一种人重组白介素-3的表达纯化方法

专利名称：一种人重组白介素-3的表达纯化方法
技术领域：
本发明涉及应用重组DNA技术生产基因工程蛋白药物技术，具体来说涉及到一种 高效的人重组白介素-3(rhIL-3)的表达纯化方法。
背景技术：
白细胞介素3(IL_3)又称为多能集落刺激因子(multi-csf)，主要由活化的 cd4+t细胞产生。其主要作用为促进骨髓中多能造血干细胞的定向分化与增殖，产生各种类 型的血细胞。因不在骨髓基质细胞生成，所以并不经常与造血相关，它主要参与人体的防御 机能，是反应产生的炎症性细胞因子。此外il-3还可调节多种成熟细胞的生长、分化及相 关的基因表达，如c-myc、il-2r α基因等。il_3分子量约为15kd，其化学本质为糖蛋白。 人类的il-3基因位于第5号染色体长臂区，1987年人il-3克隆成功。成熟的人IL-3分子 由133个氨基酸组成，分子量为25-28kD。IL-3受体由两条不同链组成的异源双体，分子量 为140kD. IL-3具有刺激多能造血干细胞、髓样、红样、巨噬、前单、单核、中性、嗜酸及肥大 细胞的分化增殖。临床上，rhIL-3主要用于治疗骨髓功能衰竭、血小板减少等造血功能障 碍性疾病。同时，可作为放疗、化疗的辅佐用药。预防和治疗放化疗后的骨髓抑制以及骨髓 移植后的骨髓重建。由于正常情况下IL-3的水平受到精确的调控，而从白血病患者体内分离出的白 血病细胞在体外要维持其存活与增殖，在培养体系中需加外源性IL-3等造血生长因子.即 使无造血因子维持。其本身亦要自分泌某些造血因子，如白血病细胞系WEHI-3B能自发地 分泌IL-3，而鼠源性的IL-3就是从该细胞株中克隆成功的，提示IL-3与某些白血病的发生 与发展有着极其密切的关系。于红细胞生成素(EPO)存在时.rhIL-3能明显增加骨髓BFU-E 和CFU-GEMM的产率.BFU-E集落的体积增大.血红蛋白含量增多。rhIL_3还能与11-12协 同作用，增加外周血BFU-E和CFU-GM的产率。IL-3除了对白血病细胞起作用外，还能刺激 非造血系肿瘤细胞的克隆生长并能促进肿瘤在体内的转移过程。当临床上使用IL-3等治 疗肿瘤放化疗后的骨髓抑制时，同时亦存在着刺激剩余肿瘤组织生长的危险性。支气管哮喘是一种典型的特应性疾病。IL-3在哮喘炎症反应中的作用非常显著。 哮喘患者的支气管粘膜、肺泡灌洗液及外周血中IL-3水平的升高。研究发现rhIL-3对成 熟的嗜酸粒细胞有调节作用，如促进体外嗜酸粒细胞的活存，增强嗜酸粒细胞的细胞毒和 吞噬作用。IL-3能促使嗜酸性粒细胞释放白三烯而增强其细胞毒性，并刺激嗜酸性粒细胞 向活化型转化。此外，IL-3不但作用于嗜酸性粒细胞，而且作用于中性粒细胞和肥大细胞。 这些细胞因子对嗜酸性粒细胞及其它炎症细胞反应的调控作用.是哮喘发病过程中的重 要免疫事件，是启动哮喘气道炎症并使其持续存在的关键因素。IL-3除了对嗜酸性粒细胞 发挥作用外，在嗜碱性粒细胞引发的过敏反应中也充当了重要的角色。rhIL-3具有刺激多谱系造血细胞的作用特点，临床上主要用于治疗化疗或放疗所 致骨髓造血功能抑制，尚试用于骨髓移植后造血功能恢复、MDS、AA和DBA。rhlL_3的副作 用较大，其中部分限制剂量的副作用是由于rhIL-3引起体内释放组胺等炎症介质造成。国外采用基因工程技术生产出强效IL-3受体激动剂，其导致外周血自细胞释放炎症介质的 作用相对较弱。随着对IL-3作用机制及临床应用研究的不断深入，IL-3作为药物，其需求量也大 大增加。目前，市场上主要利用原核表达系统(主要是大肠杆菌)或昆虫细胞对其进行表 达，没有利用毕赤酵母成功表达并纯化到IL-3的报道。大肠杆菌的表达产物通常以包涵体 形式存在，要通过变性复性得复杂操作才能得到活性形式的IL-3，从而减少了活性蛋白的 产率；另外，原核宿主表达尤其是在大肠杆菌中表达，因为LPS的存在而产生毒素性，因此 往往需要对表达纯化产物的毒性进行分析测定；最后，要得到高纯度的蛋白往往需要经过 多步纯化操作处理，纯化的步骤越多，蛋白质的得率就会越低，且更可能导致目标产物的失 活。虽然，昆虫细胞也能表达IL-3蛋白，但其成本高昂且产率很低。因此，目前市场上的 rhIL-3重组蛋白价格异常昂贵。本发明首次利用毕赤酵母成功实现了高活性的rhIL-3的 大量表达。

发明内容
本发明的目的是提供一种高效筛选高水平分泌表达人白介素_3的酵母转化子及 其纯化方法，根据该方法可获得稳定、高效分泌表达rhIL-3的毕赤酵母转化子并高效快 速纯化到该rhIL-3，该重组蛋白是经不同糖基化修饰的人IL-3蛋白，其主要分子量约在 19kDa和22kDa。利用镍亲合层析可以快速将蛋白从发酵上清液中分离出来，再利用DEAE 阴离子交换法可以获得高纯度的rhIL-3蛋白，利用该方法得到的rhIL-3具有很好的生物 学活性。实现上述目的的技术方案如下一种高效生产rhIL-3的方法，包括以下步骤(1)克隆人IL-3基因以人血白细胞中提取的总mRNA为模板，先用RT-PCR扩增 总cDNA，再以该cDNA为模板，用特异引物扩增出完整hIL_3基因片段，所用IL-3特异引物 中引入Xho I酶切位点和在未端引入Xba I酶切位点；回收PCR产物连接到质粒pMD20_T 载体，得质粒rhIL-3/pMD20-T，经过测序确定为正确表达序列； (2)构建真核表达载体将表达载体pPICZ α A和质粒rhIL-3/pMD20_T经过Xho I 及Xba I双酶切后纯化回收，并利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pPICZ α A/IL-3 ；(3)转化重组载体到真核酵母宿主中重组载体pPICZ α A/IL-3用SacI单酶切线 性化后，用电击转化法转入毕赤酵母X-33宿主菌中；经过Zeocin筛选得到阳性克隆，阳性 克隆利用聚合酶链式反应得到了验证；(4)高水平分泌表达酵母转化子的筛选阳性克隆转接至含有高浓度Zeocin 3000 μ g/mL的YPD平板，筛选到了高Zeocin抗性的转化子，高抗性转化子在BMGY培养 基培养至光密度值> 10，离心收集细胞沉淀，用BMMY培养基重悬细胞并使其甲醇浓度为 1.0%,于诱导后的Oh，24h，48h和72h时取样，样品经SDS-PAGE分析，得到了高水平分泌表 达rhIL-3酵母转化子，在摇瓶条件下的表达情况，该转化子表达的rhIL-3超过40mg/mL ；(5)诱导上清液于4°C离心，收集离心后的上清液，0. 3M NaCl、20mM咪唑、20mM TrispH 8. O透析后，利用镍亲合层析柱于ATKA-HPLC系统中纯化，0.3M NaCl、40mM咪唑、 20mMTris pH8. O缓冲液漂洗后，利用0. 3M NaCl、250mM咪唑、20mM Tris pH8. O缓冲液洗脱收集的样品，上述蛋白样品利用20mM Tris、PH8. 0的缓冲液透析过夜，利用DEAE柱于AKTA 系统中纯化，0-0. 5M NaCl,20mM Tris pH8. 0线性洗脱，收集mAu > 50的洗脱液，蛋白样品 经浓缩后冻存。经质谱分析，结果表明该方纯化的IL-3是经不同程度糖基化的IL-3，其最主要蛋 白的分子量分别经为18995. 694Da和22317. 469Da，该纯化得到的蛋白具有很高的生物学 活性。优选地，所述rhIL-3特异引物为il-3-for 5，-GCCTCGAGAAAAGAGCTCCCATGACCCAGAC-3，il-3-rev 5，-CGTCTAGAAAGATCGCGAGGCTCAAAG-3，用本发明所述的生产rhIL-3的方法具有显著的优势一方面，它能够防止宿主菌 对表达产物的降解、减轻宿主细胞代谢的负荷以及表达产物对宿主的毒性作用；二是能够 促进分泌蛋白按适当的方式折叠、恢复其天然构象；三是毕赤酵母在表达重组蛋白的同时 进行适度的糖基化修饰；四是表达产物带有HIS及C-MYC标签，摸索出一条有效纯化活性重 组hIL-3的方法；五是经质谱分析表明利用本纯化方法得到的IL-3经糖基化修饰，其主要 蛋白分子量大小为约法19kDa和22kDa ；六是测定了毕赤酵母表达IL-3的生物活性，测定 结果表明毕赤酵母表达的rhIL-3在低浓度下(0. 5ng)表现生物学活性(MTT法)。本发明探索出一套最优组合的用真核宿主毕赤酵母高效表达和纯化IL-3的方 法，既保证了 IL-3的生物学活性也高效地获得了大量稳定蛋白。


图1，真核表达载体pPICZaA/IL-3构建示意图；图2，毕赤酵母转化子的PCR验证电泳分析示意图；图3，高水平酵母表达子的筛选及摇瓶条件下hIL-3不同诱导时间的SDS-PAGE分 析示意图；图4，rhIL-3的镍亲合纯化蛋白的SDS-PAGE分析及分子量较大的蛋白的质谱鉴 定；图5，rhIL-3的镍亲合纯化蛋白的SDS-PAGE分析及分子量较小蛋白的质谱鉴定；图 6，IL-3 的 DEAE 纯化；图7，质谱分析IL-3的分子量大小；图8，rhIL-3生物学活性的结果示意图。
具体实施例方式本发明选用毕赤酵母X-33菌株，整合性表达质粒pPICZaA载体均购自美国 Invritrogen 公司。所用培养基配方如下1)酵母生长培养基(BMGY)完全溶解IOg酵母提取物，20g蛋白胨，定容到700mL。121 °C蒸气高压灭菌 15-20min，冷却到室温，加入 IOOmL IM 磷酸钾溶液，IOOmL YNB, 2mL 500*B, IOOmL 10*GY ；2)酵母诱导培养基(BMMY)
完全溶解IOg酵母提取物，20g蛋白胨，定容到700mL。121 °C蒸气高压灭菌 15-20min,冷却到室温，加入 IOOmL IM 磷酸钾溶液，IOOmL YNB, 2mL500*B, 100mL10*M ；3) YPD液体培养基完全溶解IOg酵母提取物，20g蛋白胨，IOg葡萄糖，定容到lOOOmL，121°C蒸气高压 灭菌15-20min。(固体YPD培养基向YPD液体培养基中加入18g琼脂，即得YPD固体培养 基，用于制备YPD平板)所述高效rhIL-3的表达纯化方法，主要包括以下步骤1、克隆rhIL-3全基因设计一对引物，以从人血白细胞中提取的总mRNA为模板，先用RT-PCR扩增总 cDNA，用IL-3特异引物扩增出完整人重组IL-3基因片段，PCR条件为954°C预变性， 45min，一个热循环；94°C热变性30s，55°C褪火30s，72°C延伸45s，30个热循环；72°C复性 IOmin0所获得的扩增片断连接到pMD20-T载体(购自于广州TAKARA公司)，用PCR，酶切 和核酸测序鉴定，测定序列与Genebank公布的IL-3的序列一致。IL-3特异引物 il-3-for 5’ -GCCTCGAGAAAAGAGCTCCCATGACCCAGAC-3’il-3-rev :5，-CGTCTAGAAAGATCGCGAGGCTCAAAG-3，2、构建毕赤酵母分泌型表达载体pPICZ α A/IL-3 1)用Xho I和Xba I双酶切重组质粒rhIL-3/pMD20_T，获得目的片断rhIL_3，反 应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)质粒 rhIL-3/pMD20_T15μ L 10 X H 缓冲液5 μ L Xho I5U Xba I5U 无菌水至 50 μ L 2)用Xho I和Xba I双酶切pPICZ α Α,获得载体片断，反应体系如下(所用内切
酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)质粒 pPICZ α A15μ L 10 X H 缓冲液5 μ L Xho I5U Xba I5U无菌水至50 μ L3)由1)及2)步后所得目的片断和载体片断，DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒 购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行。构建示意图见图1(从该图可看出， 表达的重组蛋白含有有His X 6标签和C-MYC标签)。4)回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司)进行连 接反应，目的基因准确插入到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内，反应体系如 下质粒pPICZ α A 片段1 μ L目的片段落3 μ L
10X缓冲液 1 μ L14连接酶 0. 5μ L无菌水 至 10 μ L得重组载体pPICZaA/IL-3。3、转化重组质粒至毕赤酵母X-33 将10 μ g经Xho I和Xba I双酶切pPICZ α A验证的质粒线性化后(Sac I)溶解在 10 μ LMilliQ水中，与80 μ L Χ_33混均，转至0. 2cm冰预冷的电转化杯中；按照Invitrogen 公司操作手册电转化法将重组载体转化到宿主毕赤酵母菌X-33中。转化后用含有IOOyg/ mLZeocin 抗生素的 YPD(Yeast extract peptone dextrose)平板进行筛选,利用 PCR 对转 化子进行了验证(以5’ Fac和3’ AOXl为引物，PCR电泳结果如图2所示)。4、高水平分泌表达酵母转化子的筛选阳性克隆转接至含有500 μ g/mL Zeocin的YPD平板，筛选到了 Zeocin抗性的转 化子；能在500 μ g/mL Zeocin的YPD平板的转化子利用YPD液体培养基将YPD平板的菌落 洗下，经稀释后，涂布到1500 μ g/mL Zeocin的YPD平板，再将1500 μ g/mL Zeocin的YPD 平板生长的转化子经稀释后涂布到3000 μ g/mL Zeocin的YPD平板，最后得到最高抗性为 3000μ g/mLZeocin的转化子以BMGY培养基培养至光密度值> 10. 0，离心收集细胞，用BMMY 培养基重悬细胞并使其甲醇浓度为1. O %，诱导72小时后，经SDS-PAGE分析，得到了高水平 分泌表达rhIL-3酵母转化子(结果如图3-A所示)，摇瓶条件下，该转化子表达的rhIL_3 超过 40mg/L。5、rhIL-3在摇瓶条件下的扩大表达高水平分泌表达酵母转化子于IL BMGY培养基培养至光密度值> 10，离心收集细 胞，用150mL BMMY培养基重悬细胞并使其甲醇浓度为1. 0%，每24小时取样一次并补加甲 醇一次至终浓度为1%，经诱导120小时后，各时间段的样品测定其总蛋白含量及菌体温 得，所得样品上清经SDS-PAGE分析。在扩大摇瓶诱导条件下，该转化子表达的rhIL-3超过 40mg/L ；摇瓶条件下，诱导96小时左右，rhIL_3的表达量达到最高值，再延长诱导的时间会 其表达水平没有明显提高。SDS-PAGE电泳结果如图3-B所示，在约18KDa和22KDa处存在 两条特异表达的蛋白条带(图3-B)。6、rhIL-3的镍亲合纯化诱导上清液于4°C离心，收集离心后的上清液，0. 3M NaCl、20mM咪唑、20mM Tris pH8. 0透析后，利用镍亲合层析柱于ATKA-HPLC系统中纯化，0. 3M NaCl、40mM咪唑、20mM TrispH8. 0缓冲液漂洗后，利用0. 3M NaCl、250mM咪唑、20mM Tris ρΗ8· 0缓冲液洗脱收集 的样品，上述蛋白样品利用20mM Tris, PH8. 0的缓冲液透析过夜，利用DEAE柱于AKTA系 统中纯化，0-0. 5M NaCl、20mM Tris pH8. 0线性洗脱，收集mAu > 50的洗脱液，蛋白样品经 SDS-PAGE，结果表明，纯化到的蛋白是两条主带分别为约19K和22K的蛋白(图4)。说明表 达的蛋白带有正确的HisX6标签和C-MYC标签，能利用镍亲合纯化有效纯化得到该重组蛋 白。7、肽脂纹图谱分析及比对镍亲合纯化到的蛋白经SDS-PAGE分析后，发现两条大小分别为19K和22K的蛋 白，从胶上切下两条主带，进行肽指纹图谱分析，结果表明，两蛋白都是IL-3(图4及图5)，说明IL-3在酵母中的表达产物经不同程度的糖基化修饰。8、DEAE 进一步纯化诱导上清液于4°C离心，收集离心后的上清液，0. 3M NaCl、20mM咪唑、20mM Tris pH8. 0透析后，利用镍亲合层析柱于ATKA-HPLC系统中纯化，0. 3M NaCl、40mM咪唑、20mM TrispH8. 0缓冲液漂洗后，利用3M NaCl、250mM咪唑、20mM Tris pH8. 0缓冲液洗脱收集的 样品，上述蛋白样品利用20mM Tris, PH8. 0的缓冲液透析过夜，利用DEAE柱于AKTA系统 中纯化，0-0. 5M NaCl、20mM Tris pH8. 0线性洗脱，收集mAu > 50的洗脱液，蛋白样品经 SDS-PAGE，结果表明，经DEAE纯化后，蛋白纯度明显提高(图6)。9、IL-3的分子量大小分析DEAE纯化得到的蛋白经丙酮沉淀后，质谱分析分子量的大小，结果如图7示，表明 纯化到的IL-3是经糖基化修饰的蛋白，分子量分别为18995. 694Da和22317. 469Da。，与 SDS-PAGE的结果相符。10、rhIL-3A的生物学活性分析A 将BAF3细胞于含10ng/ml商业化大肠杆菌表达的鼠IL-3蛋白的1640RPMI培养 基(含10% FBS)中，于IOcm培养皿内培养48小时，离心分离细胞，再用无IL-3的1640RPMI 培养基(含10 % FBS) IOmL洗涤细胞两次，离心，得到细胞，利用无IL-3的1640RPMI培养 基(含10% FBS)重悬细胞，并调整细胞浓度至约一万个细胞/毫升，将细胞悬液接种至96 孔细胞培养板，每孔接种IOOyL0向上述96孔板中分别加入终浓度为0、0. 1、0· 5、1、5、10、 20、50ng/mL的本发明表达纯化到的IL-3，每个浓度分别做6重复孔；于温箱中培养48小 时；向各孔中加入10微升5mg/mL的MTT，于培养箱中温育4小时，利用移液枪小心将培养 液上清吸干净，向每孔中加入100 μ L的DMSO于震荡器中震荡IOmin充分溶解，测定570nm 光值。所测结果表明，酵母表达的IL-3具有生物学活性，在极低浓度下(0. 5ng/mL)纯化得 到的rhIL-3具有良好的生物学活性(结果如图8-A所示)。B 将BAF3细胞于含10ng/ml商业化大肠杆菌表达的鼠IL-3蛋白的1640RPMI 培养基(含10% FBS)中，于IOcm培养皿内培养48小时，离心分离细胞，再用无IL-3的 1640RPMI培养基IOmL洗涤细胞两次，离心，得到细胞，利用无IL-3的1640RPMI培养基重 悬细胞，并调整细胞浓度至约一百万个细胞/毫升，将细胞悬液接种至6孔细胞培养板，每 孔接种2000 μ L，温箱中无血清饥饿12小时。向上述6孔板中分别加入终浓度为0、1、10、 20、40ng/mL的IL-3，温箱培养15分钟，离心收集细胞，并用冰冷的PBS洗细胞两次，RIPA裂 解细胞，并提取蛋白，SDS-PAGE分，WB分析ρ-ERK及p_AKT的变化，结果表明IL_3能激活 P-ERK及ρ-ΑΚΤ的磷酸化(结果如图8-B所示)，进一步证实了表达产物的生物活性。以上仅为本发明的具体实施例，并不以此限定本发明的保护范围；在不违反本发 明构思的基础上所作的任何替换与改进，均属本发明的保护范围。
权利要求
1.一种人重组白介素-3的表达纯化方法，其特征在于主要包括以下步骤(1)克隆人IL-3基因以从人血白细胞中提取的总mRNA为模板，先用RT-PCR扩增总 cDNA，再以该cDNA为模板，用特异引物扩增出完整hIL_3基因片段，所用IL-3特异引物中 引入BioI酶切位点和在未端引入)(ba I酶切位点；回收PCR产物连接到质粒pMD20_T载 体，得质粒rhIL-3/pMD20-T，经过测序确定为正确表达序列；(2)构建真核表达载体将表达载体pPICZα A和质粒rhIL-3/pMD20-T经过Β ο I及 XbaI双酶切并纯化回收，并利用T4 DNA连接酶连接，得重组载体pPICZ α A/rhIL-3 ；(3)转化重组载体到真核酵母宿主中重组载体pPICZaA/rhIL-3用McI单酶切线性 化后，用电击转化法转入毕赤酵母X-33宿主菌中；经过kocin筛选得到阳性克隆；(4)高水平分泌表达酵母转化子的筛选阳性克隆转接至含有500yg/mLkocin的 YPD平板，筛选到了 ^ocin抗性的转化子；将^ocin抗性的转化子利用YPD液体培养基洗 下，经稀释后，涂布到1500 μ g/mL Zeocin的YPD平板，将1500 μ g/mL Zeocin的YPD平板生 长的转化子经稀释后涂布到3000 μ g/mL kocin的YPD平板，得到高抗性转化子；再以BMGY 培养基培养至光密度值> 10.0，离心收集细胞，用BMMY培养基重悬细胞并使其甲醇浓度为 1. 0%，诱导72小时后，经SDS-PAGE分析，得到了高水平分泌表达rhIL_3酵母转化子；(5)利用BMMY大量诱导表达，诱导后的酵母转化子上清液，经0.3M NaCl、20mM咪唑、 20mM Tris pH 8. O透析后，利用镍亲合层析柱于ATKA-HPLC系统中纯化，0. 3M NaCl、20mM 咪唑、20mM Tris pH8. O 缓冲液漂洗后，利用 0. 3M NaCl、250mM 咪唑、20mM Tris pH 8. O 缓 冲液洗脱收集的样品；上述蛋白样品利用20mM Tris, PH8. O的缓冲液透析过夜，利用DEAE 柱于AKTA系统中纯化，0-0. 5M NaCl、20mM Tris pH8. O线性洗脱，收集mAu > 50的洗脱液， 蛋白样品经浓缩后即得人重组白介素_3。
2.根据权利要求1所述的表达纯化方法，其特征是所述步骤(1)所述特异引物为il-3-for :5’ -GCCTCGAGAAAAGAGCTCCCATGACCCAGAC-3，il-3-rev :5’ -CGTCTAGAAAGATCGCGAGGCTCAAAG-3，。
3.根据权利要求1或2所述的表达纯化方法得到的人重组白介素_3，其是经糖基化修 饰的蛋白，分子量分别为18995. 694Da和22317. 469Da。
全文摘要
本发明公开了一种高效表达人重组白介素-3(rhIL-3)的毕赤酵母转化子及其纯化方法，真核宿主为毕赤酵母X-33，主要包括以下步骤克隆人IL-3基因；构建真核表达载体并转化其到真核酵母宿主中；通过筛选，得到高水平分泌表达的酵母转化子，酵母表达的IL-3存在糖基化和非糖基化的两种形式；利用摇瓶扩大培养，培养液上清经透析后经镍亲合纯化后再经DEAE阴离子柱进一步纯化，纯化产物进行了质谱鉴定分析，结果表明，表达出的IL-3是经不同糖基修饰的IL-3，该IL-3含有His×6标签和C-MYC标签，易于纯化和检测表达产。本发明改变了传统的用原核宿主表达rhIL-3，首次利用毕赤酵母表达系统大量表达rhIL-3的方法，通过His-tag标签蛋白得到快速纯化，纯化的rIL-3是经不同程度糖基化的分子量分别在19kDa和22kDa的高活性rhIL-3蛋白，本方法保证了快速获得高活性的rhIL-3重组蛋白。
文档编号C07K1/18GK102146413SQ201110009028
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月17日 优先权日2011年1月17日
发明者吴东海, 徐爱民, 李侍武, 李洪波, 金守光 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院