一种靶向CD47的免疫检查点抑制剂药物组合物及其制备方法与流程

本发明属生物技术领域，涉及一种新型靶向cd47的免疫检查点抑制剂药物组合物及其制备方法和用途，尤其是一种靶向cd47的免疫检查点抑制剂与一种或多种细胞自噬抑制剂组合形成的新型复方药物或药物组合物及其制备方法和用途。

背景技术：

现有技术公开了cd47(又称为整合素相关蛋白，integrinassociatedproteiniap)，是一种在肿瘤细胞表面高表达的细胞跨膜蛋白，其包括五个跨膜结构域和一个ig样结构域；在机体免疫细胞中，cd47的配体主要为信号调节蛋白α(sirpα，又称myd-1)；cd47通过与其配体的结合调节细胞的迁移，吞噬活性及免疫稳态；在机体免疫系统中，cd47扮演一类“别吃我”信号，能通过ig样结构域与sirpα的nh2末端结构域结合可产生抑制巨噬细胞吞噬的信号，进而对机体固有免疫系统产生抑制作用。目前对靶向cd47的药物研究较多的是阻断cd47与其配体的结合，从而去除掉cd47与其配体的结合对固有免疫系统产生的抑制作用。已有的药物有抗cd47单克隆抗体、sirpα蛋白、sirpα/myd-1/cd172-fc融合蛋白等。

cd47作为一个“别吃我”信号，使得肿瘤细胞能够逃避机体免疫系统对其的吞噬。靶向cd47的sirpα-fc融合蛋白能够长时间阻断cd47与其配体的结合，有关对不同人白血病细胞裸鼠移植瘤模型的研究发现，靶向cd47的单抗通过阻断cd47-sirpα的结合，激活机体对移植的白血病细胞的清除(chaomp,alizadehaa,tangc,myklebustjh,vargheseb,etal.cell2010142:699-713)。weissman组用血液来源的和非血液来源的癌细胞的研究显示，在肿瘤干细胞中cd47的表达更高一些，并进一步指出cd47的高表达是肿瘤患者一个不良预后因素。由于cd47在肿瘤细胞表面的过表达，抑制了巨噬细胞对肿瘤细胞的清除，从而提高了肿瘤细胞在体内的存活率。van组在同源的sirpα突 变型鼠移植瘤模型研究发现sirpα信号本身并不影响肿瘤的转移和生长，但cd47-sirpα结合后却严重削弱了单抗的治疗药效(zhaoxw,vanbeekem,schornagelk,vandermaadenh,vanhoudtm,etal.proc.natl.acad.sci.usa2011108:18342–47)；这些结果为靶向cd47-sirpα治疗恶性肿瘤或者增强单抗的药效提供了理论基础。

有研究发现cd47能够提高向肿瘤微环境中递药的效率，特别是，rodriguez组把重组cd47蛋白结合到纳米粒上，在体内提高了纳米粒在循环中的半衰期和细胞毒性药物向肿瘤中的递药效率；结合纳米粒的cd47通过fcγr抑制机体对纳米粒的清除，这与前文中提到的cd47-sirpα结合削弱了抗体介导的肿瘤治疗作用一致(rodriguezpl,haradat,christianda,pantanoda,tsairk,discherde.science2013339:971–75)；另有研究用红血细胞膜包裹纳米粒后，发现这种可以抑制机体对纳米粒的吞噬作用，并且这一抑制作用是cd47依赖的(huc-mj,fangrh,lukbt,chenkn,carpenterc,etal.nanoscale20135:2664–68)；这些结果表明靶向cd47可能成为提高递药效率的有效手段。

细胞自噬(autophagy)又称ⅱ型程序性死亡(typeⅱprogrammedcelldeath)，是真核生物体内进化保守的负责细胞内物质周转的重要过程，能分解细胞内受损或多余的细胞器和衰老的蛋白产生核苷酸，氨基酸等小分子物质供细胞合成新的蛋白质，并能维持细胞内微环境的稳定。研究发现细胞自噬与多种疾病，尤其是肿瘤的发生和发展关系密切。根据细胞内底物运送到溶酶体腔内方式的不同，哺乳动物细胞自噬可分为三种方式：大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediatedautophagy,cma)。其中，大自噬主要具有以下特征：(1)发展过程迅速；(2)自噬的可诱导性；(3)批量降解；(4)无选择性吞噬；(5)自噬的保守性；其他两种自噬与大自噬的主要区别在于：小自噬是溶酶体膜自身变形，然后包裹吞噬细胞浆中的底物；而分子伴侣介导的自噬则能有选择性地降解蛋白。

研究公开了自噬能对细胞对外部环境改变及各种刺激产生应激反应，细胞在生长条件下能发生较低水平的自噬，也称基础自噬，然而，一旦受到外界的刺激，如饥饿、缺氧、高温、高细胞密度或是生长因子剥夺等，细胞自噬的水平将会迅速上调，如在营养物质缺乏的情况下，细胞自噬能分解体内坏死细胞器产生氨基 酸等供细胞合成新的蛋白质，维持细胞的存活[①piacentinim,d'elettom,falascal,etal.2011；78:197-246；②cookkl,shajahanan,clarker.2011；11(8):1283-94.；③wirawane,vandenberghet,lippenss,etal.2012；22(1):43-61.]。然而，作为程序性细胞死亡的一种，细胞自噬能通过多种途径直接或是间接导致细胞死亡，这种杀伤可能是通过诱导细胞凋亡、坏死、衰老等机制发生，也可能是使细胞直接发生自噬性死亡[dentond,nicolsons,kumars.celldeathdiffer.2012；19(1):87-95.]。

目前的靶向cd47的融合蛋白制剂均为传统型制剂工艺所制备，存在脱靶情况，且治疗效果有待提高。迄今，尚未见有细胞自噬抑制剂与靶向cd47的融合蛋白组成新型制剂的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种靶向cd47的免疫检查点抑制剂药物组合物及其制备方法和用途。本发明解决的关键技术问题是制备一种靶向cd47，且能显著杀伤肿瘤细胞的免疫检查点抑制剂药物组合物，同时保证原靶向cd47免疫检查点抑制剂的稳定性和靶向性。

本发明解决本技术问题的方案是，将由靶向cd47的免疫检查点抑制剂与细胞自噬抑制剂组成组合药物或者药物复方制剂。

本发明中，细胞自噬抑制剂包括但不限于氯喹(cq)，3-ma，沃曼青霉素，巴伐洛霉素a-1，氯化铵和ly294002；本发明的实施例中优选氯喹；

本发明中，靶向cd47的免疫检查点抑制剂药物包括但不限于：抗cd47单克隆抗体、sirpα蛋白、sirpα/myd-1/cd172-fc融合蛋白等；本发明的实施例中优选sirpα-fc(myd-1-fc)融合蛋白，尤其是重组人sirpα/cd172-fc(myd-1/cd172-fc)融合蛋白；

本发明中，所述的细胞自噬抑制剂能增强靶向cd47的药物对于肿瘤细胞的杀伤效果，从而增强该类药物的抗肿瘤疗效；所述的细胞自噬抑制剂与靶向cd47的药物组合为复方制剂，能增强药物的靶向效果、以及对于cd47位点的封闭效果及抗肿瘤效果。

本发明中，细胞自噬抑制剂可与靶向cd47的药物制成药物组合物，采用序贯使用的方式增强靶向cd47药物的抗肿瘤疗效。

本发明的由靶向cd47的免疫检查点抑制剂与细胞自噬抑制剂组成的组合物或者复方制剂可用于治疗的肿瘤包括但不限于：非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、慢性髓系粒细胞白血病、急性髓系粒细胞白血病、急性淋巴系粒细胞白血病、乳腺癌、黑色素瘤；本发明进一步进行靶向cd47的融合蛋白对非小细胞肺癌细胞自噬水平的影响试验，靶向cd47的融合蛋白制剂与靶向cd47的融合蛋白的体外促吞噬作用比较试验以及靶向cd47的融合蛋白制剂与靶向cd47的融合蛋白的体内治疗效果比较实验和靶向cd47的融合蛋白制剂与普通靶向cd47的蛋白的体内治疗效果比较实验；结果证实，所述融合蛋白能够明显引起肺癌细胞产生细胞自噬(如图1a，b所示)和自噬流(如图1c所示)；所述融合蛋白制剂有较强的促巨噬细胞吞噬作用，与单独使用融合蛋白(myd-1-fc)比较，促吞噬效果显著提高，证明了新型靶向cd47的融合蛋白在体内的抗肿瘤作用，且与细胞自噬抑制剂制成新型制剂能够显著提高抗肿瘤效果；所述融合蛋白制剂有较强的抗肿瘤作用，与普通靶向cd47的融合蛋白比较，促抗肿瘤效果显著提高(如图4a，b所示)。

本发明的由靶向cd47的免疫检查点抑制剂与细胞自噬抑制剂组成的组合物或者复方制剂可用上述各类肿瘤的诊断和检测。

本发明提供了制备由靶向cd47的免疫检查点抑制剂与细胞自噬抑制剂组成的组合物或者复方制剂的方法，其中包括1)自噬抑制剂药物的配置；2)靶向cd47药物母液的制备；3)靶向cd47的免疫检查点抑制剂药物组合物的制备。该制剂的制备工艺简单、适应性广，可用于大规模生产。

附图说明

图1显示了靶向cd47的融合蛋白引起非小细胞肺癌细胞产生细胞自噬，

其中，a：激光共聚焦荧光显微镜观察自噬体的产生，b：电子显微镜观察自噬体的产生和分布，c：激光共聚焦荧光显微镜检测自噬流的整个过程。

图2是靶向cd47的融合蛋白制剂促进巨噬细胞对非小细胞肺癌细胞的吞噬。

图3是靶向cd47的融合蛋白及其制剂对裸鼠移植瘤的生长的抑制，

其中，a：靶向cd47的融合蛋白及其制剂对肿瘤体积生长的影响，b：靶向cd47的融合蛋白及其制剂对肿瘤重量的影响。

图4靶向cd47的融合蛋白制剂和普通靶向cd47的蛋白对裸鼠移植瘤的生长的抑制，

其中，a：靶向cd47的融合蛋白制剂和普通靶向cd47的蛋白对肿瘤体积生长的影响，b：靶向cd47的融合蛋白制剂和普通靶向cd47的蛋白对肿瘤重量的影响。

具体实施方式

实施例1

1)自噬抑制剂药物的配置

(1)氯喹溶液的配制：取适量氯喹溶于0.01mpbs(ph＝7.4)配成10mmol/l的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于4℃，体外实验室稀释500-1000倍用于抑制细胞自噬；

(2)氯化铵溶液的配制：取适量氯化铵溶于0.01mpbs(ph＝7.4)配成0.4mol/l的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于4℃，体外实验时稀释50-80倍用于抑制细胞自噬；

(3)3-ma溶液的配制：取适量3-ma溶于0.01mpbs(ph＝7.4)配制成200mm的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于-20℃，体外实验时稀释至2mm用于抑制细胞自噬；(4)ly294002溶液的配制：取适量ly294002溶于0.01mpbs(ph＝7.4)配制成20mm的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于-20℃，体外实验时稀释至20μm用于抑制细胞自噬；

2)靶向cd47药物母液的制备

靶向cd47的药物可由r&d公司获得，称取10mg靶向cd47蛋白或融合蛋白的冻干粉，溶于1ml0.02mph＝7.4的pbs溶液中，充分搅拌并用0.1μm无菌滤器过滤，浓度为10mg/ml，4℃保存，体外试验时稀释至10μg/ml；

3)新型靶向cd47的免疫检查点抑制剂药物组合物的制备

将靶向cd47的免疫检查点抑制剂与细胞自噬抑制剂制备成将靶向cd47的新型药物组合物：将靶向cd47的药物母液与氯喹溶液按1:1混合，使得靶向cd47 融合蛋白浓度1mg/ml，氯喹的浓度为1mmol/l。体外实验时稀释100倍：

4)靶向cd47的融合蛋白对非小细胞肺癌细胞自噬水平的影响

将上述靶向cd47的融合蛋白(myd-1-fc)按体积1:100加入到培养基中，采用激光共聚焦荧光显微镜、电子显微镜和蛋白质印记等分别观察和检测融合蛋白对非小细胞肺癌细胞自噬水平的影响，实验结果表明，该融合蛋白能够明显引起肺癌细胞产生细胞自噬(图1a，b)和自噬流(图1c)。

5)靶向cd47的融合蛋白制剂与靶向cd47的融合蛋白的体外促吞噬作用比较利用cfse标记非小细胞肺癌细胞，并将巨噬细胞和非小细胞肺癌细胞共培养，把上述靶向cd47的融合蛋白制剂(myd-1-fc+cq)按体积1:100加入到培养基中，观察融合蛋白制剂对巨噬细胞吞噬非小细胞肺癌细胞的影响。激光共聚焦荧光显微镜观察结果如图2所示，实验结果表明，该融合蛋白制剂有较强的促巨噬细胞吞噬作用，与单独使用该融合蛋白(myd-1-fc)比较，促吞噬效果显著提高。

6)靶向cd47的融合蛋白制剂与靶向cd47的融合蛋白的体内治疗效果比较将上述靶向cd47的融合蛋白制剂(myd-1-fc+cq)和靶向cd47的融合蛋白(myd-1-fc)以100μl每只小鼠的剂量由腹腔注射入小鼠体内，每周2次，连续治疗4周后，肿瘤生长体积折线图如图2所示，实验结果表明，该融合蛋白制剂有较强的抗肿瘤作用(图3a，b)，与单独使用该融合蛋白比较，促抗肿瘤效果显著提高(图3a，b)。证明了新型靶向cd47的融合蛋白在体内的抗肿瘤作用，且与细胞自噬抑制剂制成新型制剂能够显著提高抗肿瘤效果。

7)靶向cd47的融合蛋白制剂与普通靶向cd47的蛋白的体内治疗效果比较将上述靶向cd47的融合蛋白制剂(myd-1-fc+cq)与普通靶向cd47的蛋白(b6h12)以100μl每只小鼠的剂量由腹腔注射入小鼠体内，每周2次，连续治疗4周后，肿瘤生长体积折线图如图2所示，实验结果表明，该融合蛋白制剂有较强的抗肿瘤作用(图4a)，与普通靶向cd47的融合蛋白比较，促抗肿瘤效果显著提高(图4a，b)。