一种pH触发的机械基因治疗纳米给药体系及其制备方法和应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种ph触发的机械基因治疗纳米给药体系及其制备方法和应用。

背景技术：

1、三阴性乳腺癌(tnbc)是乳腺癌中最具侵袭性的亚型，占所有患者的10％～20％，但导致30％的乳腺癌死亡率。由于缺乏特异性受体，如雌激素受体(er)、孕激素受体(pr)和人表皮生长因子受体2(her2)，使tnbc对内分泌或特异性靶向药物治疗不敏感，因此化疗仍然是tnbc的主要临床治疗方法。尽管已有紫杉烷、蒽环类、铂类等多种化疗药物用于tnbc的新辅助和辅助治疗，但只有约30％～40％的tnbc患者在治疗过程中达到病理完全缓解，约有一半的tnbc患者在治疗过程中会产生化疗耐药性，导致复发率升高和总生存率降低，大多数tnbc患者的5年生存率低于60％，这仍然是一个治疗难题。因此，寻找新的分子靶点来克服化疗耐药瓶颈对于优化tnbc患者的临床预后和生存至关重要。

2、以往对耐药机制的探索主要集中在生化因素上，虽然靶向生化因子能在一定程度上提高治疗效果，但各种联合治疗的有效性在50％～70％之间波动，表明探索生化因子并不能完全解释tnbc耐药现象。证据表明，癌症的物理特征作为改进化疗的新靶点具有巨大的潜力，肿瘤的快速生长破坏周围组织的结构和功能，导致独特的肿瘤物理微环境(tpme)，其特征是刚度增加、固体应力升高、间质液压力升高和细胞外基质(ecm)改变，tpme中组织组成、丰度、网络结构和硬度的失调易导致各种病理情况，包括纤维化和侵袭性癌症，或通过作为防止药物或效应免疫细胞进入肿瘤的保护屏障提供治疗抗性，考虑到tnbc的机械刚度通常高于健康组织，这是临床诊断乳腺癌时进行人工触诊和乳腺密度筛查的基础。据推测，在tpme中降低肿瘤硬度可能通过改变细胞启动状态使化疗变得敏感。

3、肿瘤ecm硬化可归因于多种因素，包括ecm内容物(胶原、纤维连接蛋白和弹性蛋白)的过度沉积和赖氨酰氧化酶(lox)的过度表达，lox介导胶原和弹性蛋白之间共价交联的形成，并催化前弹性蛋白中赖氨酸的氧化形成强弹性蛋白微原纤维。活性lox使ecm变硬，促进转移前生态位的形成，而降低的lox活性软化组织硬度，促进药物渗透。虽然lox在影响肿瘤侵袭及其转移中的作用已经比较明确，但其对tnbc的化疗耐药的具体价值还需要深入研究和探索。此外，现有的策略如靶向lox的小分子抑制剂，通常受到其在血液循环下活性受损的限制，物理方法不可避免地损害正常的肿瘤周围组织，导致ecm重塑效率低下，并且通过单一治疗方案很难完全调节ecm相关途径。因此，迫切需要一种安全有效的tpme精确调控技术来克服tnbc的耐药。

技术实现思路

1、基于现有技术的上述不足，本发明的主要目的在于提供一种ph触发的机械基因治疗纳米给药体系。

2、本发明的另一目的在于提供所述ph触发的机械基因治疗纳米给药体系的制备方法。

3、本发明的再一目的在于提供所述ph触发的机械基因治疗纳米给药体系在制备治疗三阴性乳腺癌的药物或试剂中的应用。

4、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

5、本发明提供一种ph触发的机械基因治疗纳米给药体系，其为包含小干扰rna lox(silox)和小分子多靶向酪氨酸激酶抑制剂anlotinib(an)的ph触发的二氧化碳纳米炸弹体系(an&silox@nps)，其为核壳结构；其中：所述silox用于沉默lox的表达；an用于抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞生长；在轻度酸性微环境或酸性溶酶体中，所述机械基因治疗纳米给药体系产生二氧化碳发生气弹效应，使纳米结构破裂，促进an释放。

6、通过构建临床前耐药tnbc模型，并使用rna测序评估其转录组效果，发现lox介导的沉积和胶原蛋白与纤维连接蛋白之间的交联重塑ecm，导致更硬的tpme，从而促进tnbc的化疗耐药。基于此，本发明提出一种ph触发的二氧化碳纳米炸弹体系(an&silox@nps)，其中含有silox和an。该纳米炸弹体系可以在轻度酸性肿瘤微环境或酸性更强的溶酶体中产生二氧化碳，使溶酶体发生自爆，从而支持溶酶体逃逸，增强细胞质silox递送。然后，沉默的lox通过减少ecm成分沉积和交联重塑tpme，进一步促进an渗透和抗血管生成功能，最终克服tnbc的耐药，增强pd-l1检查点阻断免疫治疗的疗效。

7、本发明还提供所述ph触发的机械基因治疗纳米给药体系的制备方法，包括以下步骤：

8、步骤1：胍修饰壳聚糖(cg)和能与co2发生可逆反应的胍修饰壳聚糖(cg-co2)的合成，其中：cg通过胍基修饰壳聚糖形成，cg-co2通过co2在cg水溶液中鼓泡形成；

9、步骤2：an&silox@nps体系的合成，步骤包括：在圆底烧瓶中，将dppc和plga溶于二氯甲烷中，然后将cg-co2水溶液、silox以及an加入该有机溶液中，超声波乳化，再加入pva溶液继续乳化至溶液呈乳白色，负压蒸馏除去二氯甲烷，高速离心，收集产品，用去离子水洗涤，即得。

10、作为优选，步骤1中，所述cg的合成方法包括：将120mg壳聚糖溶解在3ml去离子水中，然后加入1.5ml浓度为145mg/ml的氨基亚氨基硫代甲基氢碘酸，这一过程在室温、氮气环境下搅拌24h；为除去未结合的氨基亚氨基硫代甲基氢碘酸，将真空收集的固体产物溶解在去离子水中，然后用四氢呋喃过滤，最后收集纯cg，即得。

11、作为优选，步骤1中，所述cg-co2的合成方法包括：将浓度为1mg/ml的cg水溶液用co2鼓泡1h，即得。

12、作为优选，步骤2中，所述an&silox@nps体系的合成方法包括：在圆底烧瓶中，将5mg dppc和10mg plga溶于2ml二氯甲烷中，得有机溶液；将浓度为1mg/ml的cg-co2水溶液、500μg/ml的silox以及50μg的an加入到所述有机溶液中；采用超声波仪(bilon-1000y)以20％的功率将混合溶液乳化1min，再加入8ml 2％的pva溶液继续乳化1min，所得溶液呈乳白色；使用旋转蒸发仪进行负压蒸馏，除去二氯甲烷；在高速离心机中以10,000g离心10min，收集最终产品，并用去离子水洗涤两次，即得。

13、本发明还提供所述ph触发的机械基因治疗纳米给药体系在制备治疗三阴性乳腺癌的药物或试剂中的应用。

14、作为优选，所述三阴性乳腺癌为产生化疗耐药三阴性乳腺癌。

15、本发明的an&silox@nps体系通过基因靶向调节ecm的机械特性来增强耐药tnbc的抗血管治疗效果，可以实现强大的抗癌效应，抑制远处肿瘤和肿瘤转移，并提高长期生存率，还可以促进抗pdl1的免疫治疗疗效，对于耐药的tnbc具有较好治疗效果，为推进癌症机械治疗提供一种创新的策略和可靠的证据。

16、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

17、1.本发明首次通过临床数据分析和临床前小鼠模型系统报告并证明，化疗耐药的tnbc往往具有更坚硬的tpme和更具侵袭性的基因组结构，其中tpme重塑因子lox是化疗耐药的关键诱导因子，利用sirna进行rna干扰(rnai)几乎可以针对任何基因，显示出治疗包括癌症在内的各种疾病的潜力，基于此提出一种高效的ph触发co2纳米炸弹介导的机械基因治疗模式，用于联合递送沉默lox的小干扰sirna和抗血管生成药物an，以逆转tnbc的治疗耐药性。

18、2.纳米炸弹的主要成分是美国食品及药物管理局(fda)批准的聚(d,l-乳酸-共聚乙醇酸)(plga)，其中含有能与二氧化碳发生可逆反应的胍基改性壳聚糖。通过体外和体内的多重实验验证，发现纳米炸弹an&silox@nps介导的机械基因疗法可大幅抑制耐药tnbc肿瘤的生长，并同时激活抗pd-l1的免疫刺激，唤起强大的全身抗癌免疫，有效抑制肿瘤的转移扩散，证明本发明中机械基因治疗策略是一种高效、安全、多用途的抗耐药模式，有望实现临床转化。