一种环境响应性肿瘤靶向联合给药传递系统的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药剂领域，具体涉及一种环境响应性肿瘤靶向联合给药传递系统及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 化疗作为肿瘤治疗的主要手段，一直存在治疗效果差、副作用大的问题。临床实验 和研究表明，单一用药很难对肿瘤起到显著的治疗效果，且容易产生耐药性而降低疗效，所 以联合给药成为肿瘤治疗的一个发展方向。
[0003] 阿霉素和顺铂是两种不同抗肿瘤机制的药物，临床上常联合用于治疗肿瘤，临床 结果显示，二者合用有协同作用。阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，但 它有很强的骨髓抑制、心脏毒性、消化道反应等毒副作用。顺铂类似于双功能烷化剂，进入 细胞后与DNA结合，形成铂-DNA复合体，破坏DNA的功能，阻碍DNA复制，诱导肿瘤细胞的凋 亡。虽然阿霉素和顺铂联合用药对肿瘤具有较好疗效，但还是产生了严重的毒副作用和不 良反应。现有药物制剂对病变细胞的选择性缺失和在体循环中泄露是导致这些问题的根本 原因。因此，提高药物制剂的体循环稳定性和对病变细胞的选择性是化疗药物急需解决的 重要课题。
[0004] 主动靶向给药系统是以病变细胞为靶点，能将目标药物特异性投递到病变细胞并 通过细胞摄取而导入胞内的给药系统，该类系统为解决药物制剂对病变细胞的选择性缺失 提供了有效途径。目前，主动靶向给药系统大多通过纳米粒子表面偶联靶向分子或靶向基 团赋予其主动靶向功能。为了确保给药系统高效靶向病变细胞，靶向分子或靶向基团的设 计非常关键。
[0005] 主动靶向给药系统进入靶细胞后，必须能响应胞内特定环境释放药物。文献报道 的药物释放触发机制主要有pH敏感释药机制、酶敏感释药机制和还原敏感释药机制等。还 原敏感药物载体利用细胞内外还原物质浓度的不同，使载体在肿瘤细胞中发生二硫键断裂 从而将药物快速地释放出来。细胞中谷胱甘肽的含量(2-10mM)远远的高于细胞外的浓度 (接近2-20μΜ)，肿瘤细胞中谷胱甘肽的含量比正常细胞高，故设计基于二硫键的还原响应 性纳米给药系统，有利于实现药物在靶细胞内的促发释放。
[0006] 羧甲基壳聚糖是壳聚糖经羧甲基化反应后得到的一种水溶性壳聚糖衍生物，羧甲 基壳聚糖水溶性好，性质稳定，无毒，无抗原性，生物相容性好，可生物降解，在医药和保健 食品方面应用较为广泛。
[0007] 近年来，分子生物学和分子病理学研究揭示，许多人体癌细胞表面的叶酸受体的 活性和数量显著高于正常组织细胞，而叶酸对叶酸受体具有高度的亲和性，所以可利用这 一特性将叶酸作为抗肿瘤药物的靶向分子，与药物或载体偶联以实现药物的靶向输送。
[0008] 应用聚合物材料制备纳米粒用于抗肿瘤药物的传递是近年来药物输送系统研究 的热点，但存在载药量低等缺陷，联合给药可以弥补载药量低的缺陷，同时发挥药物的协同 作用。因此靶向联合给药传递系统在肿瘤的治疗方面有着巨大的优势。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种环境响应性肿瘤靶向联合给药传递系统及其制备方法， 该系统在用于肿瘤化疗时具有明显的优势，对肿瘤细胞具有靶向性，而对正常细胞的毒副 作用很小。
[0010] 本发明所提供的环境响应性肿瘤靶向联合给药传递系统，包括由抗肿瘤药物和用 于包封所述抗肿瘤药物且表面偶联靶向分子的高分子聚合物组成的纳米粒，所述高分子聚 合物还通过二硫键与另一种抗肿瘤药物阿霉素连接。
[0011] 所述高分子聚合物是按以下方法制备得到的：
[0012] 1)将盐酸阿霉素与三乙胺反应得到碱基阿霉素(D0X);
[0013] 2)以3,3_二硫代二丙酸双(N-羟基琥珀酰亚胺）酯(DSP)为交联剂，将碱基阿霉素 与羧甲基壳聚糖反应，得到羧甲基壳聚糖-二硫键-阿霉素高分子聚合物(D0X-DSP-CMCS);
[0014] 3)将叶酸上的羧基氨基化，然后取10-50重量份的氨化叶酸与10-50重量份的羧甲 基壳聚糖-二硫键-阿霉素高分子聚合物反应，得到表面偶联靶向分子的高分子聚合物。
[0015] 优选地，步骤3)中的反应过程是:将10-50重量份的羧甲基壳聚糖-二硫键-阿霉素 高分子聚合物先用水溶解，得到I _5mg/mL的水溶液，然后将10-50重量份的氨化叶酸加入到 所述水溶液中，再加入1-10重量份的1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，反应 12h，去离子水透析48h，冷冻干燥，得表面偶联靶向分子的高分子聚合物。
[0016] 本发明所提供的环境响应性肿瘤靶向联合给药传递系统的制备方法是:将采用上 述方法制备的20-100重量份表面偶联靶向分子的高分子聚合物溶于水中，加入5-10重量份 抗肿瘤药物，避光搅拌，超声，再用去离子水透析，冷冻干燥，得到的纳米粒即为环境响应性 肿瘤靶向联合给药传递系统。
[0017] 本发明的有益效果在于：
[0018] 1)制备联合给药的纳米传递系统
[0019] 化疗药物纳米给药系统大多是一种药物作为模型药物，而在肿瘤的化疗治疗过程 中，大多采用的是两种药物联合化疗，本发明通过二硫键将阿霉素与羧甲基壳聚糖连接，从 而合成了阿霉素的高分子前药D0X-DSP-CMCS，并巧妙的将另一种化疗药物包封在DOX-DSP-CMCS中，从而制备出联合给药的纳米传递系统。
[0020] (2)系统的体循环稳定性和智能释药性
[0021] 巯基-双硫键交换反应具有快速、容易和可逆的特点，在动物和人体的细胞内，谷 胱甘肽是最丰富的低分子生物活性巯基物质，是最主要的还原物质。本发明通过二硫键设 计控释给药系统，从而避免纳米粒在体循环中解体和药物泄露，而一旦被受体特异性结合， 进入肿瘤细胞内，二硫键就会因为细胞内的还原环境断裂并释放药物。因此，二硫键的还原 敏感机制使靶向纳米粒形成良好体循环稳定性和智能释药性。
[0022] 试验表明，本发明给药系统对肿瘤细胞具有明显的抑制作用，阿霉素和顺铂在模 拟血液中释放很少，而在肿瘤细胞环境中释放量很高，证明该给药系统具有较好的环境响 应性。
[0023] (3)系统的广泛适用性
[0024]本发明的靶向纳米传递系统可通过羧甲基壳聚糖活性集团连接含-NH2或-COOH等 反应基团的不同活性物质，如肿瘤单抗、抗肿瘤化疗药和吸附基因等，从而进一步扩大其运 用范围，具有广泛的适用性。
【附图说明】
[0025] 图1是D0X-DSP-CMCS的合成路线图。
[0026] 图2是氨化叶酸的合成路线图。
[0027] 图3是表面偶联靶向分子的高分子聚合物的合成路线图。
[0028] 图4是实施例1中阿霉素在不同浓度谷胱甘肽溶液中的释药曲线图。
[0029] 图5是实施例1中顺铂在不同浓度谷胱甘肽溶液中的释药曲线图。
【具体实施方式】
[0030] 实施例1
[0031] 1.高分子聚合物的制备
[0032] (l)DOX-DSP-CMCS 的合成
[0033]取盐酸阿霉素，精密称定，溶于纯水中，加入三乙胺（盐酸阿霉素与三乙胺摩尔比 为1:2)避光挽拌反应过夜，反应液置透析袋中纯水避光透析，冷冻离心，将保留液冷冻干 燥，即得碱基阿霉素(DOX)。
[0034] 取DSP 40mg，精密称定，溶于2.OmL二甲亚砜中，并加入0· ImL 0.1 %的三乙胺二甲 亚砜溶液。另取DOX 54mg，精密称定，溶于2.7mL二甲亚砜溶液中，缓慢滴加到上述DSP溶液 中（DOX与DSP的摩尔比为1:0.9 )，室温搅拌2h，即得中间体DOX-DSP。
[0035] 精密称取DOX-DSP，溶于二甲亚砜，使得DOX浓度为10mg/mL。另精密称取羧甲基壳 聚糖(CMCS) IOOmg，溶于去离子水中，浓度为2mg/mL，调PH至7.4，得到CMCS溶液，再缓慢滴加 1.0 mL上述DOX-DSP溶液，室温搅拌12h，将反应液移至透析袋，用二甲亚砜水混合溶媒(去离 子水：二甲亚砜=9:1)(体积比）透析2天，蒸馏水继续透析1天，6000rpm离心10min除去沉 淀，冷冻干燥上清液。冻干产物中加入20mL二甲亚砜溶液，超声、过滤，除去溶于二甲亚砜的 反应物，重复3次至滤液不显红色。加水溶解，移至透析袋内透析1天，冷冻干燥，得到DOX-DSP-CMCS (合成路线如图1所示）。
[0036] (2)表面偶联靶向分子的高分子聚合物的制备
[0037] 叶酸44. lmg，溶于3mL二甲亚砜中，再加入27mg EDC和24mg N-羟基丁二酰亚胺 (NHS)，于50°C反应6h，反应液冷却至室温，加入66.7uL乙二胺和50uL吡啶反应过夜，用过量 乙腈沉淀产物，过滤，用乙醚洗涤，真空干燥得羧基氨基化的叶酸(合成路线如图2所示）。
[0038] 取IOmg氨化叶酸加入到2mg/mL的D0X-DSP-CMCS水溶液（5ml)中，加入6.12mg EDC 反应12h，去离子水透析48h，冷冻干燥得表面偶联靶向分子的高分子聚合物(合成路线如图 3所示）。
[0039] 2.环境响应性肿瘤靶向联合给药传递系统的制备
[0040] 取步骤1中得到的高分子聚合物IOmg分散于IOmL水中，加入顺铂2mg，避光搅拌3 天，探头超声30次，再用去离子水透析24h，除去过量的顺铂，冷冻干燥，制得纳米粒。
[0041 ] 3.环境响应性肿瘤靶向联合给药传递系统的肿瘤细胞毒性实验
[0042] (1)细胞培养
[0043]将HeLa细胞置于含有10%胎牛血清的MEM培养基中，青霉素、链霉素浓度为IOOU/ mL，37°C，5%CO2孵化箱中连续培养，取对数生长期细胞待用。
[0044] (2)接种细胞
[0045]用0.2 5 %胰蛋白酶消化处理处于对数生长期的He La细胞，用PB S溶液洗涤， 1000 rpm离心5min后，加入新鲜培养基形成细胞悬浮液，以每孔2 X IO3个细胞(细胞密度0.2 X IO5个/mL，取IOOyL)接种于96孔培养板中，移至CO2培养箱中培养24h，培养条件:MEM培养 基，10%胎牛血清，37°C，5%CO 2。显微镜观察细胞是否贴壁生长。
[0046] (3)加药物
[0047]培养24h后，吸弃培养基，每孔中加入200yL不同浓度的纳米粒悬液，继续培养ld， 3d，5d〇
[0048] (4)呈色
[0049] 吸弃培养基，用I3BS冲洗3次，每孔加入IOOyL培养基，和IOyL CCK-8溶液，继续孵育 4h〇
[0050] (5)比色
[0051 ]用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度，检测波长450nm，参比波长600nm，计算细 胞存活率。
[0052] (6)实验结果
[0054]结果表明本发明给药系统对肿瘤细胞具有明显的抑制作用，并且随着浓度增大抑 制作用增强，随着时间延长抑制作用也增强。
[0055] 4.环境响应性肿瘤靶向联合给药传递系统的体外释放实验
[0056] 巯基-双硫键交换反应具有快速、容易和可逆的特点，在动物和人体的细胞内，谷 胱甘肽是最丰富的低分子生物活性巯基物质，是最主要的还原物质，在体液或者是细胞膜 上，蛋白质是倾向于使双硫键稳定的，原因就是谷胱甘肽的浓度很低。相反，在细胞内的浓 度将达到2-10mM，使得细胞内呈现出很强的还原环境。值得注意的是，肿瘤组织中的还原性 较正常组织的要高很多，其中谷胱甘肽的浓度是正常组织中的4倍多。
[0057]因此，可以通过配制不同浓度谷胱甘肽的PBS(PH7.4)溶液为释放介质来模拟血液 和肿瘤细胞环境。取一定量的阿霉素-顺铂环境响应性肿瘤靶向联合给药传递系统分散于 适量PBS(PH7.4)溶液中，超声lOmin，封装于透析袋中，置于含谷胱甘肽分别为2μΜ、100μΜ、 2mM、IOmM的PBS(PH7.4)释放介质中，保持恒温37± 1°C，转速65转/分，分别于O、0.5、1、2、4、 8、12、24h时取透析液ImL，同时补充ImL新鲜磷酸盐缓冲液维持释放介质体积不变，用紫外 分光光度仪测定释放介质中阿霉素和顺铂的释放量，结果如图4、图5所示。
[0058]从图4、5看出，阿霉素和顺铂在模拟血液(谷胱甘肽含量为2μΜ)中释放很少，而在 肿瘤细胞环境中24小时释放最高可以达到90%，证明该给药系统具有较好的环境响应性。
[0059] 实施例2
[0060] 1.D0X-DSP-CMCS 的制备
[00611与实施例1的方法相同。
[0062] 2.表面偶联靶向分子的高分子聚合物的制备
[0063] 取IOmg氨化叶酸加入到2mg/mL的DOX-DSP-CMCS水溶液（25ml)中，加入8mg EDC反 应12h，去离子水透析48h，冷冻干燥得表面偶联靶向分子的高分子聚合物。
[0064] 3.环境响应性肿瘤靶向联合给药传递系统的制备
[0065]取步骤2中得到的高分子聚合物20mg分散于IOmL水中，加入姜黄素2mg，避光搅拌3 天，探头超声30次，再用去离子水透析24h，除去过量的姜黄素，冷冻干燥，即得。
[0066] 3.肿瘤细胞毒性实验
[0067]试验方法与实施例1相同，试验结果见下表。
[0069] 4.体外释放实验
[0070] 试验方法和结果与实施例1相同，阿霉素和姜黄素在模拟血液(谷胱甘肽含量为2μ Μ)中释放很少，而在肿瘤细胞环境中24小时释放量很高，证明该给药系统具有较好的环境 响应性。
[0071] 在本发明中，从理论上讲，所包载的药物是指肿瘤药物，包括一般小分子药物以及 具有生物活性的多肽蛋白类大分子药物。在本发明的实施例中，仅对顺铂和姜黄素进行了 实验，以此类推，本发明应该也能够用于制备类似于5-氟尿嘧啶、紫杉醇等抗肿瘤药物的靶 向纳米粒，且取得相似的效果。
【主权项】
1. 一种环境响应性肿瘤靶向联合给药传递系统，包括由抗肿瘤药物和用于包封所述抗 肿瘤药物且表面偶联靶向分子的高分子聚合物组成的纳米粒，所述高分子聚合物还通过二 硫键与另一种抗肿瘤药物阿霉素连接，所述高分子聚合物是按以下方法制备的： 1) 将盐酸阿霉素与三乙胺反应得到碱基阿霉素； 2) 以3,3_二硫代二丙酸双(N-羟基琥珀酰亚胺)酯为交联剂，将碱基阿霉素与羧甲基壳 聚糖反应，得到羧甲基壳聚糖-二硫键-阿霉素高分子聚合物； 3) 将叶酸上的羧基氨基化，然后取10-50重量份的氨化叶酸与10-50重量份的羧甲基壳 聚糖-二硫键-阿霉素高分子聚合物反应，得到表面偶联靶向分子的高分子聚合物。2. 如权利要求1所述的环境响应性肿瘤靶向联合给药传递系统，其特征在于:步骤3)中 的反应过程是:将10-50重量份的羧甲基壳聚糖-二硫键-阿霉素高分子聚合物先用水溶解， 得到l-5mg/mL的水溶液，然后将10-50重量份的氨化叶酸加入到所述水溶液中，再加入1-10 重量份的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，反应12h，去离子水透析48h，冷冻 干燥，得表面偶联靶向分子的高分子聚合物。3. 如权利要求1所述的环境响应性肿瘤靶向联合给药传递系统，其特征在于:所述抗肿 瘤药物为顺铂或姜黄素。4. 一种环境响应性肿瘤靶向联合给药传递系统的制备方法，其特征在于包括以下步 骤： 1) 将盐酸阿霉素与三乙胺反应得到碱基阿霉素； 2) 以3,3_二硫代二丙酸双(N-羟基琥珀酰亚胺)酯为交联剂，将碱基阿霉素与羧甲基壳 聚糖反应，得到羧甲基壳聚糖-二硫键-阿霉素高分子聚合物； 3) 将叶酸上的羧基氨基化，然后取10-50重量份的氨化叶酸与10-50重量份的羧甲基壳 聚糖-二硫键-阿霉素高分子聚合物反应，得到表面偶联靶向分子的高分子聚合物。 4) 取20-100重量份高分子聚合物分散水中，加入5-10重量份抗肿瘤药物，避光搅拌，超 声，再用去离子水透析，冷冻干燥，得到的纳米粒即为环境响应性肿瘤靶向联合给药传递系 统。
【专利摘要】本发明公开了一种环境响应性肿瘤靶向联合给药传递系统，本发明通过二硫键将阿霉素与羧甲基壳聚糖连接，从而合成了阿霉素高分子前药，并巧妙的将另一种化疗药物包封在阿霉素高分子前药中，从而制备出联合给药的纳米传递系统，该系统具有良好的体循环稳定性和智能释药性，药物成分在模拟血液中释放很少，而在肿瘤细胞环境中释放量很高，同时还具有广泛的适用性。
【IPC分类】A61K47/48, A61P35/00, A61K31/704, A61K31/12, A61K33/24
【公开号】CN105708848
【申请号】CN201610079030
【发明人】刘诗久, 张政, 张雪琼
【申请人】武汉艾美博特医疗用品有限公司