鳐血管生成抑制因子1的适配子k17及其筛选方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种鳐血管生成抑制因子1适配 子及其筛选方法和应用。
【背景技术】
[0002] 近些年来，寡核苷酸适配子作为抗体分子的前景性替代分子，其研究较为引人注 目。寡核苷酸适配子是由SELE欧洲杯赔率赌场 （Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)生物文库技术筛选获得的，该技术的原理就是利用分子生物学技术，构建人工 合成的单链随机寡核苷酸文库，其随机序列长度在20-100个碱基左右。利用单链寡核苷酸 分子构像灵活多变的特性，将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留以空间构像与靶 分子结合的寡核苷酸，经反复扩增、筛选数个循环，即可使与该靶子特异结合的寡核苷酸序 列得到富集，最终获得多种靶分子的特异寡核苷酸适配子，即aptamer。利用SELE欧洲杯赔率赌场 筛选 获得的aptamer识别分子的模式与蛋白抗体类似，但与蛋白类抗体相比，核酸类配基具有更 多的优越性，如不受免疫条件和免疫原性限制，可体外人工合成，变性与复性可逆，可修饰 并有利于长期保存和室温运输等。更重要的是，aptamer比抗体具有更高的特异性，甚至能 识别单抗不能区分的蛋白质分子。而且aptamer的靶分子非常广泛，小至染料分子，大至完 整的病毒颗粒和细菌病原体，甚至完整的细胞也可以通过消减SELE欧洲杯赔率赌场 筛选出高亲和力 的寡核苷酸适配子。
[0003] 鳐血管生成抑制因子1功能区以下简称鳐功能区，鳐血管生成抑制因子1是我们首 次从南海海域一种鳐组织中分离出来的蛋白质（分子量42KD)。研究结果显示:鳐血管生成 抑制因子1显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜本身的及人鼻咽癌细胞诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生 成;无论是腹腔注射还是灌胃都显著抑制裸小鼠Lewis肺癌的生长和转移，减少肿瘤组织微 血管密度，下调促血管生成因子VEGF的表达;对裸小鼠黑色素瘤B16细胞的转移也有强抑制 作用；下调促转移因子CD44v6和ErBb2的表达；与5-氟尿嘧啶（5-FU)联合应用时效果更显 著。鳐血管生成抑制因子1的作用靶点与美国基因技术研究所开发出的抗癌新药Avastin不 同。Avastin是基因工程产品，是VEGF的抗体，其作用靶点是VEGF;鳐血管生成抑制因子1是 天然产物，它不仅作用于VEGF，还作用于bFGF和TOGF。因此，针对鳐血管生成抑制因子1功能 区进行特异性的鉴别和筛选是本领域一贯的追求。
[0004] 基于以上考虑，本发明以鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白为目的靶蛋白，采用 SELE欧洲杯赔率赌场 获得了 10条鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白特异的aptamer，组合应用能够迅 速、敏感、特异的检测到鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白。由于单链DNA寡核苷酸适配子性 能稳定、合成方便且廉价、经修饰后可直接用于荧光或化学发光、发色方法检测靶绑带，因 此操作简单、直接。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供不仅具有检测快速、操作简单、稳定性高于抗体等特点，而 且制备方法容易、制备周期较短的一组能识别鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白的寡核苷 酸序列及其制备方法。
[0006] 所述能识别鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白的寡核苷酸序列，包括SEQ IDNo. 2-11，且采用其中的一条寡核苷酸序列就能完成对鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白的识别 检测；
[0007] 所述一组能识别鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白的寡核苷酸序列的制备方法包 括以下步骤：
[0008] 1、合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库（5CTCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC--
[0009] N35--GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3')，其中N35为35个随机寡核苷酸；
[0010] 2、将寡核苷酸文库分别与鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白混合后进行SELEX筛 选，获得适配子富集文库；
[0011] 3、SELEX筛选完成后，对获得的适配子富集文库进行克隆测序；
[0012] 4、选择测序结果中出现的高拷贝ssDNA，进行亲和特异性的验证，筛选获得能识别 鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白的寡核苷酸序列。
【具体实施方式】 [0013] 实施例1
[0014] 1、鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白的制备
[0015] 采用本领域技术人员熟知的酵母重组表达的方式获得具有与鳐血管生成抑制因 子1功能区蛋白相同生物活性的鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白，该蛋白序列如SEQ ID NO: 1所示;蛋白溶液的浓度为15mg/m 1。
[0016] 2、文库和引物的合成
[0017] 2.1、合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库G'-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC--
[0018] N35--GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3')，其中N35为35个随机寡核苷酸；
[0019] 引物PI :TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC;
[0020]引物 P2: CCCTCTGGGGTCTCCCTCTTGTGC。
[0021] 2.2、适配子的SELEX筛选，具体方法如下：
[0022] 2.2.1 ssDNA与鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白的结合、分离，具体方法如下：
[0023] 取100yM的ssDNA寡核苷酸文库4yL，用2X结合缓冲液稀释至100iU，95°C变性 5min，冰浴lOmin后加入lOOyl鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白，摇床结合30min，再 6000rpm离心5min，弃上清，然后用1 X结合缓冲液洗沉淀，弃上清;在沉淀中再加入1 X结合 缓冲液1〇〇此，96 °C加热5min，然后15000rpm离心10min，取上清液，对沉淀再次加热并离心， 合并上清液，则可分离得到与鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白有亲和力的ssDNA次级文 库;所述2 X结合缓冲液为20 X结合缓冲液用双蒸水稀释10倍后的溶液，所述1 X结合缓冲 液为20 X结合缓冲液用双蒸水稀释20倍后的溶液；所述20 X结合缓冲液配方为lMNaCl、 50mM KCl、500mM Tris-HCl、10mM MgC12、pH 7.4。
[0024] 2.2.2ssDNA与鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白的结合、分离，具体方法如下：
[0025] 将步骤2.2.1分离得到的能与鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白结合的ssDNA，再 与10(^1鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白摇床结合3〇!^11，后续步骤同步骤2.2.1，则可分 离到与鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白都有亲和力的ssDNA次级文库。
[0026] 2 ? 2 ? 3不对称PCR扩增ssDNA，具体方法如下：
[0027]对步骤2.2.2分离获得的ssDNA次级文库进行不对称PCR扩增，总体积为25yl的不 对称PCR扩增体系为：10 X PCR缓冲液:2yl; P1 (10處）：lyl;P2(0 ? 2處）：lyl; dNTP(各2 ? 5mM): 0 ? 4yl;MgCl2(25mM): 1 ? 2yl; ssDNA模板（0 ? 2yg/y 1): 2y 1; Taq DNA聚合酶（5u/yl): 0 ? 2yl; (1(11120:17.2^1;?〇?反应参数:94°(：预变性4111111，然后进行40个循环94°(：变性308,58°(：退火 30s，72°C 延伸 20s，最后 72°C 延伸 7min;
[0028] 2 ? 2 ? 4亲和力的测定，具体方法如下：
[0029] 2.2.4.1扩增：用带有地高辛标记的引物P1不对称PCR扩增筛选出来的ssDNA次级 文库，扩增条件和参数与步骤2.2.3的不对称PCR扩增体系和参数相同；
[0030] 2.2.4.2与蛋白结合:取步骤2.2.4.1扩增所得的PCR产物100yL，95 °C变性5min，冰 浴lOmin后加入lOOyL蛋白中，充分混合，在室温下结合30min，然后6000rpm离心，分离蛋白 与上清液，蛋白中包含有与蛋白中结合的带地高辛标记的ssDNA，上清液中是未结合的 ssDNA，同时做一不加ssDNA的空白，即用2X结合缓冲液代替PCR产物，同样进行上述操作； [0031] 2.2.4.3洗涤:将蛋白用1 X结合缓冲液500yL洗涤1次，6000rpm离心，弃上清，取蛋 白；
[0032] 2.2.4.4与酶标兔抗地高辛抗体结合:在蛋白中加入100此1:90(^85稀释的过量 的酶标兔抗地高辛抗体，充分混合后，反应l〇min，使之与蛋白中的地高辛标记的ssDNA结 合；
[0033] 所述TBS为0.5M Tris-NaCl溶液，配制方法为：先水溶8.5~9g NaCl，再加1>18-HC1 (0 ? 5M、pH7 ? 6)溶液 100ml，最后加水定容至 1L;0 ? 5M Tris-HCl(pH7 ? 6，100ml)溶液配制 方法:称取Tris 6.06g，加入双蒸水40ml溶解，滴加浓HC1调pH至7.6，定容至100ml。
[0034] 2.2.4.5洗涤:6000rpm离心，去上清，再用1 X结合缓冲液500yL洗涤3次，得蛋白；
[0035] 2.2.4.6 TMB(四甲基联苯胺）显色:加入400yL双蒸水重悬蛋白，再加入200yL TMB 显色液，避光显色l〇min后，以2mol/L H2S04200yL终止反应，测定450nm处的吸光值0D450， 该值即反映与菌结合的ssDNA的亲和力，即0D结合，空白同样进行上述步骤2.2.4.3， 2.2.4.4,2.2.4.5和2.2.4.6,得到空白相应的吸光度0D空白；
[0036]所述TMB显色液使用常规的配制方法配制。
[0037] 2.2.4.7测定PCR产物中DNA的摩尔浓度:取步骤2.2.4.1扩增所得的PCR产物，以已 知浓度梯度的初始ssDNA文库为标准品，用Bandscan软件作为图像分析软件，采用溴化乙锭 琼脂糖凝胶电泳法定量测定PCR产物中的DNA含量，获得相应DNA的摩尔浓度，进而可以计算 出100yL PCR产物中的DNA摩尔数。
[0038] 2.2.4.8计算相应文库的亲和力：
[0040] 2.3重复筛选，具体方法为：以每一轮不对称PCR的产物作为下一轮的筛选文库，重 复上述SELEX筛选步骤2.2,直到亲和力不再上升为止，最后经过16轮的筛选得到ssDNA的适 配子富集文库。经不对称PCR扩增后，条件同前面的步骤，克隆并测序，得到拷贝数最高的20 个有效的ssDNA，将20个适配子分别进行亲和特异性验证，得到10个对鳐血管生成抑制因子 1功能区蛋白有较好亲和特异性的寡核苷酸序列(适配子），具体序列如下：
[0043]亲和力具体数据如下：
[0045] 2.4、分析20条适配子的特异性和亲和性
[0046] 荧光标记的适配子序列与鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白孵育，进行流式细胞 分析检测，其中10条序列显示了高荧光强度，使用GraphPad Prism5.0软件针对饱和曲线做 非线性回归曲线，分别对10条高亲和性适配子序列采用相同的实验操作，得到了每条是配 置的Kd值：
[0048] 其中K20的Kd值最小，说明与靶蛋白可以快速结合并且结构稳定不易分离。
[0049] 采用DNAMAN软件构建了 10条适配子的二级结构并计算了他们的最小自由能，其结 构最小自由能也都较小，结构也相对稳定。
[0050] 2.5适配子特异性分析
[0051] 分别采用BSA、人血红蛋白、鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白与10条适配子进行 特异性检测，经过结合试验发现，这10条序列都不与BSA或人血红蛋白相结合，而只与鳐血 管生成抑制因子1功能区蛋白结合保持较高的特异性。
【主权项】
1. 一种用于适配子筛选的鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白，其序列为SEQ ID NO: 1所 不。2. -种识别鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白的寡核苷酸序列，其特征在于其序列为 SEQIDNo.^/f*。3. 权利要求2所示的寡核苷酸序列用于筛选鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白的应用。
【专利摘要】一组能识别鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白的适配子及其制备方法。寡核苷酸序列包括SEQ ID No.2～11，其分别具有较高的亲和特异性，可以用于鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白的检测。
【IPC分类】C12N15/115, C12N15/10, C07K14/46
【公开号】CN105713081
【申请号】CN201610101408
【发明人】张垒, 张勇
【申请人】张勇