专利名称：非自动失活的定位表达的逆转录病毒载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体包括能进行启动子转变的载体(ProCon载体)。该载体系统能被用作定位基因治疗的基因转移载体。
将逆转录病毒载体用于基因治疗业已得到许多关注，而且，目前已成为在美国和欧洲得到批准的多种方案中可选的转移治疗基因的方法(Kotani等，1994)。然而，上述方案大多要求在体外用带有治疗基因的逆转录病毒载体转染靶细胞，随后再把感染成功的细胞送回损伤了的个体内(Rosenberg等，1992；关于综述，参见Anderson，1992)。这种来自体内的基因的治疗方案适于治疗医学疾病，其中，所述靶细胞群易被分离(例如淋巴细胞)。另外，这种来自体内的靶细胞的感染使得可以给药大量的浓缩了的病毒，而且该病毒在使用之前可作严格的安全试验。
遗憾的是，仅有一部分可用于基因治疗的靶细胞易被分离、培养，然后再被导入。此外，来自体内的基因的治疗所需的复杂技术及相应的高花费，事实上妨碍了其在世界范围内的广泛应用。未来的简便省钱的基因治疗将要求一种体内途径，在该途径中，以注射病毒载体或产生病毒载体的细胞或简单植入能产生逆转录病毒的细胞的形式直接对患者给药。
当然，这种体内途径会引起种种新问题。首先而且最重要的是，必须强调考虑到安全性。由于植入了能产生病毒的细胞而可能产生病毒，而且没有机会预先检验所产生的病毒。明白有关使用该系统所会遇到的一定危险，以及争取生产出能减少这种危险的新系统是重要的。
逆转录病毒载体系统由两个部分组成(
图1)1)该逆转录病毒载体本身是一种被修饰了的逆转录病毒(载体质粒)，其中，编码病毒蛋白的基因已被有待转移到靶细胞里的治疗基因和标记基因所取代。由于编码病毒蛋白的基因被取代有效地破坏了该病毒，必需由该系统中的第二个部分对其进行拯救，该部分能提供上述被修饰了的逆转录病毒所缺少的病毒蛋白。
所述第二个部分是
2)能产生大量病毒蛋白，但缺乏产生可复制病毒能力的细胞系。该细胞系被称为包装细胞系，它由被另一种质粒转染的细胞系组成，该质粒带有使所述被修饰了的逆转录病毒载体能被包装的基因。
为了产生所述包装了的载体，将该载体质粒转染到所述包装细胞系中，在这些条件下，所述被修饰了的逆转录基因组(包括插入的治疗基因和标记基因)由所述载体质粒转录，并被包装到被修饰了的逆转录病毒颗粒(重组病毒颗粒)中。然后，用这种重组病毒感染靶细胞，在此过程中，载体基因组和所携带的任何标记或治疗基因被整合到该靶细胞的DNA中。由这种重组病毒颗粒感染的细胞不能产生新的载体病毒，因为在这样的细胞中没有病毒蛋白。然而，带有治疗及标记基因的载体DNA被整合到细胞DNA上，并可以在被感染的细胞中表达。
由于原病毒形式的逆转录病毒基因组实际上是以随机形式整合到受感染细胞的基因组中(Varmus，1988)，根据其插入激活可以鉴定若干细胞原癌基因(Varmus，1988；Van Lohuizen和Berns，1990)。由于类似机理可能会导致接受带有被用于治疗其它已存在的医学疾病的治疗基因的逆转录载体治疗的患者长癌，已产生一再发生的伦理问题。大多数研究人员会同意，复制缺陷逆转录病毒载体，例如复制所有目前使用的整合至或靠近与有关控制细胞增殖的细胞基因的载体的可能性小到趋近于零。不过，通常还是承认，由单一的感染事件所引发的可复制逆转录病毒的极为迅速地发展会最终产生，足以使得这种表型整合变成极为真实的可能的整合事件。
对逆转录病毒系统进行优化，以减少出现可复制病毒的机会。不过，已有许多文献证明，所述逆转录病毒载体系统的组份之间的重组，会导致潜在致病性可复制病毒的产生，业已构建了若干代载体系统，以减少这种重组的危险(见Salmons和Günzburg的综述，1993)。
从安全角度和纯实践角度来看，在考虑采用体内基因治疗时的另一个考虑因素是逆转录病毒载体的定位。很清楚，由载体所携带的治疗基因不应该在所有组织和细胞中不加选择地表达，而只能在要求的靶细胞中表达。如果待转移的基因是用于切除特定肿瘤细胞的毒素基因的话，这一点尤为重要。很显然，切除其它非靶细胞是很不合在此之前，业已披露了若干会使所携带的治疗基因定位的逆转录病毒载体系统(Salmons和Gunzburg，1993)。这些方法中的大部分涉及将感染行为局限于预定细胞类型，或是用异源启动子指导转入特定类型细胞中的连锁的治疗基因或标记基因的表达。所用的异源启动子应当只能在这种类型的细胞中启动连锁基因的表达这种启动子在所述细胞中是有正常活性的。所述启动子已早先同标记基因或治疗基因一起被插入到所述逆转录病毒载体上的gag、pol或env基因位点上。
在所述基因旁侧的逆转录病毒长末端重复序列(LTR)带有逆转录病毒启动子，该启动子通常是非特异性的，它可以启动在许多不同类型细胞中的表达(Majors，1990)。有人报道过LTR启动子与异源内部启动子如在上文中所述的组织专一性启动子之间的启动子干扰。另外，业已知道逆转录病毒LTRs具有强增强子，它们可以独立地或是与逆转录病毒启动子一起干扰靠近该逆转录病毒的整合位点的细胞基因的表达。其机理已被证实为是因动物的致癌性所致(Van Lohuizen和Berns)。以上两个发现促进了自动失活载体(SIN)的发展，其中，逆转录病毒启动子在靶细胞内是功能性失活的(PCT/WO94/29437)。对所述载体的进一步修饰包括将启动子基因盒插入LTR片段，以产生双拷贝载体(PCT/WO89/11539)。不过，在这两种载体中，插入到载体主体上的或插入到LTR片段上的异源启动子直接同标记/治疗基因连接。
上文提及的早先所披露的带有缺失的3′LTR的SIN载体(PCT/WO94/29437)还使用了一个强异源启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子，由它代替逆转录病毒5′LTR启动子(无U3 5′LTR)启动所述载体结构在包装细胞系中的表达。在3′LTR中还有一个异源聚腺苷酸化信号(PCT/WO94/29437)。
本发明的目的是要构建一个新的逆转录病毒载体，可将其用作定位基因治疗的安全的基因转移载体，它与包装结构发生重组的可能性较少。这种新载体在3′LTR上带有异源启动子和/或调节因子，在感染之后，该启动子和/或调节因子被复制并易位至靶细胞的5′LTR，最终控制标记/治疗基因的表达，这些基因并不直接同启动子连接，而是插入载体的主体上。这种载体不能进行自动失活，而能进行启动子交换，给启动子转变(Promoter Conversion)取名为Procon。
由于启动子转变不会导致自动失活，因此，逆转录病毒载体在靶细胞内具有转录活性。不过，两个LTRs会在靶细胞内构成一个大的异源启动子/增强子序列。这样可以减少整合在靶细胞中的载体经过较长时间后发生失活的可能性，这种失活与已报导过常规载体的失活现象(Xu等，1989)相同；还可以减少与内源逆转录病毒序列发生重组的可能性，而这种重组会产生潜在的致病性可复制病毒，因而提高了该系统的安全性。
在本发明中，未对逆转录病毒载体结构的5′LTR进行修饰，该病毒载体在包装细胞中的表达由正常的逆转录病毒U3启动子启动。可以进行正常的逆转录病毒聚腺苷酸化，而且在3′LTR中没有异源聚腺苷酸化信号。这对于体内基因治疗方法的改进来说是重要的，因为尽管包装细胞在产生重组病毒，但是通过正常病毒启动子进行的正常生理调节，而且还可能涉及聚腺苷酸化的正常的病毒控制在很长时间内都在体内占据优势。
预计，对这种新逆转录病毒的进一步修饰包括细胞的序列，而不是异源启动子和/或调节因子。这使得与细胞的序列的位点专一性重组有更高的选择性，以便将逆转录病毒载体定向整合到缩主细胞基因组的特定位点(Saller，1994)。
为了实现上述及其它目的，本发明提供了一种能进行启动子转变的逆转录病毒载体，它包括结构U3-R-U5的5′LTR片段；一个或几个选自编码和非编码序列的序列；一个或多个选自编码和非编码序列的序列以及一个3′LTR片段，它包括完全或部分缺失的U3片段，其中，所述缺失的U3片段被一个多接头序列所取代，随后是R和U5片段。
所述多接头序列带有至少一个特有的限制位点，并且优选带有至少一个插入的异源DNA片段。所述异源DNA片段优选是选择的调节因子和启动子，其表达优选是靶细胞专一性的，但也可能是没有调节功能的DNA片段。
所述异源DNA片段优选与一个或几个细胞序列同源。所述调节因子和启动子优选可由反式作用分子调节。
通过下面对本发明优选实施方案的说明，可以理解本发明的其它目的、特征和优点。
所述靶细胞专一性调节因子和启动子选自下列因子中的一个或几个乳清酸性蛋白(WAP)，小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、β-乳球蛋白和酪蛋白专一性调节因子和启动子，胰腺专一性调节因子和启动子(包括碳酸酐酶11和β-葡糖激酶调节因子和启动子)，淋巴细胞专一性调节因子和启动子，(包括免疫球蛋白和MMTV淋巴细胞专一性调节因子和启动子)，以及MMTV专一性调节因子和启动子，MMTV专一性调节因子和启动子能赋予糖皮质激素反应性或指导在乳腺中的表达。所述调节因子和启动子优选调节所述逆转录病毒载体的至少一个编码序列的表达。所述LTR片段选自下列因子中的至少一个鼠白血病病毒(MLV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、鼠肉瘤病毒(MSV)、猴免疫缺损病毒(SIV)、人免疫缺损病毒(HIV)、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)、猪免疫缺损病毒(FIV)、猪白血病病毒(FELV)、牛白血病病毒(BLV)和Mason-Pfizer-猴病毒(MPMV)。
所述逆转录病毒载体优选是基于BAG载体(Price等，1987)或LXSN载体(Miller和Rosman，1989)。
所述编码序列优选是选自下列因子中的一个或几个标记基因、治疗基因、抗病毒基因、抗瘤基因和细胞因子基因。
所述标记和治疗基因优选选自下列因子中的一个或几个β-半乳糖苷酶基因、新霉素基因、单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因、嘌呤霉素基因、胞嘧啶脱氨酶基因、潮霉素基因、分泌碱性磷酸酶基因、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)基因、醇脱氢酶基因和次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因。
本发明另一个实施方案中设计改变或部分缺失至少一段逆转录病毒整合所需的逆转录病毒序列。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种逆转录病毒载体系统，它包括作为第一个部分的一个上述逆转录病毒载体，还包括一个包装细胞系，该细胞系具有编码待包装的所述逆转录病毒载体所需的蛋白质的至少一种逆转录病毒结构或重组逆转录病毒结构。
所述包装细胞系具有编码这种逆转录病毒蛋白的逆转录病毒结构或重组逆转录病毒结构，这种蛋白不能由所述逆转录病毒载体编码。所述包装细胞系优选选自包括psi-2、psi-Crypt、psi-AM、GP+E-86、PA317和GP+envAM-12，或选自任何用重组结构超感染的使能表达来源于其它有包膜的病毒的表面蛋白的因子。
本发明的另一种实施方案涉及使用具有缺乏整合酶功能的重组逆转录病毒结构的包装细胞系。
在把本发明的上述逆转录病毒载体引入逆转录病毒包装细胞系并感染所述靶细胞之后，提供一种逆转录病毒的原病毒，其中，在被感染靶细胞的逆转录过程中，所述多接头和插入所述3′LTR上的多接头里的任何序列都被复制，并在所得到的原病毒的3′LTR也在所得原病毒的5′LTR中出现。
本发明还包括本发明的逆转录病毒原病毒的mRNA以及根据本发明由逆转录病毒载体所产生的任何RNA。
本发明的另一个实施方案提供了用于通过体外和体内方式把同源和/或异源核苷酸序列导入人体或动物体内的非治疗方法，包括用本发明的逆转录病毒载体转染本发明逆转录病毒载体系统的包装细胞系，并用由该包装细胞系所产生的重组逆转录病毒感染靶细胞群。所述核苷酸序列选自下列因子中的一个或几个编码蛋白质的基因或该基因的一部分、调节序列和启动子。
所述逆转录病毒载体、逆转录病毒载体系统和逆转录病毒原病毒及其RNA可用来生产用于包括人在内的动物基因治疗的药用组合物。另外，还可将其定向整合到同源细胞序列中。
本发明应用了典型的逆转录病毒启动子转变原理。
所述逆转录病毒基因组由一个具有结构R-U5-gag-pol-env-U3-R的RNA分子组成(图2)。在逆转录过程中，该U5片段被复制并位于所产生的DNA分子的右手端，同时，U3片段也被复制并位于所产生的DNA分子的左手端(图2)。所得到的结构U3-R-U5被称为LTR(长末端重复序列)，因此它们是相同的并且是在该DNA结构或原病毒的两端重复的(Varmus，1988)。原病毒左手端的U3片段具有启动子(见下文)。该启动子启动一种RNA转录物的合成，该合成始于左侧U3和R片段之间的边界，终止于右侧R和U5片段之间的边界(图2)。该RNA被包装成逆转录病毒颗粒，并被转移到待感染的靶细胞里。在靶细胞中，该RNA基因组以上述方式再次进行反转录。
根据本发明，构建了一种逆转录病毒载体，其中，右侧的U3片段被改变(图3)，但保持了正常的左侧U3结构(图3)；利用位于左侧U3片段里的正常逆转录病毒启动子，可将所述载体转录成RNA。不过，所产生的RNA将仅带有改变了的右侧U3结构。逆转录之后，在感染的靶细胞中所述改变了的U3结构位于逆转录病毒结构的两端(图3)。
如果改变了的片段带有多接头(见下文)而不是U3片段，可以轻易地插入任何启动子，包括指导组织专一性表达的启动子，如WAP启动子(见下文)。这种启动子局限于用在所述靶细胞中，用于表达由该逆转录病毒载体所携带的连锁基因的表达。或者或除此之外，为了基因定向的目的，可用同源重组的方法将与一个或几个细胞序列同源的DNA片段插入所述多接头中(见下文)。
根据本发明，“多接头”是指短的人工合成的DNA片段，该片段上带有若干独特的限制位点，使得任何启动子或DNA片段都容易被插入。“异源的”一词是指在自然界中正常情况下非密切毗连的DNA序列的任意组合。
基因表达由启动子调节。缺乏启动子功能时基因将不能够表达。实际上，正常的MLV逆转录病毒启动子是非选择性的，即，它在大多数类型的细胞中都是有活性的(Majors，1990)。不过，若干现有启动子仅能在极为特殊的细胞类型中表现出活性。理想的候选方案是将这种组织专一性启动子用于调节逆转录病毒载体上的基因的表达是，和将治疗基因限制在特定的靶细胞中表达。
在所述包装细胞系中，所述逆转录病毒载体的表达是由U3片段上的正常的非选择性逆转录病毒启动子调节(图3)。然而，一旦该载体进入所述靶细胞，就会发生启动子转变，而且，治疗或标记基因，如b-半乳糖苷酶由选择导入多接头中的组织专一性启动子启动表达(图3)。事实上，不仅可将任何组织专一性启动子包括在该系统内，以便对多种不同的细胞类型进行选择定向，此外，在发生转变之后该逆转录病毒载体的结构和性质也不再与病毒类似。当然，从安全角度考虑，这具有极为重要的后果，因为普通的或现有的人工逆转录病毒载体易于同逆转录包装结构和/或内源逆转录病毒发生遗传重组，产生潜在地致病性的病毒。启动子转变(Procon)载体不同于逆转录病毒，因为转变之后它不再带有U3逆转录病毒启动子，从而减少了遗传重组的可能性。
所述逆转录病毒启动子结构被携带于LTR的U3片段里。LTRs上携带有使其能整合到靶细胞基因组上的信号。这种逆转录病毒原病毒的整合也可归因于病原性变化(Van Lohuizen和Berns，1990)。在本发明的一个实施方案中，Procon载体可以携带修饰的LTRs，而不再携带整合所需的信号。这又会提高这种载体系统的潜在安全性。
基因定向按照本发明的另一方面，可将所述逆转录病毒载体用于定向整合到靶细胞中。与诸如腺病毒的其它病毒相比，将原病毒DNA形式的逆转录病毒基因组整合到靶细胞中是对将逆转录病毒用作载体的一个重大发展，因为它能让转移的基因长期稳定地表达。不过，这种整合的随机性会对逆转录病毒载体的使用造成大的缺陷，因为它增加了细胞肿瘤抑制基因或原癌基因插入失活并从而诱发肿瘤的可能性(Van Lohuizen Berns，1990)。
业已将同源重组成功地用于把转染或显微注射的DNA定向整合特定的DNA位点上，并将其普遍用于构建“失效”转基因小鼠或动物(参见Capecchi，1989的综述；Bradley等，1992；Morrow和Kucherlapati，1993)。遗憾的是，借助这种纯物理方法的基因转移效率极低。相反，由逆转录病毒介导的基因转移十分有效，可机乎100％地感染细胞群。逆转录病毒基因转移与同源重组相结合，可以构成一种理想的基因座定向整合系统。
我们已研究了将长的同源DNA片段引入逆转录病毒上的不同位点，以促进通过同源重组进行整合的可行性(Saller，1994)。对基因转变和同源重组都进行了评价。用带有单拷贝HSV-tk基因的细胞系作为靶细胞，我们能够以高出以前由他人报道过的频率15倍的频率破坏靶序列(Ellis和Bernstein，1989)。重组的DNA片段的克隆证明了靶tK序列和逆转录病毒载体的存在(Saller，1994)。
为了进行定向整合，将与细胞的序列同源的DNA片段插入ProCon载体的多接头上。在感染靶细胞及逆转录之后，这些序列将出现在该原病毒的5′末端。已证实末端同源性有利于与同基因细胞序列(Bradley，1991)的同源重组(Bradley，1991)。通过感染携带有突变形式的同源序列的靶细胞，可导致重组，并从而修复突变序列。或是仅有同源序列重组到细胞基因组里，或是整个载体被插入(Saller，1994)。这种载体不仅可用于基因修复，还可用于指导带有治疗基因的逆转录病毒载体整合到所述基因组的特定基因座上，已知其不具有活性基因。这将导致上述插入激活或失活的可能性明显减少，并从而有助于使用逆转录病毒载体的安全性。
下面的实施例将对本发明进行进一步说明。不过，这些实施例并非用于限定本发明的范围，因为要对其做出明显改进是显而易见的，而且，对本领域的任何熟练技术人员来说，其它改进和替换也是显而易见的。
用于实施例本发明的重组DNA方法为标准方法，为本领域熟练技术人员所熟知，并在以下文献中有详细记载，例如“分子克隆”(Molecular Cloning)(Sambrook等，1989)和“分子克隆实践指南”(APractical Guide to MolecularCloning)(Perbal，1984)。
对下列实施例中涉及到的附图的简要说明如下图1逆转录病毒载体系统图2逆转录病毒基因组，逆转录图3ProCon原理图4PCR分析，MLV探针图5PCR分析，MMTV探针图6β-半乳糖苷酶在感染的NIH和EF43细胞中的表达图7β-半乳糖苷酶在感染的来自妊娠的小鼠初生乳腺中的表达图8在把病毒注射到妊娠的Balb/c小鼠的乳腺及皮肤之后β-半乳糖苷酶的表达图9β-半乳糖苷酶在感染的乳腺瘤细胞中的表达图10逆转录病毒载体通过同源重组进行的定向整合实施例1用带有乳腺专一性启动子的ProCon载体感染之后的乳腺专一性表达。
在被称为BAG的鼠白血病病毒(MLV)逆转录载体上(Price等，1987)，β-半乳糖苷酶基因是由LTR的U3片段上的滥交(即非组织专一性)MLV启动子启动(图3)。根据本发明，构建了一个BAG载体的衍生物，其中，位于3′LTR(图3)上的MLV启动子(U3)缺失并被一个多接头所取代，所述多接头有利于引入异源启动子。在被导入包装细胞系之后，所述缺少U3的BAG载体由5′LTR上的MLV启动子(U3)启动表达。在感染其靶细胞之后，由于在其生活周期中所发生的逆转录病毒基因组的重组，会使所述多接头在上述逆转录病毒基因组的两端被复制。因此，可以构建这样的逆转录病毒载体，其中，可由任何插入多接头中的异源启动子来操纵BAG的β-半乳糖苷酶基因在靶细胞中的表达(图3)。
根据上面所提出的原理，已将下述特殊启动子插入多接头片段或修饰的BAG载体小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子的几个亚片段，包括能赋予糖皮质激素反应性的片段和带有一个指导乳腺表达的因子的片段。
乳清酸性蛋白(WAP)启动子。该启动子控制WAP的表达，使其仅在妊娠并泌乳的啮齿动物的乳腺中产生。
用所构建的MMTV和WAP逆转录病毒载体感染各种细胞的感染研究，已证实了插入多接头的启动子对β-半乳糖苷酶基因表达的控制。
为了产生逆转录病毒载体颗粒，已把携带有MMTV和WAP的ProCon载体转染到包装细胞系GP+E86里(Markowitz等，1988)。通过新霉素抗性筛选(该抗性是由载体编码)，获得了能产生重组ProCon病毒的细胞的稳定群体及克隆。用含有病毒的该细胞群体的上清液感染小鼠乳腺细胞系EF43(Günzburg等，1988)及小鼠成纤维细胞系(Jainchill等，1969)。感染4天之后裂解靶细胞，并进行定量β-半乳糖苷酶分析，分析结果表明，由带有WAP的ProCon载体感染的每一种细胞都没有表达，而在由带有MMTV的ProCon载体感染的两种细胞中都能很好地表达(图6)。这一结果与WAP启动子的行为一致，该WAP启动子仅能在孕晚期和泌乳期在体内起作用，而不能以EF43细胞为代表的在大多数单纯的体外乳腺细胞培养体系中起作用。为了研究带有WAP的ProCon载体是否在复杂的由初生乳腺衍生的细胞系培养系统中有活性，对获自8-10天妊娠期小鼠(图7)或乳腺瘤(图9)的初生器官进行培养，并用转染细胞系的同一稳定转染群体的上清液感染。通过β-半乳糖苷酶活性证实，带有WAP启动子片段的Procon载体和带有MMTV启动子片段的Procon载体在该初生细胞(图7)和乳腺瘤衍生细胞(图9)中都有活性。
为了研究带有WAP和MMTV的ProCon载体在体内是否有活性，以及β-半乳糖苷酶的表达是否局限于体内乳腺，将含有ProCon病毒的介质原位注射到妊娠期为8-10天的小鼠的乳腺或皮肤里。5天后杀死小鼠，制备细胞提取物并进行β-半乳糖苷酶分析。带有WAP片段的Procon载体和MTV片段的ProCon载体都只能在妊娠的乳腺中表达，而不能在皮肤里表达(参见图8中的M和S)。因此，在体内，两个启动子的调节因子把表达局限于乳腺，而在体外，WAP启动子的调节因子保留其严格的组织专一性，但MMTV启动子的调节因子则不然。
这种带有组织专一性启动子和调节因子的ProCon载体可用于指导治疗基因在预定类型细胞、组织和器官中的表达。可用的治疗基因包括具有抗HIV和抗肿瘤作用的蜂毒肽基因，和能引起细胞死亡的基因(包括胸腺嘧啶激酶基因、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因和胞嘧啶脱氨酶基因，细胞色素P450基因，以及如SDI/WAF-1/CIP-1的与细胞周期调节有关的基因)。
实施例2证实由ProCon载体感染的细胞中的启动子转变，该载体原先就在3′LTR中携带有MMTV启动子。
将带有来自小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)的启动子片段的ProCon载体转染到一个包装细胞系里，并把所得到的重组载体颗粒用于感染所建立的人膀胱癌细胞系(EJ)。在含有新霉素类似物G418的培养基里对感染的细胞克隆进行选择(因为所用载体上带有由内部SV40启动子启动的新霉素抗性基因)。用感染的克隆之一和未转染的亲代EJ细胞制备DNA，并用所制备的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)。PCR反应是用两个引物中的一个进行的，该引物专一性识别并结合MMTV序列(图4和5中的A，B)或LTR的MLVR片段(图4中的C)，与此同时有一个引物位于标记基因里(图4和5)。由于所述标记基因引物仅位于MMTV(或MLVR片段)序列的下游，如果发生启动子转变，由MMTV引物所获得的正PCR信号与标记基因引物一起指示这一变化。在图4中，在同来自MLV序列的标记片段杂交之后显示出采用引物A、B或C的PCR产物，证实了所有3种产物都来源于MLV序列。片段的大小可以证实已发生了启动子转变。图5表示采用引物A和B并与MMTV特异探针杂交的PCR产物，再次证实已发生了启动子转变。
实施例3构建用于定向整合的ProCon载体可利用与上述实施例1中相同的BAG载体构建逆转录病毒载体，其中，可将与细胞序列同源的DNA序列插入到LTR中。所得到的载体可用于将插入到该载体的同源序列或该载体的全部或部分定向整合到宿主细胞基因组中的同源序列中。
按照以上提出的原理，已将单纯疱疹病毒(HSV)的胸腺嘧啶激酶(tk)基因的片段插入到修饰的BAG载体的多接头部分(tk突变体见图10，Saller，1994)。
业已建立起一个细胞系，它没有哺乳动物tk基因的功能性拷贝，而带有HSV-tk基因的一个拷贝(Saller，1994)。已用带有tk的BAG载体对该细胞系进行了感染，并筛选到了HSV-tk基因已被破坏的细胞(图10)。
上述实施例说明了本发明所提供的载体发生启动子转变的原理和结果。
参考文献Anderson，W.F.1992，“人体基因治疗”(Human gene therapy)，“科学”(Science)256808-813。Bradley，A.1991，“通过基因定向修饰哺乳动物基因组”(Modifying themammalian genome by gene taryeting)，“现代生物技术情报”(Curr.OpinBiotechnol.)2823-829。Bradley，A.，P.Hasty，A.Davis，和R.Ramirez-Solis，1992，“改造小鼠设想和期望”(Modifying the mousedestgn and desire)，“生物技术”(Bio/technology)10534-539。Capecchi，M.R.1989，“通过同源重组改变基因组”(Altering the genome byhomologous recombination)，“科学”(Science)2441288-1292。Ellis，J.和A.Bemstein，1989，“通过把基因转变成非同源性片段由逆转录病毒载体重组进行基因定向”(Ctene Targeting with Retroviral VectorsRecombination by Gene Conversion into Regions of Nonhomology)，“分子生物学”(Mol.Cell.Biol.)91621-1627。Emerman，M.和H.M.Temin，1986，“禽和鼠逆转录病毒载体的启动子抑制比较”(Comparison of promoter suppression in avian and murine retrovirusvectors)，“核酸研究”(Nucl.Acids Res.)149381-9396。Günzburg，W.H.，B.Salmons，A.Schlaeffli，S.Moritz-Legrand，WJones，N.H.Sarkar，和R.Ullrich，1988，“癌基因mil和ras的表达消除乳腺上皮细胞的体内分化”(Expression of the oncogenes mil and ras abolishesthe in vivo differentiation of mammary epithelial celis)，“致癌”(Carcinogenesis)91849-1856。Jainchill，J.L，S.A.Anderson，和G.J.Todaro，1969，“鼠肉瘤和白血病病毒鉴定使用接触抑制的小鼠细胞无性系”(Murine sarcoma and leukaemiavirusesassay using clonallines of contact-inhibited mouse cells)，“病毒学杂志”(J.Virol.)4549-553。Kotani，H.，P.B.Newton，S.Zhang，Y.L.Chiang，E.Otto，L.Weaver，R.M.BLaese，W.F.Anderson，和G.J.McGarrity，1994，“用于基因治疗的逆转录病毒载体的转导和生产的改进方法”(Improved methods of retroviralvector transduction and production for gene therapy)，“人类基因治疗”(HumanGene Therapy)519-28。Major，J.1990，“逆转录病毒长末端重复序列的结构和功能”(The structure andfunction of retroviral long terminal repeats)，“微生物学和免疫学的当令课题”(Cuvr.Tops.In Micro.Immunol.)15749-92。Markowitz，D.，S.Goff，和A.Bank，1988，“用于基因转移的一个安全包装系不同的病毒基因位于两个不同的质粒上”(A safe packaging line forgene transferseporating viral genes on two different plasimids)，“病毒学杂志”(J.Virol)621120-1124。Miller，A.D和G.J.Rossman，1989，“用于基因转移和表达的改进逆转录病毒载体”(Improved retroviral vectors for gene transfer and expression)，“生物技术”(Biotechnigues)7980-990。Morrow，B.和R.Kucherlapati，1993，“通过同源重组在哺乳动物细胞中进行基因定向”(Gene gargeting in mammalian cells by homologousrecombination)，“现代生物技术情报”(Current Opinion in Biotechnology)4577-582。Perbal，B.1984，“分子克隆实践指南”(A Practical Guide to MolecularCloning)，John Wiley & Sons。Price，J.，D.Turner，和C.Cepko，1987，“通过逆转录病毒载体介导的基因转移对脊椎动物的神经系统进行线性分析”(Lineage analysis in thevertebrate nervous system by retrovirus-mediated gene transfer)，“美国全国科学院学报”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84156-160。Rosenbery，S.A.，Anderson，W.F，Blaese，R.M.等，1992，“用通过插入白介素一2基因修饰的身体癌细胞对癌症患者进行免疫”(Immunization ofcancer patients using autologous cancer cells modified by insertion of the gene forinterleukin-2)，“人类基因治疗”(Hum.Gene Ther.)375-90。Saller，R.M.1994，“用于体内基因治疗的定向和组织专一性逆转录病毒”(Design von locus-und gewebespezishen retroviralen Vektoren fuer eine in VivoGentherapit)，“医学大纲”(Doctoral thesis)，Ludwigs-MaximiliansUniversity，Mumich，Germany。Salmons，B.和W.H.Günburg，1993，“用于基因治疗的逆转录病毒载体定向”(Targeting of retroviral vectors for gene therapy)，“人类基因治疗”(HumanGene Therapy)4129-141。Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis，l989，“Molecular Cloning”(Molecular Cloning)，“冷泉港实验室出版社”(Cold Spfing Harbor LaboratortyPress)，New York，USA。Van lohuizen和Bems，1990，“通过缓慢地转化逆转录病毒致肿瘤发生-一种新方法”(Tumorigenesis by slow-transforming retroviruses-an update)，“生物化学和生物物理学(期刊)”(Biochim.Biophys.Acta)，1032213-235。Varmus，H.1988，“逆转录病毒”(Retroviruses.)，“科学”(Science)2401427-1435。Xu，L.，J.-K.Yee，J.A.Wolff和T.Friedman，1989，“影响莫洛尼氏鼠白血病病毒基载体的长期稳定性的因素”(factors Affecting long-Term Stabilityof Moloney Murine leukemia Virus-Based Vectors.)，“病毒学”(Virology)171331-340。
权利要求
1.一种能进行启动子转变的逆转录病毒载体，该病毒载体包括结构U3-R-U5的一个5′LTR片段；一个或几个选自编码和非编码序列的序列；以及一个包括全部或部分缺失的U3片段的3′LTR片段，其中，所述缺失的U3片段由多接头序列取代，随后是R和U5片段。
2.如权利要求1的逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体包括结构U3-R-U5的一个5′LTR片段；一个或几个选自编码和非编码序列的序列；以及一个包括全部或部分缺失的U3片段的3′LTR片段，其中，所述缺失的U3片段由多接头序列取代，随后是R和U5片段。
3.如权利要求1的逆转录病毒载体，其特征在于所述多接头序列带有至少一个特异性的限制位点。
4.如权利要求3的逆转录病毒载体，其特征在于所述多接头序列带有至少一个插入的异源DNA片段。
5.如权利要求4的逆转录病毒载体，其特征在于所述异源DNA片段选自调节因子和启动子中的一个或几个。
6.如权利要求5的逆转录病毒载体，其特征在于所述调节因子和启动子的表达是靶细胞专一性的。
7.如权利要求6的逆转录病毒载体，其特征在于所述靶细胞专一性的调节因子和启动子选自下列组份中的一个或几个WAP、MMTV、b-乳球蛋白和酪蛋白专一性调节因子和启动子，胰腺专一性调节因子和启动子(包括碳酸酐酶11和b-葡糖激酶调节因子和启动子)，淋巴细胞专一性调节因子和启动子(包括免疫球蛋白和MMTV淋巴细胞专一性调节因子和启动子)，以及能赋予糖皮质激素反应性或指导乳腺表达的MMTV专一性调节因子和启动子。
8.如权利要求5-7中任一项的逆转录病毒载体，其特征在于所述调节因子和启动子调节所述逆转录病毒的至少一个编码序列的表达。
9.如权利要求1-8中任一项的逆转录病毒载体，其特征在于所述LTR片段选自下列组份的LTRs中的至少一个MLV、MMTV、MSV、SIV、HIV、HTLV、FIV、FelV、BLV和MPMV的LTRs。
10.如权利要求1-9中任一项的逆转录病毒载体，其特征在于所述逆转录病毒载体是BAG载体。
11.如权利要求1-10中任一项的逆转录病毒载体，其特征在于所述编码序列选自下列组份中的一个或几个标记基因，治疗基因、抗病毒基因、抗肿瘤基因和细胞因子基因。
12.如权利要求11的逆转录病毒载体，其特征在于所述标记或治疗基因选自下列组份中的一个或几个b-半乳糖苷酶基因和新霉素基因，单纯疱疹病毒，胸腺嘧啶激酶基因，嘌呤霉素基因，胞嘧啶胞脱氨酶基因，潮霉素基因，分泌碱性磷酸酶基因，鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)基因，醇脱氢酶基因和次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因。
13.如权利要求1-12中任一项的逆转录病毒载体，其特征在于所述编码逆转录病毒蛋白的编码序列中的至少一个被改变或至少部分缺失。
14.如权利要求1-13中任一项的逆转录病毒载体，其特征在于涉及逆转录病毒整合的逆转录病毒序列被改变或至少部分缺失。
15.如权利要求1-14中任一项的逆转录病毒载体，其特征在于所述异源DNA片段与一个或几个细胞序列或该序列的一部分同源。
16.如权利要求1-15中任一项的逆转录病毒载体，其特征在于所述调节因子可由反式作用分子调节。
17.一种逆转录病毒载体系统，该逆转录病毒载体系统包括作为第一个部分的一个如权利要求1-16中任一项的逆转录病毒载体，和一个包装细胞系，该包装细胞系具有至少一个编码包装所述逆转录病毒载体所需的蛋白质的逆转录病毒或重组逆转录病毒结构。
18.如权利要求17的逆转录病毒载体，其特征在于所述包装细胞系具有编码逆转录病毒蛋白的逆转录病毒结构或重组逆转录病毒结构，该逆转录病毒蛋白不能由权利要求1-16中任一项的逆转录病毒载体编码。
19.如权利要求17或18的逆转录病毒载体，其特征在于所述包装细胞系选自psi-2、psi-Crypt、psi-AM、GP+E-86、PA317和GP+envAM-12。
20.一种在体外和在体内将同源或异源核苷酸序列导入人或动物细胞的治疗或非治疗方法，该方法包括用如权利要求1-16中任一项的逆转录病毒载体转染如权利要求17-19中任一项的逆转录病毒载体系统的包装细胞系，还包括用由所述包装细胞系所产生的重组逆转录病毒感染靶细胞群体。
21.如权利要求20的治疗或非治疗方法，其特征在于所述核苷酸序列选自下列组份中的一个或几个编码蛋白质的基因或基因的部分、调节序列或启动子。
22.通过在如权利要求17-19中任一项的逆转录病毒载体系统中复制如权利要求1-16中任一项的逆转录病毒载体所产生的一种逆转录病毒原病毒，其特征在于，在感染的靶细胞中的逆转录过程中，所述多接头或任何插入到3′LTR的所述多接头中的序列被复制，并出现在所产生的原病毒的5′LTR和3′LTR中。
23.将权利要求1-16中任一项的逆转录病毒载体用来生产可用于包括人在内的哺乳动物的基因治疗的药用组合物。
24.将权利要求17-19中任一项的逆转录病毒系统用来生产可用于包括人在内的哺乳动物的基因治疗的药用组合物。
25.将权利要求22的逆转录病毒原病毒用来生产可用于包括人在内的哺乳动物的基因治疗的药用组合物。
26.将权利要求1-16中任一项的逆转录病毒载体用于整合至所述同源的细胞序列上的定向整合。
27.将权利要求17-19中任一项的逆转录病毒载体用于整合至所述同源的细胞序列上的定向整合。
28.将权利要求22的逆转录病毒原病毒用于整合至所述同源的细胞序列上的定向整合。
29.如权利要求22的逆转录病毒原病毒的mRNA。
30.如权利要求1-16中任一项的逆转录病毒载体的RNA。
31.用权利要求1-16中任一项的逆转录病毒载体转染权利要求17-19中任一项的逆转录病毒载体系统的包装细胞系，并在合适条件下培养该细胞系所得到的重组逆转录病毒颗粒。
32.一种药用组合物，该药用组合物含有治疗有效剂量的如权利要求31的重组逆转录病毒颗粒。
全文摘要
本发明涉及能进行启动子转变的逆转录病毒载体，它包括结构U3-R-U5的一个5′LTR片段；一个或几个选自编码和非编码序列的序列；以及包括全部或部分缺失的U3片段的3′LTR片段，其中，所述缺失的U3片段被一个多接头序列取代，其后是R和U5片段。所述逆转录病毒载体能进行启动子转变，并可用作定位基因治疗的基因转移载体。
文档编号A61K48/00GK1159210SQ95194903
公开日1997年9月10日 申请日期1995年9月1日 优先权日1994年9月2日
发明者沃尔特·H·冈兹伯格, 罗伯特·M·萨勒 申请人:Gsf环境与健康研究中心有限公司