一种调控干细胞分化及促进体内骨生成的钛合金表面改性方法
【专利摘要】本发明公开一种调控干细胞分化及促进体内骨生成的钛合金表面改性方法。首先通过多巴胺偶联将带负电荷的明胶固定在Ti6Al4V（TC4）材料表面，将其作为引发层引发层层自组装程序。其次，利用层层自组装技术在明胶修饰的TC4表面构建壳聚糖－明胶－BMP2多层膜。最后，壳聚糖－明胶－BMP2多层膜修饰的TC4材料表面沉积一层纤粘蛋白分子，从而构建出一种能调控干细胞分化和促进体内骨生成的钛合金界面细胞微环境。
【专利说明】一种调控干细胞分化及促进体内骨生成的钛合金表面改性方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医用材料领域，涉及一种功能性材料界面的构建方法。
【背景技术】
[0002]细胞微环境是由溶性信号(如生长因子等)和非溶性信号(激素)等多种蛋白和糖蛋白组成的复杂的网络体系。在材料表面构建所需的细胞外微环境是新一代生物材料的研究的重要方向。近年来，研究人员都期望通过在生物材料表面构建细胞外微环境调控细胞的生物学响应。目前，通过不同技术手段，多种活性分子包括天然衍生细胞外基质(ECM)蛋白、脂质体、细胞垫、细胞粘附分子等被固定到生物材料表面以期模拟细胞外微环境。
[0003]理想的骨植入体应具备两个特点:第一，材料表面能募集成骨细胞或骨祖细胞并促进细胞粘附；第二，材料表面能提供适宜的生物活性分子(生长因子或细胞因子)促进细胞增殖及诱导细胞分化进而促进新骨生成。目前，骨植入体材料制备领域，尚有较大的研究的空间。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是构建一种调控干细胞分化及促进体内骨生成的钛合金界面细胞微环境。
[0005]为实现本发明目 的而采用的技术方案是这样的，一种调控干细胞分化及促进体内骨生成的钛合金表面改性方法，包括以下步骤:
[0006]I)通过多巴胺偶联将带负电荷的明胶固定在钛合金材料TC4的表面，获得经明胶修饰的TC4 ；
[0007]2)在步骤I)所获得的经明胶修饰的TC4表面构建壳聚糖、明胶和骨形态发生蛋白BMP2依次重叠的多层膜，得到经过多层膜修饰的TC4 ；
[0008]3)采用物理吸附的方式，在步骤2)所获得的经多层膜修饰的TC4表面沉积一层纤粘蛋白分子。
[0009]进一步，步骤I)的具体过程是:先将多巴胺溶于Tris缓冲溶液中，配置成浓度为2mg/mL的多巴胺溶液；再将钛合金材料TC4沉浸于所述多巴胺溶液中；最后取出经过多巴胺浸泡的钛合金材料TC4，将其用二蒸水润洗后，浸泡在明胶溶液中，获得经明胶修饰的TC4。
[0010]进一步，步骤2)的具体过程是:
[0011]a)配置浓度为I~10mg/mL的壳聚糖溶液、浓度为I~10mg/mL的明胶溶液和浓度为0.5~5 μ g/mL的BMP2溶液；
[0012]b)用二蒸水润洗步骤I)得到的经明胶修饰的TC4 ;按时间先后顺序执行c~f步骤；
[0013]c)将TC4置于壳聚糖溶液中，浸泡5~15min后取出，用二蒸水润洗；[0014]d)将TC4置于明胶溶液中，浸泡5~15min后取出，用二蒸水润洗；
[0015]e)将TC4置于BMP2溶液中，浸泡5~15min后取出，用二蒸水润洗；
[0016]f)将TC4置于明胶溶液中，浸泡5~15min后取出，用二蒸水润洗；
[0017]g)重复步骤c~f若干次，在明胶修饰的TC4表面构建壳聚糖一明胶一BMP2 -……多层膜。
[0018]进一步，步骤3)的具体过程是:配置浓度为0.5~5μ g/mL的纤粘蛋白溶液，将步骤2)所获得的经多层膜修饰的TC4浸泡在纤粘蛋白溶液中0.5~2h后取出，用二蒸水润洗2次，即将纤粘蛋白沉积到经多层膜修饰的TC4表面。
[0019]值得说明的是，本发明的目的是提高钛及钛合金植入体与天然骨组织之间的骨整合性，在植入体表面构建预期的微环境来模拟天然细胞外基质能够促进植入体的骨整合。在先前的研究中，我们运用层层自组装技术将壳聚糖及明胶被组装到钛材表面。研究证实钛材表面的壳聚糖/明胶多层膜能够提高钛膜的生物相容性。然而，这种简单的细胞外基质对自然组织的被动性响应，在诱导骨生成应用方面有一定的局限性。理想的骨植入体应具备两个特点:第一材料表面能募集成骨细胞或骨祖细胞并促进细胞粘附；第二材料表面能提供适宜的生物活性分子(生长因子或细胞因子)促进细胞增殖及诱导细胞分化进而促进新骨生成。
[0020]基于上述研究，我们在Ti6A14V表面构建类ECM样微环境，将骨形态发生蛋白(BMP2)及纤粘蛋白(FN)组装到壳聚糖/明胶多层膜修饰的Ti6A14V表面。一方面，BMP2是一种维持骨动态平衡的生长因子，不但能促进间充质干细胞的增殖、迁移及分而且能诱导体内骨生成。另一方面，纤粘蛋白(主要的ECM蛋白质)能介导细胞在生物材料表面的初始粘附。当植入体植入体内后，细胞与材料接触时，我们期望通过FN及BMP2调控髓腔中骨髓间充质干细胞的粘附及分化级联响应行为。另外，生物活性因子(如BMP2)暴露于外界环境中时，易于变性或降解失去活性。研究证实，LbL多层膜在温和的环境中能维持药物/蛋白的生物活性。多层膜可以避免BMP2等活性因子直接暴露于外界环境中。
[0021]因此，本专利所设计的BMP2杂化多层膜修饰的TC4可控制BMP2的释放并调控MSCs的粘附及分化，从而促进TC4植入体的骨整合。
[0022]本发明还公开一种通过上述方法获得的调控干细胞分化及促进体内骨生成的钛合金材料。
[0023]本发明的有益效果在于:该方法具有操作简单、成本低廉、通用性强，不需要特殊设备。利用该方法制备的能够调控间充质干细胞的粘附与分化，并促进植入体的骨整合，在骨疾病治疗、骨移植技术中有重要的临床应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1接触角检测，偶数层为明胶；3，7，11，19，27，31层为壳聚糖；5,9, 13，17，21，29 为 BMP2 ;32 层为 FN ;除第 I 层的 TC4 基材(n=3)；
[0025]图2TC4/LbL/BMP2表面沉积FN的激光共聚焦显微镜图片(黑白图，原图在实质审查参考资料中提交)；
[0026]图3纯TC4扫描电镜图；
[0027]图4TC4/LbL/BMP2/FN 扫描电镜图；[0028]图5BMP2及明胶分别从TC4/LbL/BMP2/FN及TC4/LbL中的累积释放曲线。
[0029]图6骨髓间充质干细胞在不同底物表面培养21天后骨钙素的表达，η=4, **ρ〈0.01。
[0030]图7TC4及TC4/LbL/BMP2/FN植入4周及12周后植入体周围骨密度，n=3。
【具体实施方式】
[0031]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主题范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的保护范围内。
[0032]本实施例中，首先通过多巴胺偶联将带负电荷的明胶固定在Ti6A14V (TC4)材料表面，将其作为引发层引发层层自组装程序。之后，利用层层自组装技术在明胶修饰的TC4表面构建壳聚糖一明胶一 BMP2……多层膜。最后，在多层膜修饰的TC4材料表面沉积一层纤粘蛋白分子，从而构建出一种能调控干细胞分化和促进体内骨生成的钛合金界面细胞微环境。
[0033]在制备过程中，诸多因素可以影响钛合金界面细胞微环境的构建，例如固定引发层明胶的多巴胺溶液的浓度、活性因子的使用浓度、聚阳离子壳聚糖及聚阴离子明胶的沉积浓度及沉积时间等，不同的制备方法可得到具有不同形貌特征的钛材界面细胞微环境。本实施例对多层膜修饰的过程进行了考察。结果显示，当多巴胺的浓度为2mg/mL的时候，能较好的将明胶固定在钛合金TC4表面。当壳聚糖和明胶的浓度为5mg/mL，BMP2浓度为2 μ g/mL时在钛合金表面沉积IOmin的时候，可制备成多层膜修饰的钛合金即TC4/LbL/rhBMP2。当FN浓度为2 μ g/mL时在多层膜修饰的钛合金表面沉积Ih的时候，能得到调控干细胞分化及促进体内骨生成的钛合金界面细胞微环境。
[0034]实施例1:调控干细胞分化及促进体内骨生成的钛合金界面细胞微环境的制备
[0035]a.明胶的固定:将适量多巴胺溶于Tris缓冲溶液(10mM，pH8.5)中，配置成浓度为2mg/mL的多巴胺溶液。将Ti6A14V (TC4)沉浸于多巴胺溶液中，避光过夜，即避光静止存放12h。用二蒸水润洗TC4样本。随后，将多巴胺处理过的TC4样本浸泡在明胶溶液(5mg/mL, pH7.4)中，静置过夜，即避光静止存放12h。
[0036]b.BMP2多层膜修饰的钛合金TC4的制备:首先，配置溶液。壳聚糖溶液(5mg/mL)由 0.3% 醋酸配置。明胶(5mg/mL)由 PBS(pH7.4)配置。rhBMP2 (2 μ g/mL)溶液由 IOOmM醋酸钠(pH5.1)溶液配置。用二蒸水润洗明胶修饰过的TC4样本，润洗3次。将明胶修饰的TC4样本依次浸泡于壳聚糖(5mg/mL)、明胶(5mg/mL)、rhBMP2 (2 μ g/mL)及明胶(2mg/mL)……溶液中，在每种溶液中浸泡lOmin，更换浸泡溶液前，用双蒸水润洗TC4两次，每次lmin。上述步骤进行后，在明胶修饰的TC4表面构建壳聚糖一明胶一 BMP2……多层膜，即所期望的(Gel/Chi/Gel/rhBMP2)n多层膜组装到TC4表面。一个实施例中，η = 3，即将明胶修饰的TC4样本依次浸泡于壳聚糖(5mg/mL)、明胶(5mg/mL)、rhBMP2 (2 μ g/mL)、明胶(2mg/1^)、壳聚糖(511^/1]10、明胶(5mg/mL)、rhBMP2 (2 μ g/mL)、明胶(2mg/mL)、壳聚糖(5mg/mL)、明胶(5mg/mL)、rhBMP2 (2 μ g/mL)和明胶(2mg/mL)溶液中，得到(Gel/Chi/Gel/rhBMP2) 3 多层膜修饰的TC4。
[0037]c.FN的沉积:将纤粘蛋白沉积到(Gel/Chi/Gel/rhBMP2)n多层膜修饰的TC4表面。首先，用PBS(pH7.4)配置纤粘蛋白(Fibronectin，FN)溶液，浓度为2μ g/mL。将(Gel/Chi/Gel/rhBMP2)n多层膜修饰的TC4样本浸泡在FN溶液2μg/mL中，37°C静置lh。用二蒸水润洗2次，即可完成能调控干细胞分化及促进体内骨生成的钛合金界面细胞微环境的构建，样本记为 TC4/LbL/rhBMP2/FN。
[0038]用接触角检测监控钛合金TC4表面多层膜的构建。如图1所示，从低6层开始，接触角约为45度，42度，41度及36度，分别对应于明胶、壳聚糖、明胶及BMP2为最外层时的接触角大小。后续多层膜组装后接触角也产生了类似的交替变化规律。结果表明明胶、壳聚糖及BMP2多层膜已经沉积到TC4表面。经过上述c步骤处理后纤粘蛋白以物理吸附的方式沉积到TC4/LbL/BMP2表面。利用单克隆抗体免疫荧光方法检测纤粘蛋白分布。激光共聚焦观察表明绿色荧光均匀地分布于TC4/LbL/BMP2/FN表面(图2)。表明纤粘蛋白已经成功沉积到TC4表面。未经任何处理的钛材表面及实例a-d各个步骤处理后的钛材表面的扫描电镜图分别为图3和图4 ;从图中可看出，纯TC4表面比较粗糙(图3 )，这是由抛光处理造成的。多层膜覆盖后，TC4/LbL/BMP2/FN表面相对平滑且出现细小的粒状结构(图4)。结果表明多层膜结构已在TC4表面形成。
[0039]实验例1:钛合金界面细胞微环境调控活性因子的释放
[0040]本研究考察BMP2活性因子从钛合金界面细胞微环境中的释放动力学。
[0041]用ELISA试剂盒间断性的检测BMP2从多层膜中的累积释放行为。首先，将实施例1所制备的样本(TC4/LbL/BMP2/FN)及仅明胶/壳聚糖多层膜修饰的TC4 (TC4/LbL)分别置于0.5mL PBS溶液中，放置37°C。在预定时间点，取出50 μ L培养液后加入等量体积的新鲜PBS溶液。用ΒΜΡ2定量ELISA试剂盒检测TC4/LbL/BMP2/FN释放的BMP2量。用BCA检测试剂盒检测TC4/LbL中释放的明胶量。
[0042]如图5所示，BMP2与明胶有类似的释放曲线。在24h内BMP2及明胶均出现轻微的暴释现象。在初始2h内约30%BMP2释放出来，24h后达到50%。这与暴露在多层膜周围的BMP2直接释放到PBS溶液中相关。14天后，TC4表面的多层膜结构中仍存在约16%的BMP2。结果表明随着钛合金TC4表面多层膜的降解，BMP2长时间内持续释放。
[0043]实验例2:钛合金界面细胞微环境调控干细胞的分化
[0044]选取实施例1制备而得到的样本，考察材料表面骨髓间充质干细胞所产生的骨钙素水平。首先将第四代原代培养的骨髓间充质干细胞接种在不同的钛合金及TCPS表面。培养21天后，收集培养基。用骨钙素检测试剂盒培养液中骨钙素的含量，表示为ng/mL。骨钙素由处于矿化阶段高度分化的成骨细胞表达，是成骨细胞分化的晚期标志。如图6所示，与TC4及TC4/LbL相比，TC4/LbL/BMP2/FN表面的MSCs所表达的骨钙素明显并有显著性差异((P〈0.01))。结果表明具有细胞微环境的钛合金界面有利于诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化并促进细胞的矿化。
[0045]实验例3:钛合金 界面细胞微环境诱导体内骨生成
[0046]选取实施例1制备而得到TC4/LbL/rhBMP2/FN圆棒样本，并其与未经任何处理TC4圆棒植入成熟新西兰兔子(平均体重为2.5-3Kg)的股骨骨端。用静脉注射苯巴比妥钠麻醉兔子。将兔子手术部位剃毛消毒后，切开皮肤(约3cm)暴露股骨骨端。用直径为3cm长度为13mm的手术电转在兔子股骨骨端转孔。将不同的样本插入转孔中。最后缝合皮肤，并对手术部位消毒。植入4周及12周后，用静脉注射空气将兔子处死。用10%甲醛固定含有植入体的股骨样本48h。用Mmiro-CT进行扫描,并用软件mimicl0.1进行分析,骨密度大小表不为 Hounsfield units。
[0047]如图7显示了 Micro-CT扫描后植入体周围新骨的密度。Micro-CT可以有效地观察骨的内部结构及新生骨。如图4所示，植入体周围骨密度随着时间的增加而增加。更重要的是，TC4/LbL/BMP2/FN周围骨密度在4周及12周时均显著高于对照组TC4。研究表明具有细胞微环境的钛合金界面(TC4/LbL/BMP2/FN)比未经处理的钛合金而言在诱导新骨生成方面更具优势。
[0048]一般而言，生物活性因子如BMP2暴露于外界环境中生命周期较短。而在本专利中，Chi/Gel多层膜的作用是调控BMP2的释放并期保持BMP2的活性。体内结果证实所释放的BMP2具有良好的生物活性，能诱导宿主骨细胞向成骨细胞分化，导致植入体/骨界面新生骨的生成。该结果与先前的报道相一致。综上，本专利所制备具有细胞外微环境的钛合金界面能够调节细 胞功能促进植入体及体内组织的骨整合。
【权利要求】
1.一种调控干细胞分化及促进体内骨生成的钛合金表面改性方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)通过多巴胺偶联将带负电荷的明胶固定在钛合金材料(Ti6A14V，TC4)的表面，获得经明胶修饰的TC4 ； 2)在步骤I)所获得的经 明胶修饰的TC4表面构建壳聚糖、明胶和骨形态发生蛋白BMP2依次重叠的多层膜，得到经过多层膜修饰的TC4 ； 3)采用物理吸附的方式，在步骤2)所获得的经多层膜修饰的TC4表面沉积一层纤粘蛋白分子。
2.根据权利要求1所述的一种调控干细胞分化及促进体内骨生成的钛合金表面改性方法，其特征在于，步骤I)的具体过程是:先将多巴胺溶于Tris缓冲溶液中，配置成浓度为2mg/mL的多巴胺溶液；再将钛合金材料TC4沉浸于所述多巴胺溶液中；最后取出经过多巴胺浸泡的钛合金材料TC4，将其用二蒸水润洗后，浸泡在明胶溶液中，获得经明胶修饰的TC4。
3.根据权利要求1或2所述的一种调控干细胞分化及促进体内骨生成的钛合金表面改性方法，其特征在于，步骤2)的具体过程是: a)配置浓度为I~10mg/mL的壳聚糖溶液、浓度为I~10mg/mL的明胶溶液和浓度为0.5 ~5 μ g/mL 的 BMP2 溶液； b)用二蒸水润洗步骤I)得到的经明胶修饰的TC4； c)将TC4置于壳聚糖溶液中，浸泡5~15min后取出，用二蒸水润洗； d)将TC4置于明胶溶液中，浸泡5~15min后取出，用二蒸水润洗； e)将TC4置于BMP2溶液中，浸泡5~15min后取出，用二蒸水润洗； f)将TC4置于明胶溶液中，浸泡5~15min后取出，用二蒸水润洗； g)重复步骤c~f若干次。
4.根据权利要求1或2所述的一种调控干细胞分化及促进体内骨生成的钛合金表面改性方法，其特征在于，步骤3)的具体过程是:配置浓度为0.5~5μ g/mL的纤粘蛋白溶液，将步骤2)所获得的经多层膜修饰的TC4浸泡在纤粘蛋白溶液中0.5~2h后取出，用二蒸水润洗2次。
5.通过权利要求1~4所述方法获得的调控干细胞分化及促进体内骨生成的钛合金材料。
【文档编号】A61L31/12GK103893826SQ201410075267
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月3日 优先权日:2014年3月3日
【发明者】蔡开勇, 胡燕, 罗忠 申请人:重庆大学