一种硫代葡萄糖苷提取分离方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物化工领域中一种有效物质的提取分离，具体为一种以十字花科植 物种子为原料制备硫代葡萄糖苷的提取分离方法。
【背景技术】
[0002] 十字花科的植物是目前广泛认为具有抗癌功能的一类植物。这主要是因为十字花 科的植物含有大量的硫代葡萄糖苷(glucosinolates，简称GLS)，硫代葡萄糖苷是植物的一 种含硫次级代谢产物，目前在植物中已发现了 120多种硫代葡萄糖苷。硫代葡萄糖苷是水溶 性、无挥发性、热稳定性的离子型化合物。若植物细胞发生破损，硫代葡萄苷糖水解酶，即芥 子硫苷酸酶(myrosinase，thioglucoside glucohydrolase;EC3? 2? 3? 1)被释放出来，并水 解硫代葡萄糖苷，生成硫酸氢盐、葡萄糖和一系列葡萄糖苷配基，这些配基在经过分子内的 重排形成异硫氰酸酯、硫氰酸酯、腈和少量的环硫腈。目前，有很多研究已经表明异硫氰酸 酯有良好的抗癌效果和抗氧化作用，亦有研究表明硫代葡萄糖苷在体内可代谢生成异硫氰 酸酯，继而发挥其抗癌、抗氧化及抗菌作用。近年来，国内外研究较多的硫代葡萄糖苷包括 西兰花种子中的葡糖莱菔硫烧（glucophanin，简称GRA)、萝卜种子中的萝卜硫苷 (glucophenin，简称GRE)等。硫代葡萄糖苷基本结构如下：
[0004]目前硫代葡萄糖苷的提取方法主要为热提法，使用的溶剂包括乙醇、甲醇、水和醇 水混合溶液等，考察了温度、料液比、时间等因素对提取效率的影响;硫代葡萄糖苷的分离 纯化方法主要为萃取法、酸性氧化铝法及离子交换树脂法等。经验证，使用含醇溶剂进行提 取，硫代葡萄糖苷提取率较低且成本较高;使用酸性氧化铝或离子交换树脂进行纯化，引入 大量盐分，除盐过程复杂且回收率较低。申请号为201210166482.9的中国发明专利申请公 开了一种从青花菜茎叶废弃物中提取硫代葡萄糖苷的方法，该方法将原料经75 °C水浴灭酶 后，多次使用75%甲醇水溶液提取硫代葡萄糖苷，继而采用阴离子交换对硫苷进行纯化，灭 酶不彻底，实验复杂，成本较高。申请号为2015104107303.X的中国发明专利申请公开了一 种茎硫芥硫代葡萄糖苷的提取的方法，该方法将原料经烘干灭酶、研磨及乙醚脱脂后，借助 超声破碎使用甲醇水溶液对硫代葡萄糖苷进行提取，进而使用乙酸乙酯除杂及阴离子交换 树脂纯化，纯化方法极为复杂，能耗较高，提取率仅为65%-75%，且使用甲醇、乙醚、乙酸乙 酯等有毒试剂。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于建立高效、环保、工艺简单的硫代葡萄糖苷提取纯化工艺方法。 以十字花科植物种子为原料，通过粉碎的方法实现细胞破碎，从而提高硫代葡萄糖苷的溶 出度;采用沸水提取的方法提取硫代葡萄糖苷，沸水提取既可使内源黑芥子酶失活亦可进 一步促进细胞破碎，提取率较醇水提取更加；以10 %乙醇水溶液为洗脱液，以水提液为吸附 原液，使用活性炭吸附洗脱法纯化硫代葡萄糖苷，提高硫代葡萄糖苷产品纯度至2.5-3.0 倍，整个工艺流程所得硫代葡萄糖苷回收率可达85 %以上。
[0006] 本发明所建立的硫代葡萄糖苷提取分离工艺方法，提取效率高、纯化效果好，工艺 简单、绿色环保，适用于食品级和保健品级的硫代葡萄糖苷的生产加工，具有良好的推广前 景。
[0007] 本发明的具体方法和步骤如下：
[0008] 一种使用活性炭纯化硫代葡萄糖苷的方法，以十字花科植物种子为原料，依次包 括如下步骤：
[0009] A.对原料进行粉碎
[0010] 使用粉碎机对原料进行粉碎，收集种子粉末；
[0011] B.硫代葡萄糖苷的提取
[0012] 量取去离子水加热，待去离子水沸腾后，按照固液比1: 10的比例，加入（1)中粉碎 后的原料，沸水提取lOrnin，使用滤布抽滤得到水提液;重复提取一次，收集硫代葡萄糖苷水 提液；
[0013] C.硫代葡萄糖苷的纯化
[0014] 按照活性炭:硫代葡萄糖苷质量比为1000:60-80确定活性炭用量，将水提液加入 活性炭中，于25°C条件下搅拌吸附30min，过滤得到吸附有硫代葡萄糖苷的活性炭滤饼;按 照吸附有硫代葡萄糖苷的活性炭滤饼：10%乙醇水溶液固液比为1:20，加入10 %乙醇水溶 液，使用氨水调节、经pH计测定洗脱液pH=10,于25°C条件下搅拌洗脱30min，过滤得到活性 炭和洗脱液，继续使用10 %乙醇水溶液对活性炭进行二次洗脱，收集两次洗脱液;10 %乙醇 水溶液为体积百分比浓度为1 〇 %的乙醇水溶液；
[0015] 将所得洗脱液旋干，加水溶解，重复上述吸附洗脱实验;最终所得洗脱液经减压蒸 馏、冷冻干燥。
[0016] 进一步，所用活性炭为糖用活性炭。
[0017] 1.步骤(A)中采用的原料为十字花科植物种子，如西兰花、萝卜、甘蓝、花椰菜等植 物的种子。
[0018] 2.步骤(B)中活性炭加入量需参考活性炭的饱和吸附量，如本发明所用活性炭对 萝卜硫苷的饱和吸附量为61mg/g，则萝卜硫苷水提液需浓缩到3. Omg/ml左右。
[0019] 3.步骤(C)中所用的活性炭为木质200目糖用活性炭。
[0020] 4.步骤(C)中洗脱液pH值的调节和测定分别使用氨水溶液和pH计。
[0021 ] 5.步骤(C)中固液分离设备为活性炭过滤机。
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例对本发明做进一步的描述，但这些实施例的目的并不在于限 制本发明的保护范围。以下实施例子中所采用的活性炭BET比表面积1700-1900m2/g，活性 炭脱色率：180-240mg/g，但不局限于此。
[0023] 实施例1
[0024]原料预处理:将200gGRA含量(质量百分比含量，以下同）为4.01 %的某西兰花种子 进行粉碎，得到200g西兰花种子粉末。
[0025]硫代葡萄糖苷提取:取2.3L去离子水加热，待煮沸后，向其中加入上述西兰花种子 粉末，沸水提取l〇min，滤布过滤得到GRA水提液。重复提取一次，收集GRA水提液，GRA提取率 为 98.61 %。
[0026]硫代葡萄糖苷纯化:将上述GRA水提液浓缩至2.3L，加到115g活性炭中，于25 °C条 件下搅拌吸附30min。使用活性炭过滤机进行固液分离，得到吸附有GRA的活性炭，加入2.3L 10 %乙醇水溶液，调节pH为10.0，于25 °C下洗脱30min，重复洗脱一次，收集GRA洗脱液。将上 述GRA洗脱液旋干，加入2.3L去离子水，作为活性炭吸附原液，按照上述吸附洗脱方法进行 活性炭二次纯化。将最终得到的GRA洗脱液旋干后进行冷冻干燥，得到GRA产品12.91g，产品 GRA纯度为49.81 % (原液GRA纯度为17.14%，纯化后GRA纯度提高到2.91倍），回收率为 81.30%〇 [0027] 实施例2
[0028] 原料预处理:将lOOgGRA含量为6.72 %的某西兰花种子进行粉碎，得到200g西兰花 种子粉末。
[0029] 硫代葡萄糖苷提取:取1.9L去离子水加热，待煮沸后，向其中加入上述西兰花种子 粉末，沸水提取l〇min，滤布过滤得到GRA水提液。重复提取一次，收集GRA水提液，GRA提取率 为98.56%。
[0030] 硫代葡萄糖苷纯化:将上述GRA水提液浓缩至1.9L，加到95g活性炭中，于25°C条件 下搅拌吸附30min。使用活性炭过滤机进行固液分离，得到吸附有GRA的活性炭，加入1.9L 10 %乙醇水溶液，调节pH为10.0，于25 °C下洗脱30min，重复洗脱一次，收集GRA洗脱液。将上 述GRA洗脱液旋干，加入1.9L去离子水，作为活性炭吸附原液，按照上述吸附洗脱方法进行 活性炭二次纯化。将最终得到的GRA洗脱液旋干后进行冷冻干燥，得到GRA产7.63g，产品GRA 纯度为69.55 % (原液GRA纯度为27.80 %，纯化后GRA纯度提高到2.50倍），回收率为 80.09%〇
[0031] 实施例3
[0032] 原料预处理:将200gGRA含量为3.47 %的某西兰花种子进行粉碎，得到200g西兰花 种子粉末。
[0033]硫代葡萄糖苷提取:取2.0L去离子水加热，待煮沸后，向其中加入上述西兰花种子 粉末，沸水提取l〇min，滤布过滤得到GRA水提液。重复提取一次，收集GRA水提液，GRA提取率 为96.98%。
[0034]硫代葡萄糖苷纯化:将上述GRA水提液浓缩至2.0L，加到100g活性炭中，于25 °C条 件下搅拌吸附30min。使用活性炭过滤机进行固液分离，得到吸附有GRA的活性炭，加入2.0L 10 %乙醇水溶液，调节pH为10.0，于25 °C下洗脱30min，重复洗脱一次，收集GRA洗脱液。将上 述GRA洗脱液旋干，加入2.0L去离子水，作为活性炭吸附原液，按照上述吸附洗脱方法进行 活性炭二次纯化。将最终得到的GRA洗脱液旋干后进行冷冻干燥，得到GRA产品12.70g，产品 GRA纯度为45.49 % (原液GRA纯度为15.74 %，纯化后GRA纯度提高到2.89倍），回收率为 83.11%〇 [0035] 实施例4
[0036] 原料预处理:将lOOgGRE含量为7.29%的某萝卜种子进行粉碎，得到200g西兰花种 子粉末。
[0037]硫代葡萄糖苷提取:取2.4L去离子水加热，待煮沸后，向其中加入上述西兰花种子 粉末，沸水提取l〇min，滤布过滤得到GRE水提液。重复提取一次，收集GRE水提液，GRE提取 率为98.04%。
[0038]硫代葡萄糖苷纯化:将上述GRE水提液浓缩至2.4L，加到120g活性炭中，于25 °C条 件下搅拌吸附30min。使用活性炭过滤机进行固液分离，得到吸附有GRE的活性炭，加入2.4L 10 %乙醇水溶液，调节pH为10.0，于25 °C下洗脱30min，重复洗脱一次，收集GRE洗脱液。将上 述GRE洗脱液旋干，加入2.4L去离子水，作为活性炭吸附原液，按照上述吸附洗脱方法进行 活性炭二次纯化。将最终得到的GRE洗脱液旋干后进行冷冻干燥，得到GRA产品7.29g，产品 GRE纯度为79.77 % (原液GRA纯度为31.04 %，纯化后GRE纯度提高到2.57倍），回收率为 81.32%〇 [0039] 实施例5
[0040] 原料预处理:将lOOgGRE含量为6.13%的某萝卜种子进行粉碎，得到200g西兰花种 子粉末。
[0041]硫代葡萄糖苷提取:取2.. 0L去离子水加热，待煮沸后，向其中加入上述西兰花种 子粉末，沸水提取l〇min，滤布过滤得到GRE水提液。重复提取一次，收集GRE水提液，GRE提取 率为97.68%。
[0042]硫代葡萄糖苷纯化:将上述GRE水提液浓缩至2.0L，加到100g活性炭中，于25 °C条 件下搅拌吸附30min。使用活性炭过滤机进行固液分离，得到吸附有GRE的活性炭，加入2.0L 10 %乙醇水溶液，调节pH为10.0，于25 °C下洗脱30min，重复洗脱一次，收集GRE洗脱液。将上 述GRE洗脱液旋干，加入2.0L去离子水，作为活性炭吸附原液，按照上述吸附洗脱方法进行 活性炭二次纯化。将最终得到的GRE洗脱液旋干后进行冷冻干燥，得到GRE产品7.79g，产品 GRA纯度为62.49 % (原液GRA纯度为23.23 %，纯化后GRA纯度提高到2.69倍），回收率为 81.32%〇
【主权项】
1. 一种使用活性炭纯化硫代葡萄糖苷的方法，以十字花科植物种子为原料，依次包括 如下步骤： A. 对原料进行粉碎 使用粉碎机对原料进行粉碎，收集种子粉末； B. 硫代葡萄糖苷的提取 量取去离子水加热，待去离子水沸腾后，按照固液比1:10的比例，加入（1)中粉碎后的 原料，沸水提取l〇min，使用滤布抽滤得到水提液；重复提取一次，收集硫代葡萄糖苷水提 液； C. 硫代葡萄糖苷的纯化 按照活性炭:硫代葡萄糖苷质量比为1000:60-80确定活性炭用量，将水提液加入活性 炭中，于25°C条件下搅拌吸附30min，过滤得到吸附有硫代葡萄糖苷的活性炭滤饼;按照吸 附有硫代葡萄糖苷的活性炭滤饼：10 %乙醇水溶液固液比为1:20，加入10%乙醇水溶液，使 用氨水调节、经pH计测定洗脱液pH=10,于25°C条件下搅拌洗脱30min，过滤得到活性炭和 洗脱液，继续使用10 %乙醇水溶液对活性炭进行二次洗脱，收集两次洗脱液；10 %乙醇水溶 液为体积百分比浓度为1 〇 %的乙醇水溶液； 将所得洗脱液旋干，加水溶解，重复上述吸附洗脱实验；最终所得洗脱液经减压蒸馏、 冷冻干燥。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤A中采用的原料为西兰花、萝卜、芝麻菜、 甘蓝或花椰菜种子。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征是:所用活性炭为糖用活性炭。
【专利摘要】一种硫代葡萄糖苷提取分离方法，涉及生物化工领域中一种有效物质的提取分离，具体为一种以十字花科植物种子为原料制备硫代葡萄糖苷的提取分离方法。本方法对十字花科植物种子进行粉碎，提高细胞破碎的程度，帮助硫代葡萄糖苷充分溶出。采用沸水提取法提取硫代葡萄糖苷，提取率可达96.0％以上。采用活性炭吸附洗脱法对硫代葡萄糖苷进行纯化，所得硫代葡萄糖苷产品纯度较水提液可提高2.5?3.0倍。本方法与传统的硫代葡萄糖苷提取分离方法相比，硫代葡萄糖苷提取效率高、纯化效果好，工艺简单、绿色环保，适用于食品级和保健品级的硫代葡萄糖苷的生产加工，适合大规模工业生产，具有良好的推广前景。
【IPC分类】C07H15/14, C07H1/08
【公开号】CN105713053
【申请号】CN201610180408
【发明人】袁其朋, 刘玉婷, 程立, 王澳克, 赵妍
【申请人】北京化工大学