用于降低化疗后5‑羟色胺副作用的复合益生菌制剂的制作方法

本发明涉及一种复合益生菌制剂，以及该复合益生菌制剂的具体应用。

背景技术：

化疗是治疗癌症的重要手段之一，但化疗后不良反应较多，尤其是胃肠道反应，包括肠黏膜炎和恶心呕吐等。接受常规剂量化疗药物的患者，临床发病率为40%，而几乎所有接受高剂量化疗药物的患者，都会出现肠黏膜炎。恶心呕吐是化疗的另一重要胃肠道反应，主要是与化疗后5-羟色胺（5-HT）释放有关，发病率同样较高，尤其是注射顺铂后几乎达100%，这严重影响患者的生活质量及化疗效果。胃肠道反应更是患者推迟化疗的重要原因，导致癌症患者的死亡率大大增加。

技术实现要素：

本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种能够有效降低化疗后副作用的复合益生菌制剂，以及该种复合益生菌制剂的具体应用。

本发明的技术解决方案是：一种用于降低化疗后5-羟色胺副作用的复合益生菌制剂，其特征在于：所述的复合益生菌制剂由以下益生菌按照以下活菌数量比例混合而成：

短双歧杆菌：嗜酸乳杆菌：干酪乳杆菌：嗜热链球菌=1：1-3:1-3:1-3，且所述的复合益生菌制剂的总活菌数量为200-800亿。

所述的复合益生菌制剂在制备防止化疗后恶心呕吐的药物中的应用。

所述的复合益生菌制剂在制备改善肠黏膜炎药物中的应用。

本发明同现有技术相比，具有如下优点：

本种复合益生菌制剂，其所有的菌株均来源于人体，经经筛选、驯化和组方验证，安全性高，具有良好的生态互助性，安全性高，临床应用有保障。它能够有效降低5-羟色胺的水平，同时还可以改善肠黏膜炎。因此这种复合益生菌制剂作为肠内微生态营养制剂，用于化疗病人的肠内营养制剂的产品开发，其使用十分广泛。它的活菌数用量大，属于医用食品，无剂量限制，无毒副作用，使用方便，可作为营养组件和其他营养素一起用于临床病人的营养治疗，让患者在平时饮食的过程中就能完成辅助治疗，能够大大减轻患者痛苦。

附图说明

图1为各组大鼠平均高岭土摄食量变化图。

图2为顺铂处理后模型组大鼠肠道菌群随时间的改变，PCR-DGGE指纹分析图谱(A)、主成分（PCA）分析(B)及UPGMA相似性聚类分析(C)。

注：本图中，#1-#5为顺铂处理后0天模型组大鼠肠道菌群，#6-#10为顺铂处理后3天模型组大鼠肠道菌群，#11-#15为顺铂处理后6天模型组大鼠肠道菌群。

图3 为顺铂处理后益生菌组大鼠肠道菌群随时间的改变，PCR-DGGE指纹分析图谱(A)、主成分（PCA）分析(B)及UPGMA相似性聚类分析(C)。

注：本图中，#1-#5为顺铂处理后0天益生菌组大鼠肠道菌群，#6-#10为顺铂处理后3天益生菌组大鼠肠道菌群，#11-#15为顺铂处理后6天益生菌组大鼠肠道菌群。

图4 比较顺铂处理后第3天模型组与益生菌组大鼠肠道菌群，PCR-DGGE指纹分析图谱(A)、主成分（PCA）分析(B)及UPGMA相似性聚类分析(C)。

注：本图中，#1-#5为顺铂处理后第3天模型组大鼠肠道菌群，#6-#10为顺铂处理后第3天益生菌组大鼠肠道菌群。

图5为比较顺铂处理后第6天模型组与益生菌组大鼠肠道菌群，PCR-DGGE指纹分析图谱(A)、主成分（PCA）分析(B)及UPGMA相似性聚类分析(C)。

注：本图中，#1-#5为顺铂处理后第6天模型组大鼠肠道菌群，#6-#10为顺铂处理后第6天益生菌组大鼠肠道菌群。

图6为顺铂处理后不同时期各组大鼠肠组织免疫荧光检测结果。

注：肠组织嗜铬粒蛋白A免疫荧光染色（左侧），5-HT（中间），合并（右侧）； con-3为顺铂处理后第3天空白组，cis-3为顺铂处理后第3天模型组，pro-3为顺铂处理后第3天益生菌组，con-6为顺铂处理后第6天空白组，cis-6为顺铂处理后第6天模型组，pro-6为顺铂处理后第6天益生菌组。

图7为各组大鼠血清中5-HT的变化。

注：a表示与con-3比较p<0.05，b表示与con-6比较p<0.05 ,c表示与cis-3比较p<0.05,d表示与cis-6比较p<0.05；con-3为顺铂处理后第3天空白组，cis-3为顺铂处理后第3天模型组，pro-3为顺铂处理后第3天益生菌组，con-6为顺铂处理后第6天空白组，cis-6为顺铂处理后第6天模型组，pro-6为顺铂处理后第6天空白组。

图8 各组大鼠结肠组织中5-HT变化。

注：a表示与con-3比较p<0.05，b表示与con-6比较p<0.05 ,c表示与cis-3比较p<0.05,d表示与cis-6比较p<0.05；con-3为顺铂处理后第3天空白组，cis-3为顺铂处理后第3天模型组，pro-3为顺铂处理后第3天益生菌组，con-6为顺铂处理后第6天空白组，cis-6为顺铂处理后第6天模型组，pro-6为顺铂处理后第6天空白组。

具体实施方式

下面将说明本发明的具体实施方式：

一种复合益生菌制剂，由以下益生菌按照以下活菌数量比例混合而成：

短双歧杆菌：嗜酸乳杆菌：干酪乳杆菌：嗜热链球菌=1：1-3:1-3:1-3，且所述的复合益生菌制剂的总活菌数量为200-800亿。

如上所述的复合益生菌制剂在制备降低5-羟色胺药物中的应用。

如上所述的复合益生菌制剂在制备改善肠黏膜炎药物中的应用。

实施例

SPF级SD雄性大鼠。随机分为3组，每组14只，分别为空白组，顺铂+生理盐水组(模型组：cis-0表示顺铂处理第0天，cis-3表示顺铂处理第3天，cis-6表示顺铂处理第6天)，顺铂+益生菌组 (益生菌组：pro-0表示顺铂处理第0天，pro-3表示顺铂处理第3天，pro-6表示顺铂处理第6天) 。益生菌组大鼠按本发明所公开的复合益生菌制剂的总菌数为1×10¹⁰CFU/只益生菌进行灌胃，空白组和模型组以等体积生理盐水进行灌胃，灌胃时间总共为13天，灌胃后第6天，建立动物模型，对模型组和益生菌组按6mg/kg顺铂剂量对大鼠进行尾静脉注射，空白组注射等体积生理盐水，分别于注射后第3天每组处死一半数量的大鼠，剩下的于第6天处死。实验期间观察：大鼠的进食进水量、高岭土摄取量及死亡率、变性梯度凝胶电泳（DGGE）方法检测肠道菌群多样性、免疫荧光方法检测肠嗜铬细胞释放5-HT情况、ELISA试剂盒检测血清5-HT及结肠肠组织中5-HT的浓度。

实验结果如下：

从大鼠平均高岭土摄食量柱状图（图1）可以看出，与空白组相比，顺铂建模后第1、2 、3天,模型组和益生菌组大鼠有明显的摄食高岭土行为，其中第1天最为严重，第2、3天摄食高岭土行为有明显减轻。与模型组相比，益生菌组大鼠对高岭土摄食量减少明显。

顺铂处理后各组大鼠肠道菌群多样性的变化，从DGGE 电泳图中（图2)可以看出，模型组与顺铂处理前相比，顺铂注射后3天和6天，DGGE条带数显著降低（见表1），模型组0天，DGGE每个泳道平均有18.25±1.26个条带，而顺铂处理后第3天，DGGE图谱显示平均有12.60±1.67个条带。处理后6天，DGGE图谱显示平均有10.20±3.77个条带，说明顺铂处理，可使大鼠肠道菌群多样性降低。由图2可以看出，模型组6天，大鼠肠道菌群有明显紊乱。

表1各组大鼠肠道菌群多样性条带分析（X ± S）

在益生菌组，与顺铂处理前相比，顺铂注射后3天到6天，DGGE条带数降低不明显（图3），益生菌组0天，DGGE每个泳道平均有17.33±1.15个条带，而顺铂处理后3天，DGGE图谱显示平均有15.00±1.41个条带。处理后6天，DGGE图谱显示平均有15.20±1.64个条带，说明经益生菌干预的，大鼠肠道菌群变化不明显，结合图4，图5和表1可以看出，与模型组相比，顺铂处理后3天，益生菌组大鼠肠道菌群多样性增加，顺铂处理后6天肠道菌群多样性也无明显紊乱。

利用Quantity One 软件对大鼠肠道菌群DGGE图谱进行数字化处理，然后采用非加权成对算术平均算法（UPGMA）进行各泳道条带类型聚类分析。结果显示：在模型组中，除模型组0天聚成单独的一簇外，模型组3天和模型组6天有交叉，且组内差异较大。说明顺铂处理后，3天和6天肠道菌群紊乱。

在益生菌组中益生菌组6天和0天，未能明显区分为两大簇，说明经益生菌干预的大鼠，肠道菌群有明显恢复。

顺铂处理后不同时期各组大鼠4种优势菌群的数量的变化：

从大鼠每克粪便中乳杆菌属，双歧杆菌属，Clostridium cluster IV，Clostridiumcluster XIV含量变化，表2可以看出：与模型组处理前相比，模型组处理后第3天和处理后第6天大鼠肠道菌群中乳杆菌属，双歧杆菌属大幅度减少(p<0.05)，Clostridium clusterIV，Clostridium cluster XIV拷贝数增加显著(p<0.05)；与模型组处理后第3天相比，模型组处理后第6天，乳杆菌属，双歧杆菌属减少，Clostridium cluster IV增多，但Clostridium cluster XIV减少。

表2 肠道4种优势菌群的表达水平（拷贝数/每克粪便。拷贝数/克粪便，x±s）

注： e表示与cis-0比较p<0.05，c表示与cis-3比较p<0.05,d表示与cis-6比较p<0.05 ,f表示与pro-0比较p<0.05,g表示与pro-3比较p<0.05；cis-0为顺铂处理后第0天模型组，cis-3为顺铂处理后第3天模型组，cis-6为顺铂处理后第6天模型组，pro-0为顺铂处理后第0天益生菌组，pro-3为顺铂处理后第3天空白组，pro-6为顺铂处理后第6天模型组。

与益生菌组处理前相比，益生菌组处理后第3天和处理后第6天大鼠肠道菌群中乳杆菌属和双歧杆菌属均没有显著变化，Clostridium cluster IV数量增加，但与益生菌组处理前相比，Clostridium cluster XIV数量无明显变化;与益生菌组处理后第3天相比，益生菌组处理后第6天大鼠肠道菌群中乳杆菌属无明显变化，双歧杆菌属拷贝数有减少趋势，Clostridium cluster IV和Clostridium cluster XIV数量下降明显(p<0.05)

与模型组处理后第3天和处理后第6天相比，益生菌组处理后第3天和处理后第6天，乳杆菌属，双歧杆菌属大幅度增加(p<0.05)，而Clostridium cluster IV，Clostridiumcluster XIV均大幅度减少(p<0.05)。

顺铂处理后不同时期各组大鼠肠组织免疫荧光检测：

从免疫荧光结果（图6）可以看出，在肠组织中模型组第3天，肠嗜铬细胞释放5-HT的量增加，而与模型组第3天相比，益生菌组第3天，释放5-HT的肠嗜铬细胞减少。顺铂处理后第6天，模型组中肠嗜铬细胞释放5-HT的量有所减少，而此时益生菌组与空白组相比没有显著差别。

顺铂处理后不同时期各组大鼠血清和结肠组织中5-HT的浓度变化：

与空白组比较，模型组第3天和第6天的血清中5-HT水平明显升高（p<0.05)，且第6天与第3天IL-10水平变化不明显（p<0.05）。与模型组比较，益生菌组第3天和第6天的结肠组织中5-HT水平有显著降低（p<0.05）更接近于空白组水平。（图7）

大鼠结肠组织中各组5-HT的含量见图8。与空白组相比，模型组第3天和第6天的血清中5-HT水平明显升高（p<0.05)，但第6天比第3天5-HT水平有所回降（p<0.05）。与模型组比较，益生菌组第3天和第6天的结肠组织中5-HT水平有显著降低（p<0.05）更接近于空白组水平。