本发明涉及一种生物治疗黑色素瘤的药物及其制备方法。
背景技术：
黑色素瘤来源于黑色素细胞，是一种常见的恶性体表肿瘤，在所有体表肿瘤中恶性程度最高。由于环境污染，尤其是臭氧层破坏导致的UV辐射增加，黑色素瘤的发病率正在呈现逐年上升趋势，全球每年约新增20万黑色素瘤病例，且黑色素瘤发病年龄有年轻化的趋势。黑色素瘤的疾病病程进展异常迅速，疗效及预后极差，5年生存率仅约20%。因此探索及创制针对恶性黑色素瘤的新型药物已迫在眉睫。
氧化石墨烯是一种新型的纳米医药载体，其具有表面积大、载药量大、副作用小、生产成本低廉等诸多优点。由于氧化石墨烯不溶于水及有机溶剂，因此解决其分散/溶解性成为将其应用于药物载体的首先需要解决的问题。
由于人体存在细胞膜这一天然的生物学屏障，其限制了药物分子、多肽蛋白质以及核酸等进入细胞的能力。然而，越来越多的研究表明需要在分子水平对某些疾病进行干预、治疗，但是由于细胞膜这一天然生物学屏障的存在,导致了大分子如多肽蛋白质、核酸等进入细胞仍是一个亟待攻克的难题。
microRNA通过特异性结合靶mRNA，能够对基因转录后的表达进行调控，同时还能够影响生物体多种生理病理学进程。最近研究表明microRNA 参与调控癌症细胞的增殖、凋亡、侵袭及转移等。目前，已有研究表明，miR-33a与miR-199a对黑色素瘤的发生发展及侵袭转移具有一定的抑制作用，但其抑制率尚不显著，且尚未对其进行进一步研究，miR-33a与miR-199a是否可以对黑色素瘤发生协同抑制作用。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是制备一种同时搭载miR-33a与miR-199a对黑色素瘤进行生物治疗的纳米载体及其制备方法。
本研究拟利用已成熟的纳米材料组装技术构建“一箭多靶”多重响应安全高效的纳米载药复合体：将氧化石墨烯（GO）接枝壳聚糖（CS）形成氧化石墨烯-壳聚糖（GO-CS）纳米复合体，增强氧化石墨烯的水溶性、稳定性及生物相容性，再将此复合体与细胞穿膜肽MPG多肽进行有机结合，合成GO-CS-MPG纳米载药复合体，进一步增强该载体通过细胞膜的穿膜效率，增大药物或者其他生物活性物质进入细胞的能力，并对其进行结构及制备工艺的优化，然后搭载miR-33a与miR-199a，构建出GO-CS-MPG-miR-33a/miR-199a复合体。在此基础上，一方面对载药体进行细胞毒性研究，另一方面将载药体转染黑色素瘤A375细胞后进行增殖转移以及相关动物学实验研究，确定其对黑色素瘤的治疗作用，并与单一治疗及空白对照比较其治疗有效率。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
a.将鳞片石墨和KMnO4混合物（质量比为1: 3~1: 10）两种固体混合均匀。将混合物放入烧杯，置于在恒温水浴箱（35~42℃）中，搅拌下缓慢滴加浓H2SO4-浓H3PO4混酸（体积比为5: 1~10: 1），；再超声乳化30~60分钟，然后在50~100℃下反应12-72小时；反应结束后，产物在空气之中自然冷却至室温。然后将产物与500~1000毫升冰水（0-4℃）混合，并在搅拌下缓慢滴加H2O2至不再产生气泡为止；所得混合物经离心（1000r/min，5min）后，所得固体用稀盐酸洗涤2-10次，再用蒸馏水洗至中性，所得固体用20~50毫升去离子水分散后放入冷冻干燥器中，冷冻干燥得氧化石墨烯粉末。
b.称取10-1000mg氧化石墨烯粉末、10-1000mg4-二甲氨基吡啶（DMAP）、10-6000mg壳聚糖以及1-100ml二甲基亚砜（DMSO），混合，然后经超声分散0.5-2h，混合均匀后，加入0.1-10g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），加热至50~100℃下反应12~72小时；反应结束后，所得混合物用去离子水洗2-10遍， 稀盐酸洗2-10遍，最后用去离子水洗至中性，冷冻干燥，得氧化石墨烯-壳聚糖复合物（GO-CS）。
c.将10-1000mg氧化石墨烯-壳聚糖复合物用双蒸水洗涤2-10遍，纯化，加入10-3000mgMPG多肽，超声分散0.5-2h，透析提纯2-5遍，无酶水洗涤2-10遍，完全去除多余未反应的MPG多肽，再进行冷冻干燥，得氧化石墨烯-壳聚糖-MPG多肽（GO-CS-MPG）载体。
d.应用10-1000mg GO-CS-MPG载体搭载10-1000ug质粒miR-33a与miR-199a，然后进行细胞增殖以及动物实验。
e.为了验证该载体的生物安全性以及细胞毒性，对其进行了细胞毒性实验。细胞毒性实验结果表明，该载体在浓度为0-320mg/L时，其对细胞增殖是无毒性的。
f.为了验证该药物对黑色素瘤具有抑制作用，进行了细胞增殖实验。空白的GO-CS-MPG载体，其对A375细胞的抑制作用并不明显，不具有统计学意义。GO-CS-MPG搭载单个miR33a或者单个miR199a后，其对A375细胞存在一定的抑制作用，其抑制率分别为15-35%和15-30%。GO-CS-MPG同时搭载miR33a与miR199a后，抑制率约为40-65%；与搭载单个miR33a或者单个miR199a相比，联合搭载miR33a与miR199a对A375细胞抑制作用更加明显。
g.为了进一步验证该药物在体内对黑色素瘤具有抑制作用，进行了动物皮下成瘤实验。实验结果表明，接受GO-CS-MPG-miR-33a/miR-199a治疗组的种植瘤体积明显小于对照组，接受治疗组肿瘤体积约为100-300mm3，而空白对照组约为300-600mm3，且治疗组肿瘤的生长速率亦远远低于对照组。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
氧化石墨烯（GO）制备：称取0.3g鳞片石墨和1.5g的KMnO4，将两种固体混合均匀转移至100mL的圆底烧瓶中，量取36mL的浓H2SO4和4mL的H3PO4混淆均匀，在冰水浴中逐渐滴加至圆底烧瓶，超声处理之后，溶液呈现墨绿色，在50℃水浴中反应12h，滴加H2O2，溶液呈现亮黄色，至不再产生气泡后，离心，用0.1M HCl洗涤3次，用蒸馏水洗至pH=7，冷冻干燥得氧化石墨烯粉末。
氧化石墨烯接枝壳聚糖：将0.20g氧化石墨烯、0.10g4-二甲氨基吡啶（DMAP）、0.75g 壳聚糖以及30mL二甲基亚砜（DMSO）一起加入50mL圆底烧瓶中，混匀后，加入0.5g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），在60℃油浴中反应36h，所得混合溶液用水洗3遍，0.5M的HCl洗3遍，最后水洗至中性，冷冻干燥，得氧化石墨烯-壳聚糖复合物（GO-CS）。
氧化石墨烯-壳聚糖接枝MPG多肽：称取200mg氧化石墨烯-壳聚糖复合物，高温高压灭菌蒸馏水洗涤3遍，纯化，冷冻蒸干，严格无菌操作，得到的蒸干物中取100mg氧化石墨烯-壳聚糖复合物，溶于500ml无RNase酶水中，充分震荡摇匀，在超声波振荡器中震荡4-6h。然后加入500mg MPG多肽，37℃超声乳化，静置6h，然后透析提纯，无酶水洗涤3遍，完全去除多余未反应的MPG多肽，再进行冷冻蒸干，得到完整的氧化石墨烯-壳聚糖-MPG多肽（GO-CS-MPG）载体。
将制备所得的100mg GO-CS-MPG搭载100ug质粒miR-33a与miR-199a，然后进行细胞毒性、细胞增殖以及动物实验。
细胞毒性实验结果表明，随着GO-CS-MPG浓度的增高，其对细胞有一定的毒性作用。但即使当GO-CS-MPG浓度高达 320mg/L时，细胞的相对生存率仍然能够达到81%。这充分表明GO-CS-MPG载体与细胞的生物相容性良好，细胞毒性作用极低。
细胞增殖实验结果表明，空白的GO-CS-MPG载体，其对A375细胞的抑制作用并不明显，不具有统计学意义。GO-CS-MPG搭载单个miR33a或者单个miR199a后，其对A375细胞存在一定的抑制作用，其抑制率分别为25.95%和24.47%。GO-CS-MPG搭载miR33a与miR199a后，其与空白对照组相比，对A375细胞有显著抑制作用，抑制率约为51.02%；与搭载单个miR33a或者单个miR199a相比，联合搭载miR33a与miR199a对A375细胞抑制作用更加明显，说明GO-CS-MPG搭载miR33a与miR199a后，其对A375细胞起到了协同抑制作用，能够更加有效的抑制A375细胞的生长。
动物皮下成瘤实验结果表明，接受GO-CS-MPG-miR-33a/miR-199a治疗组的种植瘤体积约为234.12 mm3，而对照组肿瘤体积约为453.35 mm3，治疗组肿瘤体积明显小于对照组，且治疗组肿瘤的生长速率亦远远低于对照组。此结果表明，纳米运载体GO-CS-MPG-miR-33a/miR-199a能够显著抑制裸鼠黑色素瘤A375细胞皮下种植瘤的生长。
本发明不限于实施例的范围，凡是通过制备该类载体搭载一箭多靶或单靶抑癌基因治疗黑色素瘤的药物均在本发明保护范围之内。