荜茇明宁碱在制备治疗帕金森病的药物中的应用的制作方法

本发明涉及药物领域，具体涉及荜茇明宁碱在制备治疗帕金森病的药物中的应用。

背景技术：

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是临床上最常见的神经退行性疾病之一，其主要临床表现是静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势不稳，而造成这些症状的主要原因在于PD中后期累及中枢神经系统后，疾病选择性的损害中脑黑质多巴胺能神经元，导致黑质多巴胺能神经元进行性变性缺失，从而导致一系列运动及非运动症状。

伴随着全球人口老龄化，PD的人口发病率呈明显上升趋势。流行病学研究显示在中国65岁以上人群帕金森病发病率已接近2％，并伴随着高致残率，这严重影响着老年人口的健康水平和生活质量。由于PD病因复杂且致病机制尚不清楚，因此其治疗手段也较为有限。目前PD的手段主要有：药物治疗、手术治疗、细胞移植、转基因技术等，而询证医学(evidence based medicine EBM)证据表明，目前药物治疗仍是最为常用且最为有效的治疗方法。EBM证据表明临床治疗PD的首选药物仍为以左旋多巴为主要成分的美多芭，其主要机制是补充多巴胺的不足而产生治疗作用，本质上仍然是一种对症性的替代疗法，但是治疗本身有诸多的局限性，由于L-dopa能够进入中枢神经系统的量不足服用剂量的1％，大量的L-dopa在外周的代谢会产生诸多的药物副作用，并且由于该药物只能对症治疗以改善症状，对于患者的预后没有明显改善，因此仍然是一种治标而不治本的治疗手段，随着该药应用时间的延长和剂量的加大，其治疗作用越来越小，同时毒副反应却越来越大。因此研发一种具有更好疗效且更低毒副作用的药物是基础和临床中厄待解决的问题。

近年来,对传统中医药开放利用日趋具有研究前景，大量研究证实了传统中医药可以通过保护黑质细胞、提高神经递质含量、抑制氧化应激反应、降低兴奋性毒性等作用达到治疗帕金森病的目的,并且与西药相比，传统中医药物具有较低的毒副作用。

荜茇是一种胡椒科胡椒属植物，其干燥近成熟的果穗是中、蒙、藏医习惯用药，味辛、性热，临床用于治疗胃腹冷痛、食欲不振、消化不良、肾寒、寒泻、呕吐等症状。荜茇中含有丰富的生物碱、酰胺类、木脂素类、萜类、甾醇类及其它类的化合物，其中生物碱和酰胺类约35种，其中荜茇明宁碱是荜茇中主要单体成分之一。目前文献中还未见报道荜茇明宁碱药物单体在鱼藤酮诱导的帕金森病模型中治疗方面的相关研究。

技术实现要素：

本发明的目的是提供荜茇明宁碱的一种药物新用途。

本发明所提供的荜茇明宁碱的药物新用途是其在制备具有下述1)-4)中至少一种功能的药物中的应用：(请核实此处表述，并确保涵盖了所有的范围)

1)治疗中枢神经系统疾病；

2)治疗鱼藤酮诱导的帕金森病模型；

3)抑制细胞凋亡；

4)减轻多巴胺神经元损伤。

上述应用中，所述中枢神经系统疾病具体可为帕金森病。

本发明还提供一种包含荜茇明宁碱的具有下述1)-4)中至少一种功能的药物制剂：

1)治疗中枢神经系统疾病；

2)治疗鱼藤酮诱导的帕金森病模型；

3)抑制细胞凋亡；

4)减轻多巴胺神经元损伤。

上述药物制剂可制成各种形式的口服制剂，包括：胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、丸剂、滴丸剂、缓控释制剂、口服液、合剂和糖浆剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明以鱼藤酮(Rotenone)损伤模型，即100nM鱼藤酮处理SK-N-SH细胞系和原代神经元形成的细胞模型为细胞模型。

实验证明：加入Rotenone(终浓度100nM)2小时，后加入荜茇明宁碱(终浓度100nM)与Rotenone共培养24h。通过MTT、LDH的方法检测细胞活力，结果显示荜茇明宁碱能够显著缓解Rotenone引起的细胞活力下降；通过PI/Hochest染色的方法检测细胞死亡率，结果显示荜茇明宁碱能够显著缓解Rotenone引起的细胞死亡率升高；对Caspase 3、Caspase 9活力进行检测，结果显示荜茇明宁碱能够显著缓解细胞凋亡。

为了进一步确定荜茇明宁碱通过抑制细胞凋亡从而对鱼藤酮诱导的帕金森病模型起到治疗作用，本发明采用鱼藤酮口服给药C57BL小鼠动物模型。

上述模型制作是通过10mg/kg鱼藤酮口服6周形成的模型。荜茇明宁碱治疗组是在鱼藤酮口服6周后，分别用2mg/kg和4mg/kg口服给药4周进行治疗。

实验证明：对C57BL小鼠进行行为学检测，结果显示荜茇明宁碱可以显著缓解鱼藤酮诱导的帕金森病模型小鼠运动功能障碍以及嗅觉减退、抑郁的非运动症状；在纹状体和中脑，对多巴胺能神经元特异性标志物酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)进行免疫组织化学染色及蛋白免疫印迹方法检测，结果显示荜茇明宁碱可以抵抗鱼藤酮诱导的模型小鼠TH阳性神经元缺失以及神经末梢的减少；通过高效液相(HPLC)的方法对纹状体多巴胺含量进行检测，结果显示，荜茇明宁碱可以减缓鱼藤酮诱导的模型小鼠纹状体多巴胺含量的下降；对模型小鼠脑组织进行Caspase 3、Caspase 9活力检测，结果显示荜茇明宁碱可以缓解鱼藤酮诱导的细胞凋亡。

上述实验表明，荜茇明宁碱可以抑制细胞凋亡，保护多巴胺能神经元，从而来治疗中枢神经系统疾病。

附图说明

图1为在SK-N-SH细胞和原代神经元上检测荜茇明宁碱对的细胞活力的保护作用。图示为鱼藤酮处理2h，使用100nM荜茇明宁碱PLG进行治疗，共培养24h后，通过MTT、LDH方法检测不同药物处理组的细胞活力和细胞毒性。

图2为在SK-N-SH细胞和原代神经元上，检测各组细胞死亡率。图示为鱼藤酮处理2h，使用100nM荜茇明宁碱PLG进行治疗，共培养24h后，对细胞进行PI/Hochest染色，PI染死细胞为红色，Hochest染总细胞为蓝色，统计红色/蓝色的值可以用来评估细胞死亡率。

图3为在C57BL小鼠上，检测小鼠运动行为以及嗅觉、抑郁等非运动行为。图示为C57BL小鼠鱼藤酮10mg/kg口服6周后，口服荜茇明宁碱PLG进行治疗4周，剂量分别为2mg/kg和4mg/kg。后对小鼠进行转棒检测，爬杆检测评估小鼠的运动行为，嗅觉检测，糖水偏好试验检测来评估小鼠的非运动行为。

图4为取C57BL小鼠的纹状体和中脑检测TH阳性神经元及其末梢。图示为C57BL小鼠鱼藤酮10mg/kg口服6周后，口服荜茇明宁碱PLG进行治疗4周，剂量分别为2mg/kg和4mg/kg。取小鼠纹状体和中脑，通过免疫组织化学染色的方法检测TH阳性神经元和神经末梢含量。

图5为取C57BL小鼠的纹状体和中脑检测TH蛋白含量。图示为C57BL小鼠鱼藤酮10mg/kg口服6周后，口服荜茇明宁碱PLG进行治疗4周，剂量分别为2mg/kg和4mg/kg。取小鼠纹状体和中脑，通过western blot的方法检测TH蛋白水平。

图6为取C57BL小鼠纹状体检测多巴胺含量。图示为C57BL小鼠鱼藤酮10mg/kg口服6周后，口服荜茇明宁碱PLG进行治疗4周，剂量分别为2mg/kg和4mg/kg。取小鼠纹状体，通过高效液相的方法检测多巴胺含量。

图7为在SK-N-SH细胞和原代神经元上检测细胞凋亡水平。图示为鱼藤酮处理2h，使用100nM荜茇明宁碱PLG进行治疗，共培养24h后，收集细胞通过使用caspase-3和caspase-9活力检测试剂盒检测细胞caspase-3和caspase-9活力，从而评估细胞凋亡水平。

图8为取C57BL小鼠中脑，检测Caspase 3、Caspase 9活力。图示为C57BL小鼠鱼藤酮10mg/kg口服6周后，口服荜茇明宁碱PLG进行治疗4周，剂量分别为2mg/kg和4mg/kg。取小鼠中脑，使用caspase-3和caspase-9活力检测试剂盒检测细胞caspase-3和caspase-9活力，从而评估细胞凋亡水平。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中使用的细胞系如下：

SH-SY5Y细胞系：人多巴胺能神经母细胞瘤细胞(ATCC，本室冻存)(American Type Culture Collection)货号CRL-2266^TM；

SPF级SD胎鼠：胎龄13.5d的SD胎鼠，购自北京维通利华实验动物公司。

下述实施例中的试验方法如下：

1.细胞活力的测定(MTT法)

(1)用胰蛋白酶消化细胞；

(2)用吸管充分吹打细胞，使其离壁，制备成单细胞悬液；

(3)或利用白细胞计数板对细胞进行计数；

(4)按照2-3×10⁴/孔的密度，将细胞用排枪将SK-N-SH的单细胞悬液加到96孔板中，以进行MTT实验做准备；

(5)对个组进行相应处理后，向各孔加入MTT(5mg/ml)10μl，37℃，5％CO₂培养箱继续培养4h；

(6)吸弃培养基，每孔加入100μl DMSO，振荡10分钟，使颗粒完全溶解；

(7)将孔板置于酶标仪中，读取490nm波长处的吸光度值，统计作图。

2.乳酸脱氢酶释放率测定(LDH法)

(1)调整细胞浓度根据实验设计种植于96孔板的相应孔板。1‐1.5×10⁴个细胞/孔，每孔50μl；

(2)待细胞贴壁后，用assay medium洗细胞2次后每孔加入assay medium50μl；

(3)取待测药物原液稀释至实验设计的浓度，向各个实验设计孔中加入相应浓度的药物50μl；

(4)37℃、5％CO₂孵育12小时；

(5)加入Rotenone 100nM继续孵育24小时；

(6)在高对照组加入lysis solution 5μl反应15min；

(7)每孔加入100μl reaction mixture(现配250μl catalyst+11.25ml dye solution)室温反应30min，避光；

(8)每孔加入50μl stop solution终止反应；

(9)酶标仪490nm读取吸光度值分析。

3.PI/Hochest染色

(1)细胞从培养箱内取出，在无菌超净台内用巴斯德管吸弃培养基；

(2)以PBS液洗涤细胞，以去除残余培养基及血清成分，吸弃PBS液；

(3)向培养瓶中加入预热37℃的0.5ml细胞消化液，使其充分与细胞接触，吸弃消化液，倒置显微镜下观察细胞，待细胞突起回缩，胞体开始变圆时，立即加入1ml DMEM，以终止胰酶消化作用；

(4)用吸管充分吹打细胞，使其离壁，制备成单细胞悬液；

(5)根据细胞密度，将细胞接种于96孔板，37℃孵育；

(6)至细胞密度达到70％，鱼藤酮组加入100nM Rotenone每孔100μl，PLG组和CSA组在Rotenone处理后两小时进行治疗，37℃孵育24小时；

(7)吸弃培养基，用培养基稀释PI，hochest至10μM/ml，每孔加100μl，孵育30分钟，利用高内涵分析系统检测。

4.免疫组化步骤：

(1)动物经灌注固定，立即取脑，先后放入含20％、30％蔗糖的4％多聚甲醛溶液内后固定4℃过夜；

(2)冰冻切片，40μm，切片放入0.01M PBST液(pH7.2-7.5)内待染；

(3)切片入0.01M PBST液中浸洗三次，5min；

(4)切片入1N盐酸，抗原修复30min，室温；

(5)切片入PBST浸洗三次10min；

(6)切片入3％H2O2消除内源性过氧化物酶的活性10min；

(7)切片入PBST浸洗三次，每次10min；

(8)切片入5％正常羊血清封闭1h，室温(抑制非特异性染色)，弃血清，切片不清洗，直入适当稀释的一抗TH(0.01M PBST稀释)，孵育4℃过夜；

(9)切片入PBST浸洗三次，每次5min；

(10)切片入1:300生物素标记的Ⅱ抗(0.01M PBST稀释)2-3h，室温；

(11)切片入PBST浸洗三次，每次5min；

(12)切片入1:300辣根酶标记的链霉卵白素Ⅲ抗(0.01M PBST稀释)2-3h，室温；

(13)切片入PBST浸洗三次，每次5min；

(14)切片入DAB显色，5-10min，室温；

(15)切片入流水，充分浸洗；

(16)切片入0.01M PB液中裱片，自然干燥；

(17)切片上行脱水，透明，封固。

实施例1、荜茇明宁碱PLG抑制鱼藤酮诱导的细胞损伤。

1、通过MTT的方法检测原代神经元细胞活力。

MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在540nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，即吸光值越大，其活性越强。

2、通过LDH的方法检测原代神经元细胞毒性。

LDH(乳酸脱氢酶)是稳定的胞浆酶，存在所有的细胞中，当胞膜损伤时快速释放到细胞培养液中。LDH活性通过两个酶催化反应：LDH氧化乳酸盐生成丙酮酸盐，然后丙酮酸盐和四唑盐INT反应生成甲(formazan)结晶。甲(formazan)结晶量在培养液中的增加，与裂解的细胞数增加直接相关。甲(formazan)结晶染料是水溶的，可以用分光光度计在500nm波长检测。通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度此分析灵敏、方便、精确，适用于许多种细胞毒性分析。

3、通过PI/Hochest染色的方法检测原代神经元细胞死亡率。

Hochest33342是一种能与细胞DNA结合的蓝色特异性染料，能穿透活细胞膜，故能标记活细胞和死细胞。而PI染料是不能进入细胞膜完整的细胞中，即活细胞对PI(碘化丙啶)染料拒染，而坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被PI染料染色发出红色荧光。根据这些特性，用PI/Hoechst双染色经常被用于检测细胞死亡比例。其比值越大，表明细胞死亡率越高。

4、实验结果

用100nM鱼藤酮处原代神经元2h后，用100nM荜茇明宁碱PLG进行治疗，再共同孵育24h，后进行MTT细胞活力检测和LDH细胞毒性检测。实验结果显示，鱼藤酮处理后原代神经元的细胞活力均明显降低且细胞毒性明显增加，而PLG治疗组则有明显改善。

在原代神经元上，使用PI/Hochest双染的方法检测了细胞死亡率，PI可以染死细胞，呈红色，Hochest可以染总细胞数，成蓝色，计算红色/蓝色可以得到细胞死亡率。结果显示，鱼藤酮处理细胞后，细胞死亡率明显增加，而PLG治疗后均有改善。

实施例2、荜茇明宁碱PLG缓解鱼藤酮诱导的帕金森病模型小鼠的行为学障碍和多巴胺缺失

1、通过转棒检测、爬杆检测、嗅觉检测、糖水偏好检测评估鱼藤酮诱导的帕金森病模型小鼠的行为学

转棒实验和爬杆实验常用于检测小鼠运动协调能力和抗疲劳能力。转棒仪实验是将动物放置在粗糙滚筒上避免滑落，转动滚筒后，如果动物滑落下来，就会停止下面对应的传感器并自动记录结果。爬杆实验是将一个直径为2.5cm的塑料球固定于一个长60cm，粗1cm的木杆顶端，木杆上缠上纱布防止打滑。将小鼠放置于木杆顶端，记录小鼠从木杆顶端回到地面的时间。时间越短，表示小鼠运动协调能力越强。

食物埋藏实验常用于小鼠嗅觉检测。小鼠在进行嗅觉检测前进食14h，检测时，将1mm³食物埋藏于待检测鼠笼垫料下0.5cm处，将小鼠放入待检测鼠笼中央，记录小鼠从放入鼠笼到找到食物的时间。寻找食物时间越短，表示小鼠嗅觉能力越好。

糖水偏好实验常用于检测小鼠抑郁。实验时，将两瓶水放入鼠笼中，一瓶为自来水，另一瓶为1％的蔗糖水，由小鼠自行饮用1h，后记录两瓶水分别的饮用量，计算SP值＝糖水量/(糖水量+纯水量)*100％，SP值越小，表示老鼠抑郁程度增加。

2、通过高效液相的方法检测纹状体多巴胺水平

去小鼠断头后迅速取脑组织，分离纹状体组织，用于检测DA含量。测定时，准确称取脑组织重量，按质量体积比1:19加入19倍样品处理液(500ml水+14.35ml高氯酸+5.5ml 200μg/ml DHBA+90mg EDTA)，冰上匀浆制备5％的组织匀浆液，12000r/min 4℃离心20min，取上清过0.22μm滤膜用于检测。

3、通过免疫组化的方法检测中脑和纹状体的TH阳性神经元和神经末梢

免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及相对定量的研究。本实验中，通过免疫组化对小鼠中脑和纹状体TH染色，来评估中脑和纹状体多巴胺能神经元和神经末梢含量。

4、实验结果

本实验动物为C57BL小鼠，鱼藤酮口服给药剂量为10mg/kg，给药六周，每两周进行一次行为学检测。行为学结果显示，鱼藤酮处理后，老鼠体重较对照组降低，且出现运动能力下降，抑郁，嗅觉减退等症状。

小鼠鱼藤酮口服给药六周后，口服给荜茇明宁碱PLG进行治疗，剂量为2mg/kg,4mg/kg,给药4周。每两周进行一次行为学检测。而PLG治疗后，治疗组老鼠较损伤组运动障碍，嗅觉减退，抑郁均有不同程度缓解。

通过高效液相的方法对老鼠纹状体多巴胺含量进行了检测，结果显示损伤组老鼠DA含量较对照组明显降低，而PLG治疗组有所改善。

通过免疫组化的方法对纹状体和中脑黑质两个部位进行TH染色，结果显示鱼藤酮处理后，小鼠脑组织纹体和黑质部位TH水平较对照组明显降低，而PLG治疗有明显改善。