人组织因子途径抑制物-2单克隆和多克隆抗体的制备及应用的制作方法

专利名称：人组织因子途径抑制物-2单克隆和多克隆抗体的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及识别作为抗原的人组织因子途径抑制物-2的单克隆抗体，涉及识别 作为抗原的hTFPI-2的多克隆抗体，一种产生所述单克隆抗体的杂交瘤，一种作为免疫原 的hTFPI-2，一种镧系稀土元素铕(Eu3+)标记的羊抗鼠IgG，免疫印迹，免疫组化和检测试剂
品.ο
背景技术：
hTFPI-2，又称胎盘蛋白-5 (placental protein 5，PP-5)和基质相关性丝氨酸蛋 白酶抑制剂(matrix-associated serine protease inhibitor,MSPI),是一禾中带有Kunitz 型结构域的蛋白酶抑制剂，属于丝氨酸蛋白酶抑制物超家族成员。hTFPI-2与人组织因子途 径抑制物(hTFPI)的氨基酸顺序有着很高的同源性，且二者的性质也有一定的相似性，因 此最终命名为组织因子途径抑制物_2 (TFPI-2)。hTFPI-2主要由胎盘滋养细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、角化细胞合成和分泌， 广泛存在于胰腺、肝脏、肾、肺等器官中。此外，还有一定量的hTFPI-2存在于精浆及卵泡液 中。精浆中的hTFPI-2和精子的活动率相关，而卵泡液中的hTFPI-2则可能和卵泡成熟过 程中卵泡的破裂过程有关。体外研究发现hTFPI-2能够抑制胰蛋白酶、纤溶酶、基质金属蛋白酶(MMP)、糜蛋 白酶、血浆缓激肽释放酶和凝血因子Vn (F νπ)/组织因子复合物活性，但是对组织型纤溶 酶原激活物(tPA)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)无抑制作用。已有的研究表明，机体 内hTFPI-2主要定位于细胞外基质(ECM)，因此，推测hTFPI-2在胚胎发育、伤口愈合、恶 性肿瘤侵袭转移和动脉粥样硬化等涉及ECM重塑的生理病理过程中发挥作用。文献表明， hTFPI-2能够抑制纤维肉瘤、胶质瘤等多种肿瘤细胞的侵袭转移，也能够抑制动脉粥样硬化 部位斑块的脱落。在多种恶性程度比较高的肿瘤细胞中TFPI-2的表达量很低，而在恶性程 度比较低的肿瘤细胞中其表达量较高。据此有人提出可根据血液hTFPI-2水平来初步判断 肿瘤细胞的恶性程度。鉴于hTFPI-2的重要性，许多研究者认为hTFPI-2具有潜在治疗恶 性肿瘤和动脉粥样硬化的作用。此外，hTFPI-2还反映胎盘的功能，并与抗凝功能有关。hTFPI-2在正常男性及非妊娠女性循环血液当中的含量甚微，而在正常妊娠女 性血液当中，TFPI-2水平可升高40-70倍。在妊娠高血压综合征(以下简称妊高征)患 者，由于胎盘功能受损，血液TFPI-2水平会出现明显下降。此外，肝素也可以明显提高血 液中hTFPI-2的含量，小剂量的肝素即可使hTFPI-2升高10-40倍，这提示有相当数量的 hTFPI-2和内皮细胞相结合，当注入肝素后hTFPI-2便释放入血。hTFPI-2有两个糖化位点，分别位于Asnl 16和Asnl70。糖化程度的不同，使 hTFPI-2的分子量从25Kda到33Kda不等，有25KDa、27KDa、32KDa、33KDa等几种不同的形式。由于hTFPI-2在正常男性及非妊娠女性循环血液当中的含量甚微，鉴于上述hTFPI-2所涉及到的一些生理功能，需要建立一套能够准确监测血液TFPI-2水平的方法。 虽然也有一些方法，比如ELISA，RIA等对TFPI-2浓度进行过检测，但由于ELISA灵敏度不 够，无法检测出妊高征患者血液内的hTFPI-2，而RIA灵敏度尽管稍高于ELISA，但由于其放 射性污染的问题而未能得以广泛应用，因此目前国内外尚没有研制出用以检测hTFPI-2水 平的完整试剂盒。在本领域内，运用了 DELFIA这一高灵敏度又无放射性污染的监测技术，克服了上 述ELISA与RIA所存在的问题，建立了一套灵敏、安全的检测hTFPI-2的试剂盒。在运用了 DELFIA技术的hTFPI-2试剂盒当中，使用了 TFPI-2的单克隆抗体，可实现高度特异性，而不 显示任何交叉反应性在批与批之间的差异，便于质量控制，而且实现了高灵敏度。发明简述本发明属生物技术领域，具体涉及一种通过基因克隆表达的hTFPI-2产生的单克 隆抗体以及一种通过此hTFPI-2产生的多克隆抗体。运用hTFPI-2单克隆抗体与多克隆抗 体建立了一种检测方法，通过它可安全、灵敏的测定血液TFPI-2水平。而且由于使用了一 种单克隆抗体，没有交叉反应性，特异性良好，在批与批之间没有变化，便于质量控制，而且 当使用一种单克隆抗体时，也显示良好的灵敏度。本发明提供了一种作为免疫原的hTFPI-2。本发明提供了一种识别作为抗原的hTFPI-2的多克隆抗体。本发明提供了一种识别作为抗原的hTFPI-2的单克隆抗体。本发明提供了一种杂交瘤，它产生识别作为抗原的hTFPI-2的单克隆抗体。本发明的杂交瘤优选是本发明的杂交瘤优选是hTFPI_22C8。由本发明的杂交瘤产生的单克隆抗体构成了本发明的一个方面。用本发明的单克隆抗体进行的免疫印迹构成了本发明的一个方面。用本发明的单克隆抗体进行的免疫组化构成了本发明的一个方面。本发明的免疫印迹优选用于人脐静脉内皮细胞hTFPI-2的检测。本发明的免疫组化优选用于乳腺癌细胞中hTFPI-2的检测。本发明的免疫印迹的标本是脐静脉内皮细胞。本发明的免疫印迹的标本是乳腺癌组织。含有本发明的单克隆抗体和多克隆抗体的检测试剂盒也构成了本发明的一个方本发明的检测试剂盒优选用于检测孕妇及动脉粥样硬化患者血液hTFPI-2水平。本发明的检测试剂盒标本可以是血浆或血清。本发明的检测试剂盒优选用DELFIA技术进行。附图简述

图1说明了实施例1观察到的亲和层析柱的洗脱曲线。图2A与B分别说明了实施例1所纯化hTFPI-2单抗的还原型SDS-PAGE鉴定图与 非还原型SDS-PAGE鉴定图。图3说明了实施例1所纯化hTFPI-2单抗的染色体分析图。图4说明了实施例2观察到的亲和层析柱的洗脱曲线。图5说明了实施例3观察到的Sijphacryl S-200凝胶柱层析分离的洗脱曲线。
图6为实施例4所建立的hTFPI-2测定标准曲线。图7A与B分别为实施例5所测得的正常妊娠女性及妊高征患者血浆hTFPI_2水平。图8为实施例6所采用的免疫印迹法鉴定人奇静脉内皮细胞(HUVEC)hTFPI-2。图9为实施例7所采用的免疫组织化学的方法检测人乳腺癌细胞hTFPI-2。发明详述本发明的单克隆抗体识别人hTFPI-2作为抗原。本发明的单克隆抗体可通过本发明的杂交瘤产生，因此是可以从培养本发明的杂 交瘤的培养液或用本发明的杂交瘤免疫小鼠从其腹水中获得。然而产生本发明的单克隆抗 体的方法不受限制，但如果工程化的抗体如能与hTFPI-2特异性结合，它也在本发明的范 围之内。本发明的杂交瘤产生识别hTFPI-2作为抗原的单克隆抗体，并可通过经hTFPI-2 免疫的动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得。本发明的杂交瘤可以用本领域已知的细胞融合技术产生。因此，用hTFPI-2作为 免疫原免疫除了人以外的动物，将该动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤，从其选 出产生识别hTFPI-2的单克隆抗体的杂交瘤，从而获得了本发明的杂交瘤。上述提到的免疫原不受特别限制，但包括基因克隆表达的hTFPI-2。用作上述免疫原的hTFPI-2的形式不受限制，可以是25KDa、27KDa、32KDa、33KDa 等几种不同的形式。经免疫产生本发明的杂交瘤的动物不受特别限制，但包括例如山羊、绵羊、豚、小 鼠、大鼠和家兔。在其中优选的是小鼠。可用任何本领域已知的方法免疫上述产生本发明的杂交瘤的动物。在免疫小鼠 中，例如，可能提到的方法包括20-40ug，优选20微克脾内直接免疫。本发明的实践中，免疫上述动物后选择抗体滴度高的个体。免疫3-5日后切下它 们每一只的脾脏脾脏或淋巴结，将这些组织中所含的产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞，通过 本领域已知的细胞融合法，在融合促进剂存在下融合，制备杂交瘤细胞株。产生单克隆抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合所使用的融合促进剂不受限制，但包括 例如聚乙二醇(下文称PEG)，仙台病毒等。然而PEG是优选的。上述细胞融合的方法不受限制，但可以包括方法按1 1-10 1之比混合脾细 胞和骨髓瘤细胞，加入Iml 37°C预热的50% PEG进行细胞融合，优选2 1之比混合脾细 胞和骨髓瘤细胞。上述骨髓瘤细胞不受特别限制，但首选SP2/0骨髓瘤细胞。大量制备本发明的单克隆抗体的方法不受限制，方法可以是例如将杂交瘤移植 到预先施用降植烷的小鼠腹腔中，回收腹水并从中获得抗体。可通过本领域已知的方法，用 蛋白A柱或蛋白G柱等纯化腹水中的单克隆抗体。本发明所制备的单克隆抗体进行抗原抗体反应的鉴定方法不受限制，如采用 DELFIA、免疫印迹法或免疫组织化学。本发明的单克隆抗体的家族和亚家族不受特别限制，但可以是IgGp IgG2, IgG3、 IgG4JgMUgEUgA1UgA2* IgD任一。L链也不受特别限制，但可以是λ链或κ链。
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本发明的单克隆抗体不受特别的限制，但可以是任何能与hTFPI-2抗原表位结合 的抗体。例如，可以是F(ab’)2、Fab’或Fab，它们是本发明单克隆抗体的降解产物，或嵌合 抗体。本发明的单克隆抗体的应用领域不受特别限制，但能用于免疫测定，用于检测 hTFPI-2 水平。经免疫产生本发明的多克隆抗体的动物不受特别限制，但包括例如家兔、山羊或 绵羊、马、骡和豚鼠。在其中优选的是家兔。可用任何本领域已知的方法免疫上述产生本发明的多克隆抗体的动物。在免疫家 兔中，例如，初次免疫可能提到的方法包括200ug-lmg，注射途径可能有皮内、皮下、肌肉、静 脉或淋巴结内。优选Img皮内注射。可能提到加强免疫的剂量为首次剂量的1/5-2/5，注射 途径可能有皮下或腹腔注射，优选首次剂量的2/5皮下注射，间隔时间为10天。本发明的多克隆抗体的应用领域不受限制，但能用于免疫测定，用于制备固相抗 体。下文提到的间接双夹心DELFIA包括例如将hTFPI-2夹在本发明固定的多克 隆抗体和单克隆抗体之间，然后加入铕标记的羊抗鼠抗体及增强液，从而检测了标本中的 hTFPI-2。对于下文提到的铕标记抗体的制备，其方法可以是一步标记法，即螯合剂DTTA先 螯合铕，再连接抗体。也可以是二步标记法，即螯合剂DTTA先连接抗体再螯合铕。对于上述螯合剂，提到例如DTTA、EDTA、DPTA。在将这些螯合剂与铕或抗体结合过 程中，可使用一步标记法或二步标记法。对于上述标记剂，提到镧系稀土元素，例如铕(Eu3+)、钐(Sm3+)、铽(Tb3+)。对于用 于该场合的螯合剂，可选择适合该场合所用的螯合剂，例如上述的DTTA、EDTA、DPTA。上述提到的增强液，其主要成分是β - 二酮体螯合剂(2-ΝΤΑ)。在本发明的检测试剂盒中，本发明的单克隆抗体可以作为一抗，然后加标记的抗 抗体，还可以用上述标记剂标记。本发明的检测试剂盒的固相不受特别限制，但包括例如聚合物，如聚苯乙烯、玻璃 珠、微量滴定板或其他不溶性载体。本发明的检测试剂盒还可含有其他组件。上述其他组件不受特别限制，但包括例如标记用的稀土元素、增强液、缓冲液，以 及上述提到的成分。虽然本发明的检测试剂盒的形式不受限制，但含有本发明的检测试剂盒的所有组 分的整合型检测试剂盒是优选的，能快速、简单和方便的进行检测。上述整合型检测试剂盒不受特别限制，但可以是盒型、芯型等。本发明的检测试剂盒可以用于判断肿瘤的恶性程度，动脉粥样硬化的病情评估以 及妊娠高血压综合征患者胎盘功能的评估。因为本发明的检测试剂盒使用单克隆抗体，具有高水平的检测灵敏度，不产生假 阴性或假阳性问题，在批与批之间没有任何差异。根据本发明，用单克隆抗体识别hTFPI-2作为抗原，可消除存在于样品中的其他 物质的影响，从而可以非常高的灵敏度和特异性检测hTFPI-2。由于已建立了产生针对hTFPI-2的单克隆抗体的杂交瘤，现在可以几乎半永久性的产生同一单克隆抗体。使用本 发明的单克隆抗体的检测试剂盒可用血清或血浆作为标本，因此可简单方便有效的检测 hTFPI-2，而不对病人造成痛苦。上述检测试剂盒易于进行测定，对于医药护理的部门是非 常有用的。实施本发明的最佳模式下面实施例和测试实施例更详细地说明本发明。然而它们不是为了限制本发明的 范围。实施例1[单克隆抗体的制备](1) hTFPI-2表达(制备免疫原)I.胎盘总RNA的提取采用TRIzoI试剂盒，提取人足月妊娠的胎盘组织总RNA。II. hTFPI-2基因片断的获得以人胎盘总RNA为模板进行逆转录获得cDNA单链 为模板用引物1和引物2进行PCR获得hTFPI-2基因片断。引物1 :5，-TACCCTCGAGGATGC TGCTCAGGAGCCAAC-3，，引物 2 :5，-GCTAGCTCAGCTTAAAATTGCTTCTTCCGAATTTTC—3’ ；两条分 别引入XHo I和Bpul 102 I的酶切位点(下划线部分)。反应条件-MV 4min,94°C 30s, 53°C 30s, 72°C lmin，8 个循环，94°C 30s, 57°C 30s, 72°C lmin，22 个循环，72°C 7min。lOg/L 琼脂糖凝胶电泳分析PCR。III.目的片断与pET19b重组RT_PCR产物经酚、氯仿纯化后与载体pET19b同时 被XHo I和Bpull02 I的酶切后，经10g/L琼脂糖凝胶电泳回收，然后用T4DNA连接酶连接 目的片断与载体，转化DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆命名为rpET19b-TFPI-2，并测序分 析其序列。IV. hTFPI-2在大肠杆菌中的表达重组质粒rpET19b_TFPI_2转化大肠杆菌表达 宿主BL21，涂于LBA平板，挑取单个克隆，接种至5mlLBA培养基中，37°C 250r/min摇至吸光 度(A600)为0. 8-1. 0，加入终浓度为lmmol/L的异丙基-β _D_硫代半乳糖苷(IPTG)诱导 3小时，8000r/min离心收集菌体，用PBS重悬菌体后，采用超声法破碎菌体，10，OOOr/min离 心20min分离上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析。V.大规模发酵挑取表达量最高的克隆接种至5ml LBA培养基中，37°C 250r/min 4-5h，l 100稀释至500ml LBA培养基中，37 °C 250r/min摇至A600为2时，接种于25L LBA培养基发酵罐中，培养至A600为1.0，加入终浓度为lmmol/L的IPTG诱导3h后下罐， 此时A600为2. 7，离心收集菌体。用20mmol/LTriS-HCL pH7. 4缓冲液洗净菌体残存的培养 基。菌体按质量体积比1 20重悬于20mmol/L Tris-HCL pH7. 4缓冲液中，高压勻浆机加 压破菌，压力维持在60Mpa，每次5min，共三次，其间注意不要使温度过高。勻浆后SOOOr/ min离心30min分离上清和沉淀。VI.包涵体纯化收集的包涵体用含0. 5% TritonX-100、2mol/L尿素、20mmol/ L Tr i s-HCL (pH7. 4)缓冲液洗涤3次。每克包涵体用80ml 7. 5mol/L尿素、20mmol/L Tris-HCL (pH7. 4)缓冲液溶解，每50ml溶解液加入Ig亚硫酸钠，搅拌30min，再加入0. 5g 连二硫酸钠，4°C搅拌过夜。第二天，8000r/min离心30min，0. 45 μ m的滤膜过滤后取上清。 透析后的包涵体溶解液用阴离子柱Q-S印harose FF连接Pr印lc4000纯化系统进行纯化。 用 6mol/L 尿素、0. 15mol/NaCL 0.01%布里吉(Bri j) 35、20mmol/L Tris-HCL (pH8. 0)缓冲液作平衡液。以2ml/min的速度上样，NaCL进行浓度梯度洗脱，收集洗脱峰进行SDS-PAGE 分析。纯化后的包涵体溶液在截留相对分子质量为IOXlO3的透析膜中对0. 15mol/ NaCLU5mmol/L Tris-HCL(pH7. 4)缓冲液透析。测蛋白浓度，每克包涵体可获取大约 600mghTFPI-2。将蛋白溶液冻干，分装于-80°C保存。⑵免疫Balb/c小鼠取6周龄雌性Balb/c小鼠，乙醚麻醉后按无菌操作规程打开腹腔暴露脾脏，将(1) 生产的hTFPI-2免疫原20ug，沿脾脏长径方向注入。逐层缝合皮下组织及皮肤。(3)细胞融合免疫Balb/c小鼠4天后，常规方法取出小鼠脾脏用100目不锈钢网过滤分离收 集脾细胞，镜下计数，取1 X IO8个脾细胞与5X IO7个SP2/0制成混悬液，1000g/min离心 lOmin，弃上清，加入Iml 37°C预热的50% PEG进行细胞融合，补加1640-HAT培养液，置 370C 5% CO2培养箱中培养。2周后改用1640-HT培养液，3周后用1640-20%小牛血清培
养液培养.(3)阳性杂交瘤细胞筛选与克隆化培养用培养液将细胞悬混液稀释成每毫升分别含5、10、50个细胞的悬液，加入96孔培 养板中，每孔IOOul，使相应每孔分别含有0. 5，1和5个细胞，置37°C 5% CO2培养箱中培养。 选择效价高，成单个细胞克隆生长的细胞.按上述步骤继续克隆三次.最后取稳定分泌抗 hTFPI-2单克隆抗体的杂交瘤细胞移入六孔板中培养，然后再转入细胞培养瓶中培养。通过 以上操作，最终确立3个杂交瘤克隆能够产生各种能作为腹水回收的单克隆抗体。分别命 名为hTFPI-22C8、hTFPI-2A、hTFPI_2B，以下分别称单克隆抗体2C8、单克隆抗体A、单克隆 抗体B。(5)单克隆抗体的生产取Balb/c小鼠，腹腔注射降植烷0. 5ml/只，2周后每只小鼠腹腔注射1 X IO6个杂 交瘤细胞，1周后小鼠腹部明显胀大，用无菌注射器抽取腹水。3000g/min离心10分钟。吸 上清，用0. 22 μ m滤膜过滤除菌。(6)rprotein-A 亲和层析柱纯化 2C8待纯化的腹水用20mmol/L PB (pH 7. 0)液稀释3倍，50 %硫酸铵沉淀，离心去上 清，PBS液溶解沉淀，对PBS (pH7. 4)缓冲液透析。以0. 5ml/min的流速上柱.完毕后用 20mmol/L PB (pH 7. 0)液充分洗柱，直至无蛋白流出.然后用0. Imol甘氨酸/0. 5mol (pH 3.0)的缓冲液洗脱并收集洗脱峰，迅速加入lmol/L Tris-HCL (pH 8.8)缓冲液中调至pH至 7.5。对50mM Tris/0. 5M NaCL, pH 7. 5透析液透析过夜。浓缩单克隆抗体至浓度400ug/ ml，分装成每管200ul，-80°C保存。hTFPI-2单克隆抗体纯化洗脱峰如图1 (7)单克隆抗体的全面鉴定I .抗体纯度鉴定采用SDS-PAGE电泳，所用浓缩胶和分离胶浓度分别是5%和12%，考马斯亮蓝染 色，如图2A、B II .抗体效价测定ELISA测定纯化的单克隆抗体的效价。包被液(50mmol/L，pH 9. 6的Na2C03-NaHC03缓冲液)包被hTFPI_25ug/ml于96孔板，IOOul/孔，4 °C过夜。洗涤液 (0. 05mol/L, ρΗ7· 4 的 PBS-0. 05%土温 20)洗板三次。加入封闭液(2% BSA-PBS) 200ul/ 孔，37°C2小时。分别加入不同稀释度的单克隆抗体2C8、A、B，100ul/孔，37°C 1小时。洗 涤液洗板三次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgGa，100ul/孔，37°C 1小时。洗涤液洗 板三次，加入显色液(临用前于IOml ο. lmol/L柠檬酸缓冲液中加入5mg邻苯二胺及30% H2025ul)，显色10分钟。加入终止液(20%硫酸)50ul/孔。492nm处测吸光度。测得单克 隆抗体2C8、A、B效价如表1 表1抗hTFPI-2单克隆抗体效价 III.抗hTFPI-2单克隆抗体2C8、A、B特异性鉴定运用ELISA法，将hTFPI_2、hTF、 hTFPI各5ug/ml分别包被96孔酶标板，分别加入单克隆抗体2C8、A、B，然后加入酶标二抗。 结果表明抗hTFPI-2单克隆抗体2C8、A、B只与hTFPI-2有反应，而与hTF、hTFPI均无结合。IV抗hTFPI-2单克隆抗体亚类鉴定依据鼠单抗IgG亚类检测试剂盒说明书操作，测定结果为单克隆抗体2C8、A、B皆 为IgGl，轻链为λ型。V杂交瘤细胞的染色体分析杂交瘤细胞传代培养48h后加秋水仙胺，使其终浓度为0. 04ug/ml，继续培养2h后 将细胞移入离心管，1000r/min离心lOmin。弃上清，加入37°C预温的0. 075mol/L KCL低渗 液5ml固定液，用吸管吹勻沉淀，置37°C水浴15min。加入固定液(甲醇乙酸=3 1) Iml 混勻，离心后弃上清，再加固定液5ml，混勻后静止30min。离心后弃上清，再加固定液5ml， 重复上一步，然后加固定液5ml混勻，封上管口 4°C过夜。弃上清，混勻细胞沉淀，吸2-3滴 细胞悬液于洁净载玻片上，自然干燥。以10% Giemsa染液染色lOmin，洗去染液自然干燥， 每个标本计数100个完整的中期核，镜检计数。结果染色体数目为98。证实得到的细胞 株是小鼠脾细胞与SP2/0细胞的杂交瘤细胞。结果如图4所示。VI抗hTFPI-2单克隆抗体对hTFPI-2亲和力的测定纯化的2C8单克隆抗体用0. 15mol/L PBS pH 7. 4稀释至1. 4X 107mol/L，与等体积 的 hTFPI-2 (1. 4X107mol/L)混勻，4°C置 18h，取上述混合液 IOOul 至包被有 hTFPI_2(5ug/ ml)的96孔板中，进行ELISA测定。分别测定hTFPI-2存在时的单克隆抗体ELISAA值和 hTFPI-2不存在时单克隆抗体ELISAA值(Atl)，按下述公式计算解离常数(K)，亲和常数为1/ K。A0/(A0-A) = l+K/a0(a0 抗原摩尔浓度)。表2抗hTFPI-2单克隆抗体亲和力测定
9 W抗hTFPI-2单克隆抗体相对分子质量的测定参见图2A、B。实施例2[多克隆抗体制备]I初次免疫取lmghTFPI-2抗原溶于1.5mlPBS中，0. 2μπι滤过膜除菌，加入等 量的福氏完全佐剂。震荡乳化，于雄性新西兰白兔兔背部皮内注射10个点，每个点0.2ml。II加强免疫2周后进行第一次加强，用量为0.4mg，溶于0.8mlPBS中，0. 22μπι 膜过滤除菌，加入等量福氏非完全佐剂振荡乳化。皮下注射。以后每隔十天加强一次，共加 强四次。III第五次免疫后七天试血琼脂糖双向扩散试验测定抗体效价达1 32。IV颈动脉放血①家兔仰卧固定，头部略放低以暴露颈部，剃毛及消毒皮肤。②沿颈部中线切开皮肤约10cm，分离皮下组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突 肌。③分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后使之游离。④于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心 端的动脉用血管夹夹住；⑤用尖头小剪刀在两根丝线间的动脉璧上剪一小口，插入塑料放血管。再将近心 端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱；⑥松开血管夹，使血液流入灭菌三角烧瓶中。一般一只家兔可放血80 100ml。V收集血液待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15 分钟，取上清加入防腐剂(最终浓度为0. 01%硫柳汞或0. 02%叠氮钠)，0. 5ml每管分装后 置-80°C冰箱中保存备用。VI多克隆抗体的纯化①于抗血清中加入等量生理盐水，以50%硫酸铵沉淀，离 心去上清，生理盐水溶解沉淀。②rprotein-A亲和层析柱纯化抗hTFPI_2多克隆抗体，步骤同单克隆抗体纯化。W hTFPI-2 多克隆抗体的鉴定Western_Blot。VDI rprotein-A亲和层析柱纯化抗hTFPI-2多克隆抗体洗脱峰如图5 实施例3[铕标抗抗体制备]取纯化好的单克隆抗体配成lmg/ml的溶液。加入Eu3+-DTTA螯合物300ug。用 0. 25mol/L NaOH 调至 pH9. 5，置 4°C反应过夜。通过 S印hacryl S-200 凝胶柱(1. OX 42cm) 层析分离 Eu3+ 标记抗体，用 50mmol/L、ρΗ7· 75/Tris-HCL 缓冲液(含 0· 9% NaCL R0. 05% NaN3)洗脱，收集含有Eu3+标记的单克隆抗体的组分。经0D280nm测定，收集含蛋白的洗 脱液，同时取样加荧光增强液测定Eu3+含量。计算标记率(Eu3+AgG = Eu3+(umol/L)/蛋白(umol/L)，为10.0。合并峰管，每ml结合物加ImgBSA.放-80°C保存备用。洗脱峰如图6 所示。 实施例4[间接双夹心DELFIA的建立]I 固相抗体的制备将包被缓冲液(50mmol/L、pH 9. 6的Na2C03_NaHC03缓冲 液)稀释兔抗TFPI-2多抗至5ug/ml，加入96孔板，IOOul/孔，室温孵育16小时.倒去包 被液，洗涤液(50mmol/L，ρΗ7· 75Tris_HCL缓冲液，内含0. 5% tween-20)洗两遍，扣干，加 入封闭液(5% BSA)200ul,37°C 2小时，洗涤液洗三遍，扣干。II参考标准品的制备用稀释液(50mmol/L，pH7. 75Tris_HCL缓冲液，内含0. 9% NaCl,0. 2% BSA,0. 05% tween-20 和 20umol 的 EDTA)将 hTFPI-2 抗原标准品配制成 0、1、 5、10、20ng/ml的标准溶液；于96孔板分别加入不同浓度的标准品lOOul，室温震荡孵育90
分钟；洗涤液洗三遍。III加一抗单克隆抗体2C8400ng/ml，IOOul/孔，室温震荡孵育90分钟；洗涤液
洗三遍。IV加二抗Eu标记羊抗鼠IgG 400ng/ml, IOOul/孔，室温震荡孵育90分钟；洗涤
液洗六遍。V检测每孔加入增强液lOOul，避光震荡10分钟后在Victor 1420荧光分析仪 上检测(激发波长337nm，测定波长614nm)。VI线性范围及灵敏度hTFPI-2标准曲线线性测量范围为l-20ng/ml.以零参考 标准品A测定值(η = 12)均值减去两倍标准差代入标准曲线方程求得灵敏度为0. 4ng/mlW hTFPI-2标准曲线如表3，如图7所示。表3DELFIA of hTFPI-2hTFPI-2 浓度 0151020(ng/ml)Eu 读数0 8456 45033 95156 187837实施例5[用间接双夹心DELFIA检测正常妊娠女性及妊高征患者血液标本中hTFPI-2]于固相包被板上分别加正常妊娠女性及妊高征患者血液标本，IOOul/孔，其余基 本程序同实施例4。测得血液hTFPI-2水平如表四表四DELFIA检测正常妊娠女性及妊高征患者血液标本中hTFPI-2 实施例6[采用免疫印迹的方法检测人奇静脉内皮细胞(HUVEC)hTFPI-2]I 将裂解液 A(50mmol/L Tri s，2% SDS，ρΗ6· 8)裂解 HUVEC。II SDS-PAGE电泳按79 20 1的比例分别加入将裂解液A、B (0. 1 %溴酚蓝， 10%甘油)、C(10mol/LDTT)，上样。III转膜100v，2小时，将PVDF膜丽春红染色可见蛋白质条带。IV封闭用TTBS稀释1 %脱脂奶粉，PVDF膜4 °C封闭过夜。V洗膜TTBS洗膜三次，每次10分钟。VI加一抗单克隆抗体2C8，封闭液稀释至1 500，室温孵育2小时。洗膜同上。W加二抗辣根过氧化酶标记羊抗鼠IgG，1 2000,室温孵育2小时。洗膜三次， 每次20分钟。VDI发光发光试剂按1 1配成，发光约5分钟。IX暗室曝光30秒，显影，定影。X结果如图8所示。实施例7[采用免疫组织化学的方法检测乳腺癌细胞hTFPI-2]I组织标本制备乳腺癌组织标本经10 %甲醛固定24_48h，PBS洗4h，3系列乙醇脱水，二甲苯透明， 浸蜡，包埋。4 μ m石蜡切片，贴在涂有切片粘合剂的干净载玻片上，58°C烤18小时。II操作流程1常规脱蜡后，二甲苯I 10分钟，二甲苯II 10分钟，二甲苯III 10分钟，95%乙醇2
分钟后，浸泡入另一 95%乙醇2分钟，水洗3分钟。2.切片入0. 3% H2O2-甲醇溶液，37°C，30分钟，消除组织内源性过氧化物酶活性。3.切片经蒸馏水洗8-10分钟，入0. 胰蛋白酶消化液，37°C，30分钟。4.切片经蒸馏水洗8-10分钟，0. 01mol/l PH7. 4PBS洗3次，每次5min。5.抗原修复洗2次，每次lOmin，自然冷却至室温，将切片置于0. Olmol/1 CB (柠 檬酸缓冲液PH6. 0)，中，微波III档(980C ) 20min。6. PBS 洗 3 次，每次 5min。7.擦去组织周围PBS，滴加1 20马抗鼠血清，置切片于湿盒内，37°C，20分钟。8.倾去正常马抗鼠血清，滴加一抗(单克隆抗体2C8 1 400)，lOOul，37°C，60分钟。4°c，过夜。9. PBS 洗 3 次，每次 5min。10.加二抗(羊抗鼠化6)，371，401^11，？85洗3次，每次5111士11。11. 0. 04% DAB+0. 03% H2O2 显色 8min12.水洗，苏木素衬染30s，水洗，盐酸乙醇蓝化2S，水洗，微波蓝化，常规树脂封片。13.切片镜下观察阳性为棕黄色或棕褐色，并呈颗粒状，背景呈紫蓝色14.结果如图9所示。
权利要求
一种单克隆抗体，其特征在于，通过基因克隆表达的hTFPI-2免疫小鼠，制备杂交瘤细胞，所获单克隆抗体能够运用于解离增强镧系元素时间分辨荧光免疫分析(以下简称DELFIA)从而测定hTFPI-2。
2.如权利要求1所述的杂交瘤，其特征在于，该杂交瘤是hTFPI-22C8、hTFPI-2A、 hTFPI-2B。
3.如权利要求1所述DELFIA，其特征在于，该项免疫学测定法能够运用于hTFPI-2水 平的监测。
4.如权利要求3所述的hTFPI-2监测，其特征在于，运用了杂交瘤hTFPI-22C8产生的 针对hTFPI-2的单克隆抗体。
5.一种多克隆抗体，其特征在于针对hTFPI-2。
6.如权利要求5所述多克隆抗体，其特征在于能够与上述的单克隆抗体组合运用于 DELFIA,从而测定 hTFPI-2。
全文摘要
本发明涉及一种人组织因子途径抑制物-2(hTFPI-2)的单克隆抗体，产生所述单克隆抗体的杂交瘤克隆，单克隆抗体的制备方法，以及所述单克隆抗体的用途，用途包括解离增强镧系元素时间分辨荧光免疫分析(DELFIA)、免疫印迹、免疫组化。本发明还涉及一种hTFPI-2多克隆抗体，以及所述多克隆抗体在DELFIA中的应用。
文档编号G01N21/64GK101885771SQ20091005118
公开日2010年11月17日 申请日期2009年5月14日 优先权日2009年5月14日
发明者蒋芳林 申请人:蒋芳林