甲壳素多孔止血微球的制备方法与流程

本发明涉及一种甲壳素多孔止血微球的制备方法，属于天然高分子材料应用技术领域。

背景技术：

甲壳素是地球上含量仅次于纤维素的可再生天然高分子，它存在于各种甲壳纲动物、软体类动物、昆虫和某些藻类中。甲壳素作为一种天然高分子，具有生物可再生性、生物相容性、生物可降解性和无毒性等优异特点，比起它的衍生物壳聚糖有着更好的结构稳定性，不需要脱乙酰化加工，节省能源且更加环保。甲壳素在生物工程领域的应用极其广泛，如三维细胞培养支架、止血膜/海绵、药物包覆及释放、无水处理和食品加工等，其中作为止血材料，能够明显降低止血时间；作为药物包覆及释放材料它具有良好的缓释作用，且能够靶向运输药物到特定的部位。因此甲壳素具有广阔的市场前景。

作为止血材料，甲壳素的主要止血机理为：其一，甲壳素具有较强吸水能力，在与伤口接触时能够吸收血液中的水分，浓缩血浆中的血细胞、血小板和凝血因子；其二，甲壳素上的氨基正离子与带负电的红细胞、血小板和蛋白质相互吸附形成血栓；其三，甲壳素内的物质如钙离子可以促进凝血串联反应，激活凝血酶原，产生凝血蛋白酶，使纤维蛋白原分解为纤维蛋白，形成纤维蛋白增强的坚固血栓而止血。根据它的止血机理，可以改变甲壳素材料的形貌结构，从而增强甲壳素材料的止血能力。

甲壳素微球止血剂的优点在于它颗粒小，能与各类外伤伤口(形状、大小、深浅)密切接触，从而达到良好的止血效果。目前甲壳素微球的主要制备方法为反相乳液法(一种制备再生甲壳素微球的方法，cn201510075081.6；含有纳米银的磁性甲壳素微球，cn201410059773.7；一种功能性多孔微球的制备方法，cn201610104925.x)。这种制备方法需要消耗大量的有机溶剂和表面活性剂，因此其制备成本高。

技术实现要素：

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种操作简单、绿色环保、颗粒均匀的多孔甲壳素微球的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种甲壳素多孔止血微球的制备方法，其包括如下步骤：

将甲壳素-氢氧化钠-尿素水溶液以静电喷射的方法喷射于凝固液中，进行凝固再生成型，经过洗涤以及超临界co2干燥得到所述甲壳素多孔止血微球；其中，所述静电喷射的电压为5～20kv。

作为优选方案，所述甲壳素-氢氧化钠-尿素水溶液中，甲壳素、氢氧化钠、尿素和水的质量比为(1～3):(10～12):(4～6):(80～85)。

作为优选方案，所述甲壳素-氢氧化钠-尿素水溶液的制备方法为：将甲壳素、氢氧化钠和尿素分散于水中，在-30℃下经过至少3次冷冻-解冻循环过程，使甲壳素溶解，再经过300目的纱布过滤，得到澄清透明的甲壳素-氢氧化钠-尿素水溶液。

作为优选方案，所述甲壳素-氢氧化钠-尿素水溶液中还含有表面活性剂，所述表面活性剂的质量分数为0.01～0.1％。

作为优选方案，所述表面活性剂选自十二烷基磺酸钠、十六烷基三甲基溴化铵和吐温-80中的至少一种。

作为优选方案，所述凝固液为硫酸-乙醇水溶液，其中，硫酸的体积的分数为5～15％，乙醇与水的体积比(50～80)：(50～20)。

作为优选方案，所述静电喷射中的供料速率为10～100μl/min。

作为优选方案，所述洗涤的操作为：先经过1n盐酸水溶液洗涤2h，再依次用水和醇洗，过滤收集。

一种如前述方法制备的甲壳素多孔止血微球在止血材料中的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、无需有机溶剂，制备速度快、绿色环保、颗粒大小均匀。

2、甲壳素微球具有多孔结构特征，孔隙率为40％～60％，吸水率高达900％～2300％，比表面积50m²/g～130m²/g，可作为大出血外伤伤口的快速止血剂。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明的实施例1制备的多孔甲壳素微球表面的扫描电镜图；

图2为本发明的实施例1制备的多孔甲壳素微球断面的扫描电镜图；

图3为本发明的实施例4体外促凝血的数据图；

图4为本发明的实施例5全血血栓动力学的数据图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

1、配制1.5％甲壳素溶液：将11g氢氧化钠和4g尿素溶解于83.5g水中，再将1.5g甲壳素加入此溶剂中，室温下搅拌5min。把混合溶液放置在-30℃冷冻2h，随后拿出搅拌至均匀，然后在-30℃继续冷冻。在4h和8h后重复搅拌/冷冻过程直至溶解，过滤得到澄清透明的液体，加入0.1g吐温，搅拌均匀，在4℃保存备用。

2、配制凝固液：将25ml硫酸溶解于225ml水醇溶液中(v水：v乙醇＝1:1)，作为凝固液。

3、微球制备：将20ml甲壳素溶液注入20ml注射器中，通过静电喷射得到甲壳素微球。静电喷射条件为：供料速度：60μl/min，电压：14kv。

4、洗涤干燥：过滤收集上述甲壳素微球，放入1m的150ml盐酸溶液3h，然后分别用150ml水和150ml乙醇各洗涤五次，抽滤收集，最后用二氧化碳超临界干燥，得到多孔结构的甲壳素微球。

本实施例制备得到的甲壳素多孔止血微球的表面和断面的扫描电镜照片分别如图1和图2所示，微球的直径为：393±32μm，孔隙率58.1％，经过测量，比表面积为137.8m²/g。

实施例2

1、配制1.5％甲壳素溶液：将11g氢氧化钠和4g尿素溶解于83.5g水中，再将1.5g甲壳素加入此溶剂中，室温下搅拌5min。把混合溶液放置在-30℃冷冻2h，随后拿出搅拌至均匀，然后在-30℃继续冷冻。在4h和8h后重复搅拌/冷冻过程直至溶解，过滤得到澄清透明的液体，在4℃保存备用。

2、配制凝固液：将25ml硫酸溶解于225ml水醇溶液中(v水：v乙醇＝1:1)，作为凝固液。

3、微球制备：将20ml甲壳素溶液注入20ml注射器中，通过静电喷射得到甲壳素微球。静电喷射条件为：供料速度：60μl/min，电压：10kv。

4、洗涤干燥：过滤收集上述甲壳素微球，放入1m的150ml盐酸溶液3h，然后分别用150ml水和150ml乙醇各洗涤五次，抽滤收集，最后用二氧化碳超临界干燥，得到多孔结构的甲壳素微球。甲壳素微球的直径为589±45μm，孔隙率为56.4％。

实施例3

1、配制2.0％甲壳素溶液：将11g氢氧化钠和4g尿素溶解于83g水中，再将2g甲壳素加入此溶剂中，室温下搅拌5min。把混合溶液放置在-30℃冷冻2h，随后拿出搅拌至均匀，然后在-30℃继续冷冻。在4h和8h后重复搅拌/冷冻过程直至溶解，过滤得到澄清透明的液体，加入吐温-80，使它的浓度达到0.05％，搅拌均匀。在4℃保存备用。

2、配制凝固液：将25ml硫酸溶解于225ml水醇溶液中(v水：v乙醇＝1:1)，作为凝固液。

3、微球制备：将20ml甲壳素溶液注入20ml注射器中，通过静电喷射得到甲壳素微球。静电喷射条件为：供料速度：60μl/min，电压：10kv。

4、洗涤干燥：过滤收集上述甲壳素微球，放入1m的150ml盐酸溶液3h，然后分别用150ml水和150ml乙醇各洗涤五次，抽滤收集，最后用二氧化碳超临界干燥，得到多孔结构的甲壳素微球。甲壳素微球的直径为741±57μm，孔隙率为49.5％。

实施例4

1、称取实施例1所制甲壳素微球和甲壳素粉末样品各10mg于2ml规格的一次性塑料试管中，并放置在37℃水浴锅中。

2、用医用采血针在大鼠心脏取2ml血液于一次性采血管(3.2％柠檬酸钠:血＝1:9)中，180°颠倒混匀5～8次并放置于37℃水浴锅恒温。

3、吸取1ml抗凝血液分别加入上述样品中，180°旋转两次混匀血液和样品后，立即向血液中中加入100μl0.1mcacl2溶液，同时混匀并开始计时，半分钟后每镉5s将试管缓慢倾斜一次，观察血液是否凝固。

4、血液倾斜90°不再流动时停止计时，所得时间为凝血时间。以空白试管直接加入血液作为阴性对照，每个样品重复7次实验。

实验结果如图3所示，甲壳素粉末和微球的凝血时间分别为83s和50s。

实施例5

1、实施例1所制甲壳素微球和粉末样品各5mg置于10ml试管中，每个样品重复5次。

2、用医用采血针在大鼠心脏取2ml血液于一次性采血管(3.2％柠檬酸钠:血＝1:9)中，180°颠倒混匀5～8次并放置于37℃水浴锅恒温。

3、取1ml抗凝血液并加入100μl0.1mcacl2溶液，混合均匀后迅速吸取100μl混合血液加入各样品中以形成血栓，并开始计时。在5分钟后加入3ml蒸馏水，且在37℃、30rpm摇床中震荡3min，再静置2min以溶解未形成血栓的红细胞，然后取200μl红细胞蒸馏水溶液加入96孔板中(一式三份)。同理，在23、38、53min时向样品中加入3ml蒸馏水并放置5min，然后取红细胞蒸馏水溶液。

4、用biotek.synergyht型酶标仪在540nm处测量去离子水中血红蛋白含量。

实验结果如图4所示：在相同时间内甲壳素多孔微球吸附红细胞形成的血栓比甲壳素粉末的大，因此甲壳素多孔微球的促凝血能力强于甲壳素粉末。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。