包括: 表达由得自权利要求34所述的宿主细胞的分离的核酸序列编码的融合蛋白。
36.根据权利要求35所述的方法，还包括将所述表达的融合蛋白的全部或一部分纯化到水溶液中。
37.根据权利要求36所述的方法，还包括向包含所述纯化蛋白的所述水溶液添加包含(i)DMPC、(ii)DMPG、DMTAP或DMPG和DMTAP两者以及(iii)至少一种甾醇的脂质混合物； 干燥所述纯化的蛋白和脂质混合物；以及 对所述干燥的纯化蛋白和脂质混合物在存在水性媒介物的情况下进行超声处理以形成脂质体。
【文档编号】A61K39/00GK103747797SQ201280026044
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2012年4月25日 优先权日:2011年4月26日
【发明者】G·藤井, W·A·恩斯特, J·阿德勒-摩尔, L·维茨安 申请人:分子表达公司