专利名称：针对乏氧诱导因子-1α的纳米抗体及其编码序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制药技术领域，特别涉及针对乏氧诱导因子-I a (HIF-1 α )的纳米抗体、编码所述纳米抗体的核苷酸序列、能够表达所述纳米抗体的载体及宿主细胞。
背景技术：
乏氧是肿瘤普遍存在的现象，细胞乏氧会导致乏氧诱导因子-Ia (HIF-Ia，hypoxia-induciblef actor-1 alpha)的表达水平显著高于正常组织，HIF-I α与HIF-I β 二聚化形成的HIF-I蛋白因子促进血管再生，从而促进肿瘤细胞的繁殖、侵袭、转移并抑制其凋亡。抑制HIF-Ια可以促进肿瘤细胞的凋亡和抑制肿瘤细胞的发展转移(Semenza GL:Targeting HIF-I for cancer therapy. Nature reviews Cancer2003,3(10) : 721-732)。通过阻断HIF-Ia通路来治疗肿瘤细胞逐渐受到关注，HIF-I a的PAS-B结构域(Per-Arnt-Sim-B)主要负责HIF-I a与HIF-I β 二聚化以及与下游靶基因的结合区(技术参考To K K, Sedelnikova O A, The phosphorylation status ofPAS-Bdistinguishes HIF-Ialpha from HIF_2alpha in NBSl repression.The EMBOjournal,2006,25 (20):4784-4794) (Lee K, Zhang H,Acriflavine inhibits HIF-Idimerization, tumor growth,andvascularization. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America, 2009, 106(42):17910-17915),因此以HIF-I α的PAS-B结构域为靶标，减少HIF-I (HIF-1 a与HIF-1 β 二聚化形成的及与靶基因结合后才具备调控活性)的含量，从而抑制肿瘤的增殖及转移，为其应用于肿瘤的诊断与治疗奠定基础。纳米抗体(variabledomain of the heavy chain of HCAbs, VHH)最初是由比利时科学家在胳马它科动物体内发现的(C. Hamers-Casterman, Naturally occurringantibodies devoid of lightchains, 1993，363:446-448)—种天然缺失轻链的重链抗体(heavy-chain antibody, HCAbs)的基础上运用分子生物学手段技术进行抗体工程革命,得到能与抗原结合的重链抗体可变区，而形成的纳米级的抗体分子，其晶体结构直径2. 5纳米，长度为4纳米。早期诊断与靶向治疗一直是抗肿瘤研究的主要难题，关键是药物能在体内快速而准确地渗透到肿瘤病灶部位，且对正常组织的损伤降到最低，这就对抗体的亲和性及组织渗透性提出了更高的要求。纳米抗体具有独特的性质如分子量小、组织相容性好、稳定性强、抗原识别能力强、生产易于实现并生产成本低等。因此，在肿瘤的诊断与治疗方面比其他抗体更具优势。近几年，在肿瘤诊断与治疗的研究方面取得了较大的进展。目前，尚没有针对HIF-I α的PAS-B结构域为靶标的特异性纳米抗体的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种针对乏氧诱导因子-I a (HIF-1 α )的纳米抗体。本发明的第二个目的是提供一种针对乏氧诱导因子-la (HIF-Ia)的纳米抗体的编码序列。
本发明的第三个目的是提供一种表达载体。本发明的第四个目的是提供一种宿主细胞。本发明的技术方案概述如下一种针对乏氧诱导因子-I α的纳米抗体，所述抗体是SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
一种能够编码所述针对乏氧诱导因子-I α的纳米抗体的DNA分子，是用SEQ IDNO 2所示的序列。—种表达载体，它含有SEQ ID NO :2所不的核苷酸序列。一种宿主细胞，它含有上述表达载体。本发明的一种针对乏氧诱导因子-I α的纳米抗体能与HIF-I α的PAS-B结构域发生良好地特异性结合。
图I表达载体pGEX-4T-l-HIF-l a -PAS-B构建流程图。图2是含有构建的重组质粒pGEX-4T-l-HIF-l a -PAS-B的菌体表达的HIF-1 a -PAS-B结构域纯化前后的SDS-PAGE电泳图Μ为蛋白分子量标准(14. Π16. OkDa)，I裂解沉淀，2裂解上清，3穿透峰，4洗脱峰。图3带有纯化标签his的纳米抗体蛋白VHH16的基因电泳图Nco I和Not I双酶切验证重组载体 pET-28-VHH16，M 为 Trans5K，I 为 pET-28_VHH16 (Nco I 和 Not I 双酶切后)，2为VHH16 (VHH16基因全长为433bp VHH为393bp，由于引入酶切位点及连接而增加的碱基约为40bp)。图4纳米抗体蛋白VHH16诱导表达的全菌SDS-PAGE电泳图M为预染蛋白分子量标准(10 170kDa)，l 为 BL21(DE3) (pET_28a(+))诱导产物，2 8 :分别是 BL21 (DE3)(PET-28-VHH16)在 IPTG 做诱导剂时诱导 2h、4h、6h、8h、12h、16h、20h 的诱导产物。图5抗体VHH16亲和层析纯化后的SDS-PAGE分析:M为预染蛋白分子量标准(l(Tl70kDa) I为裂解液，2为裂解上清，3为裂解沉淀，4为穿透峰，5飞为洗脱峰(VHH16蛋白分子量约为15kDa)。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述。实施例IHIF-1 a -PAS-B结构域蛋白的制备过程，其中HIF-1 a -PAS-B结构域蛋白为带有GST标签的重组蛋白(I)引物根据HIF-Ia-PAS-B结构域在NCBI数据库中的编码基因序列(NCBIReferenceSequence :ΝΜ_001530. 3)设计，上游引物HIF-1 a -PAS-B+: 5，-CGCGGATCCATTCCTTTAGATAGCAAGACTTTC-3’ (SEQIDNO 3)下游引物HIF-1 a -PAS~B~: 5，~GCCCTCGAGCTACAAGTCGTGCTGAATAATACCACT~3，(SEQID NO 4)
在下划线部分引入BamH I, Xho I的限制性酶切位点，以HIF-I α全序列克隆载体 pFlKOF-HIF-l α (购买于 Kazusa DNA Research Institute)为模板，PCR 扩增HIF-1 a-PAS-B基因(目的克隆基因序列见SEQ ID NO :5 (348bp)，由SEQ ID NO :5序列表达的氨基酸序列见 SEQ ID NO :6)，连接至 pGEX-4T-l (pGEX_4T_l 购买于 GE healthcare)表达载体，经过基因序列测定，以确定所获得的目的基因序列的正确性。(见图I)(2)构建成功的基因工程菌BL21 (pGEX-4T-l-HIF_l a -PAS-B)及对照菌BL21 (pGEX-4T-l)表达带有GST标签的HIF-1 a -PAS-B结构域(见图2)和单独的GST蛋白，并将带有GST标签的HIF-1 a -PAS-B结构域经过GST_tag亲和层析柱纯化，获得高纯度的目的蛋白。实施例2针对HIF-I α的PAS-B结构域的纳米抗体筛选过程(I)包被抗原用包被缓冲液(O. 05Μ碳酸盐缓冲液pH 9. 6)配制100 μ g/mL的·GST_HIF-1 a -PAS-B溶液，用包被缓冲液(O. 05Μ碳酸盐缓冲液pH 9.6)配制100 μ g/mL的GST溶液；用上述两种溶液分别包被免疫管，静置过夜；GST_HIF-1 a -PAS-B溶液包被的免疫管称A管，GST溶液包被的免疫管称B管；(2)封闭弃去上清，用pH为7. 4的PBS (磷酸盐缓冲液)洗涤A管和B管各三次。加入含2% (g/ml)脱脂奶的PBS溶液，37°C静置3h，弃去上清，用PBST (磷酸盐缓冲液，含
O.05%的Tween-20)洗涤A管和B管各三次，再用PBS洗涤A管和B管各三次；(3)纳米抗体噬菌体文库的预处理取300 μ L 2% (g/ml)脱脂奶的pH为7. 4的PBS溶液并向其中加入非免疫骆驼纳米抗体噬菌体展示基因库(其中非免疫骆驼纳米抗体曬菌体展不基因库的构建参考文献Monegal A, Ami D, Martinelli C，Huang H, AliprandiM，Capasso P，Francavilla C，Ossolengo G，de Marco A:Immunological applicationsof single-domain llamarecombinant antibodies isolated from a naive library.Protein engineering, design & selection:PEDS 2009，22 (4) : 273-280)，保证纳米抗体的量为5X1012pfu左右，将上述溶液加入B管中，共孵育lh，得到预处理后的纳米抗体噬菌体文库；(4)将B管中的液体转移到A管中，弃B管，A管37°C静置2h ;(5)洗涤A管弃去上清，用PBST洗涤三次后用PBS洗涤三次；(6)洗脱向A管中加入ImL O. IM三乙胺溶液，常温振荡5min。IM Tris-HCl将溶液PH调至7. 5，加入6 μ L质量浓度为O. 25%胰蛋白酶水溶液，振荡15min，置于冰上；(7)侵染用A管溶液侵染大肠杆菌TGl (购自New England Biolabs)，37°C孵育45min ；(8)加入辅助噬菌体M13K07 (购买于New England Biolabs)浸染TG1，37C孵育45min,产生并纯化曬菌体用于下一轮筛选。(9)将经(8)筛选收集到的噬菌体纳米抗体文库按实施例2的步骤再进行2轮的筛选。实施例3用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选HIF-1 a -PAS-B特异性单个阳性克隆(I)噬菌体纳米抗体的制备在进行到第3轮步骤(7)得到的大肠杆菌TGl (购自New EnglandBiolabs)涂平板，挑取96个含噬菌体的单克隆细菌分别接种到96孔板中，37°C培养过夜，以M13K07:TG1=20:1的比例加入辅助噬菌体M13K07，37°C孵育45min，离心，弃上清，重悬菌体，培养过夜。离心，将所得上清待用；(2)包被包被 100 μ g/mL GST_HIF_1 a -PAS-B，每孔 100 μ L 于新 96 孔板，4°C静置过夜。同样包被GST作为阴性对照；(3)封闭弃包被液，用pH为7. 4的PBS洗三次。每孔加入含有质量浓度为2%的脱脂奶的PBS (pH为7. 4)溶液，静置2h ；(4)弃去封闭液，用PBST洗三次后再用PBS各洗三次。按照反应孔的标号对应加入本实施例步骤(I)制备的噬菌体上清，孵育2h ；(5)加入酶标二抗弃去(4)中的溶液，用PBST洗三次和PBS各洗三次。向各反应孔中加入辣根过氧化物酶标记鼠抗M13K07单克隆抗体(二抗)，孵育Ih ；(6)加底物显色液弃去(5)中的溶液，用PBST洗三次后再用PBS各洗三次。向各个反应孔中加入新鲜配制的TMB (2mg/mL TMB乙醇溶液O. 5mL ；pH为5. 5底物缓冲液(O. 2MNa2HP04,0. IM 柠檬酸)IOmL ；0. 75%Η20232 μ L)底物溶液 100 μ L,孵育 15min ；(7)终止反应向各个反应孔中加入50 μ L 2Μ稀硫酸； (8)结果判定用酶标仪于450nm下测各孔OD值。实验组读数大于O. 30且大于阴性对照读数I倍以上的噬菌体可以判定为阳性克隆。(9)选取 Phage ELISA 检测结果较为理想的 6 个(VHH5、VHH6、VHH7、VHH8、VHH16、VHH20)阳性克隆进行了测序分析，获取的片段序列(即纳米抗体的DNA序列)翻译成氨基酸序列分析，结果发现这6个氨基酸序列基本一致，特别是CDR-3区的序列完全一致，只有框架区存在个别氨基酸的差别。将CDR1，CDR2，CDR3序列相同的氨基酸序列视为同一抗体。(10)我们选择VHH16 (SEQ ID NO : I所示的氨基酸序列，能够表达SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的DNA序列是用SEQ ID NO 2所示的序列)用于后续Anti-HIF-I α纳米抗体的表达、纯化及其检测实验。实施例4特异性纳米抗体重组表达载体质粒pET-28-VHH16的构建(I)提取阳性克隆TGl重组质粒，限制性内切酶Nco I和Not I处理提取VHH16基因；(2)将提取的质粒pET_28a(+)(购买于Novagen)用Nco I和Not I双酶切，重组连接形成可表达带his纯化标签的pET-28a_VHH16质粒。酶切验证见图4。实施例5纳米抗体蛋白在大肠杆菌中表达纯化(I)将实施例4所述的含his纯化标签的pET_28a_VHH16质粒转化至大肠杆菌感受态细胞 BL2I (DE3)(购于 TransGen)。(2)菌体活化至0D_为O. 7时，加入IPTG (异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)至
O.3mM，继续在20°C诱导培养20h (培养时间的条件筛选见图4)。(3)离心，收集菌体_20°C冷冻待用。(4)加溶菌酶裂解细菌，离心，收上清中可溶性蛋白，经His-tag亲和柱亲和纯化获得纯度较高的抗体蛋白。(见图5)
实施例6抗体VHH16生物活性的ELISA鉴定(I)包被抗原用包被缓冲液将GST_HIF-1 a -PAS-B融合蛋白稀释至终浓度为I μ g/mL>2 μ g/m L>4 μ g/mL>8 μ g/mL> 16 μ g/mL(每个浓度做 3 个平行)，每孔加入 100 μ L,4°C静置过夜。用同样的方法包被GST和包被缓冲液分别作为阴性对照和空白对照。(2)封闭去包被液，用PBS洗涤三次。每孔加入含有2% (g/ml)脱脂奶的PBS(PH7.4)溶液，静置2h。(3)加入实施例5得到的抗体VHH16 :弃去封闭液，用PBST洗三次后再用PBS洗涤三次。按照反应孔的标号对应加入VHH16抗体(3 4 μ g/mL)，孵育2h。(4)加入anti-his单抗弃去VHH16蛋白，用PBST洗三次后再用PBS洗涤三次。向各反应孔中加入稀释的anti-his单抗，孵育lh。(5)加入酶标二抗弃去anti-his单抗，用PBST洗三次后再用PBS洗涤三次。向各反应孔中加入稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗属抗血清，孵育lh。(6)加底物显色液弃去上清，用PBST洗三次后再用PBS洗涤三次。向各个反应孔中加入新鲜配制的TMB底物溶液，孵育15min。(7)终止反应向各个反应孔中加入2M稀硫酸终止液。(8)结果判定在450nm下用酶标仪测各孔OD值。实验组读数大于O. 30且大于阴性对照读数I倍以上的噬菌体可以判定为阳性克隆。(9)实验数据
权利要求
1.一种针对乏氧诱导因子-Ia的纳米抗体，其特征是所述抗体是SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
2.一种能够编码权利要求I所述针对乏氧诱导因子-Ia的纳米抗体的DNA分子，是用SEQID NO 2所示的序列。
3.—种表达载体，其特征在于它含有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
4.一种宿主细胞，其特征在于它含有权利要求3所述的表达载体。
全文摘要
本发明公开了针对乏氧诱导因子-1α的纳米抗体及其编码序列，所述抗体是SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。本发明的一种针对乏氧诱导因子-1α的纳米抗体能与HIF-1α的PAS-B结构域发生良好地特异性结合。
文档编号C07K16/18GK102924595SQ20121046544
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月15日 优先权日2012年11月15日
发明者黄鹤, 樊晓丹, 刘静, 胡耀中 申请人:天津大学