用于生产1‑羟基吩嗪的基因工程菌株及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种用于生产1-羟基吩嗪的基因工程菌株及其制备方法和用途，属于基因工程技术领域。

背景技术：

吩嗪衍生物是一类含氮杂环化合物，通常颜色各异，以橙色或黄色为主，也有绿色、红色等，侧链取代基的不同决定了吩嗪颜色的不同，而结构上的差异同时决定了各自不同的物理属性以及抑制病原菌的生物活性。目前自然界已经发现了多种具有相似基本结构的吩嗪类化合物，有些产吩嗪的菌株能同时产生好几种不同的吩嗪衍生物，而几乎所有的吩嗪化合物对细菌和真菌都有生物活性。假单胞菌产生的吩嗪类抗生素主要包括绿脓菌素(pyocyanin，PYO)和吩嗪-1-羧酰胺(phenazine-1-carboxamide，PCN)、吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxilic acid,PCA)、1-羟基吩嗪(1-hydroxyphenazine，1-OH-PHZ)、2-羟基吩嗪(2-hydroxyphenazine，2-OH-PHZ)等。研究表明，吩嗪不仅具有抑制病原菌的生物活性，它也在根部定植及根际竞争存活方面也起到了非常重要的作用。

1-羟基吩嗪(1-OH-PHZ)是一种由铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)产生的次生代谢产物。它在细胞内可作为电子载体。当细胞进行氧化还原反应时，将电子传递到靶细胞，导致靶细胞中超氧化物的氧自由基增加而使细胞死亡。在对1-OH-PHZ的基本性质进行研究的文献中，Kawata等人研究了在闪光灯照射下，2-OH-PHZ有互变异构现象，但1-OH-PHZ比较稳定。也有文献对其生物活性进行了研究[Kawata,Hiroki；Niizuma,Shigeya；Kikuchi,Koichi.Studies ofphotoinduced tautomerism of2-hydroxyphenazine using flash photolysis[J].Journal ofPhotochemistry and Photobiology,A:Chemistry(1990),54(3),93-8.]。Badria,FaridA等人从以假单胞菌发酵液的粗提取物进行实验，发现其抑制多种革兰氏阳性菌，白色念珠菌和酿酒酵母，而从这种粗提取物中鉴定到了1-OH-PHZ[Badria,Farid A.；El-Naggar.A.Structures and antimicrobial activity of five phenazine pigments isolated from Pseudomonas aeruginosa.Scientia Pharmaceutica(1994),62(4),355-62]。Mangan等人发现1-OH-PHZ对土曲霉菌有很强的抗性。Dakhama,A等人研究了1-OH-PHZ对于藻类的抑制作用，证明1-OH-PHZ具有很强的抗绿藻和蓝藻的活性，可作为一种天然产物进行海洋的防污[Mangan,Aedine.Bristol Gen.Interactions between some auralAspergillus species and bacteria[J].Journal ofGeneral Microbiology(1969),58(2),261-6]。

1-OH-PHZ作为一种微生物的次生代谢产物，它的合成方法可以分为生物合成途径与化学合成途径。其中，对于生物合成途径来说，绝大多数文献认为假单胞菌是1-OH-PHZ的主要生产菌。早期有文献显示吩嗪生物合成的前体来自于莽草酸途径，莽草酸通过图1所示的生物转化途径转变为分支酸，并进一步合成吩嗪-1-羧酸，最后在PhzS蛋白的作用下转变为1-OH-PHZ。

对于化学合成途径来说，文献提出可以对前体进行修饰来合成1-OH-PHZ。首先，从苯並呋喃氧化物与环己二酮的环加成反应得到1-OH-PHZ的氮氧化物。这样，使用连二亚硫酸钠还原氮氧化部分来得到1-OH-PHZ。Haddadin等人提出将苯並呋喃氧化物与1，2-环己二酮在三乙胺，氮气条件下反应7到8小时，得到一种深棕色反应混合物。将这种混合物酸化，得到1-羟基吩嗪氮氧化物的混合物。未加工的1-羟基吩嗪氮氧化合物用连二亚硫酸钠处理后得到1-OH-PHZ[Haddadin,M.J.,et al."Deoxygenation of quinoxaline N-oxides and related compounds."Tetrahedron 30.5(1974):659-666.]。

当前的技术缺陷：天然的1-羟基吩嗪化合物主要出现在人类的条件致病菌——铜绿假单胞菌中，在该细胞内是以吩嗪-1-羧酸为底物，在phzS基因的作用转化而来，不仅其胞内含量非常低，而且该菌种存在一定的生物安全性问题，难以进行大规模的开发应用。

技术实现要素：

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种用于生产1-羟基吩嗪的基因工程菌株及其制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种用于生产1-羟基吩嗪的基因工程菌株，其可通过如下方法获得：

将绿针假单胞菌HT66(Pseudomonas chlororaphis HT66)CCTCCNO:M2013467及其衍生物基因组中的phzH基因(phzH的基因的碱基序列和对应蛋白质的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)替换为外源的phzS基因，即得。作为优选方案，所述phzS基因来自可将吩嗪-1-羧酸转化为1-羟基吩嗪的铜绿假单胞菌株，如铜绿假单胞菌株PAOl(参见Stover C K,Pham X Q,Erwin A L,et al.Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1,an opportunistic pathogen[J].Nature,2000,406(6799):959-964.)、PA14(参见Liberati N T,Urbach J M,Miyata S,et al.An ordered,nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14transposon insertion mutants[J].Proceedings ofthe NationalAcademy ofSciences ofthe United States ofAmerica,2006,103(8):2833-2838.)、M18(参见Wei X,Huang X,Tang L,et al.Global control of GacA in secondary metabolism,primary metabolism,secretion systems,and motility in the rhizobacterium Pseudomonas aeruginosa M18[J].Journal of bacteriology,2013,195(15):3387-3400.)、NCGM2.S1(参见Miyoshi-Akiyama T,Kuwahara T,Tada T,et al.Complete genome sequence of highly multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa NCGM2.S1,a representative strain of a cluster endemic to Japan[J].Journal ofbacteriology,2011,193(24):7010-7010.)、LESB58(参见Kukavica-Ibrulj I,BragonziA,Paroni M,et al.In vivo growth of Pseudomonas aeruginosa strains PAO1and PA14and the hypervirulent strain LESB58in a rat model ofchronic lung infection[J].Journal ofbacteriology,2008,190(8):2804-2813.)。

其中，铜绿假单胞菌株PAOl、PA14、M18、NCGM2.S1、LESB58中phzS基因的碱基序列分别如SEQ ID NO3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示。

第二方面，本发明提供了一种如前述的用于生产1-羟基吩嗪的基因工程菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)重组质粒的构建；

2)双亲杂交；

3)基因替换突变株的筛选。

作为优选方案，所述重组质粒的构建包括如下操作：

分别设计用于扩增phzH的上游同源臂引物F1和R1、下游同源臂引物F3和R3，以及phzS基因的扩增引物F2和R2并扩增相应的基因片段；

通过Infusion体系连接质粒pK18mobsacB，将phzS基因与phzH基因的上游片段和下游片段整合在一起；

重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；

其中，所述F1、R1、F2、R2、F3和R3的基因序列分别如SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13所示。

作为优选方案，所述Infusion体系的用量为10μL，且Infusion体系中，pK18mobsacB质粒3μL、infusion酶2μL、水2μL、phzS基因1μL、phzH上游同源臂1μL和phzH下游同源臂1μL。

作为优选方案，所述双亲杂交包括如下操作：

将测序验证正确的质粒转化大肠杆菌S17感受态细胞并测序验证；

将绿针假单胞菌株HT66活化后，接种于液体KB培养基中，在28℃下培养12h；将携带质粒的大肠杆菌S17接种于含50mg/L的Kan的LB培养基中，置37℃下180rpm的摇床中培养12h；

分别将绿针假单胞菌HT66和大肠杆菌S17菌液离心，以LB培养基分别重悬菌体，将二者以1:1的比例混合，并置于28℃培养箱中1h，使其发生接合转移。

作为优选方案，所述基因替换突变株的筛选联合采用单交换阳性克隆的筛选和双交换阳性克隆筛选。

作为优选方案，所述单交换阳性克隆筛选包括如下操作：

将大肠杆菌S17与假单胞菌HT66的混合菌液离心，弃去一半上清液，重新悬浮后涂布于含Amp(100mg/L)和Kan(50mg/L)的LB平板上，置于28℃培养箱中培养48h。

作为优选方案，所述双交换阳性克隆筛选包括如下操作：

挑取单交换的菌体重悬并稀释，涂布于含有15％(w/v)蔗糖的LB平板上，置于28℃培养箱中培养24h；

将生长的菌落分别接种于LB平板和含50mg/L的Kan的LB平板中，接种位置一一对应，置于28℃培养箱中培养24h；

选择在Kan平板上不能长而在LB平板生长的菌落，即重组成功的菌株使用外部引物F1和R3进行PCR验证。

第三方面，本发明提供了一种利用前述的基因工程菌株在制备1-羟基吩嗪中的用途。

作为优选方案，所述基因工程菌株在制备1-羟基吩嗪时的条件为：好氧培养；温度：26～30摄氏度；pH：6～8；转速150～250rpm。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明从水稻根际筛选到一株高产吩嗪-1-甲酰胺的绿针假单胞菌HT66(Pseudomonas chlororaphis HT66)CCTCCNO:M2013467，该菌属于植物根际细菌，属于第四类微生物，安全可靠，营养需求简单，副产物，发酵周期短，具有良好的工业化应用潜力。本发明将其中的phzH基因替换为外源的phzS基因，可以农副产品为原料合成高浓度的吩嗪-1-羧酸，该化合物在PhsS蛋白的作用下可转化为高水平的1-羟基吩嗪。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为假单胞菌中常见的吩嗪合成途径；

图2为phzS基因与phzH上下游同源臂的扩增产物电泳图：a、phzS基因扩增后的电泳图；b、phzH基因下游、上游同源臂的电泳图(分别为L1和L2)；c、基因phzS与phzH上下游片段融合产物电泳图；

图3为在HT66-S菌株的PCR验证电泳图(外部引物F1和R3)；

图4为菌株HT66和HT66-S发酵产物的HPLC图谱，图4a为HT66菌株发酵产物的HPLC图谱，图4b为HT66-S菌株发酵产物的HPLC图谱；

图5为菌株HT66-S的生长曲线图；

图6为菌株HT66-S合成1-OH-PHZ的产量与时间关系曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明的绿针假单胞菌(Pseudomonas choloraphis)HT66，该菌株已在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编为：430072，保藏日期为：2013年10月12日，保藏编号为：CCTCC NO∶M 2013467。

实施例1

本实施例涉及一种用于生产1-羟基吩嗪的基因工程菌株的制备方法，包括如下步骤：

一、重组质粒的构建

1、设计引物F2和R2，以铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板，PCR扩增其phzS基因，电泳图见图2a。

2、分别设计用于扩增phzH的上游同源臂引物F1和R1、下游同源臂引物F3和R3，通过PCR扩增同源臂并进行回收和纯化，电泳图见图2b；

3、通过Infusion体系连接质粒pK18mobsacB，将phzS基因与phzH基因的上游片段和下游片段整合在一起，该融合片段为2.8kb，电泳图见图2c；

4、重组质粒转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，然后提取质粒进行测序验证；

其中，引物F1、R1、F2、R2、F3和R3的基因序列分别如SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13所示。

具体地：F1为：5'ACATGATTACGAATT AGCCGCTGTTGGGTAAAGG3'(SEQ ID NO8)；

R1为：5'GTTTATCTCGGTACCTCAGGGTTGCAAACGCC3(SEQ ID NO9)；

F2为：5'CGACACCGCTGCGCCGGCGT3'(SEQ ID NO10)；

R2为：5'CTAGCGTGGCCGTTCCACCTGGTTG3'(SEQ ID NO11)；

F3为:5'CTCAACGCCAAATAGTACGAGCCTGAGGGAGCCACGGCAG3'(SEQ ID NO12)；

R3为:5'CGACTCTAGAGGATCATGGCCGAACCACCCTTGC3'(SEQ ID NO13)。

二、双亲杂交

1、将验证正确的质粒转化大肠杆菌S17感受态细胞，进一步测序验证；

2、将待替换基因的假单胞菌株HT66活化后，接种到液体KB培养基中，置28℃下180rpm的摇床中培养12h；将携带质粒的大肠杆菌S17也接种于含50mg/L的Kan的LB培养基中，置37℃下180rpm的摇床中培养12h；

3、将假单胞菌HT66和大肠杆菌S17菌液均离心，弃去培养基；

4、以LB培养基分别重悬菌体，将菌株HT66与S17菌体以1:1的比例混合菌液，并置于28℃培养箱中1h，使其发生接合转移。

三、单交换阳性克隆筛选

1、将菌株HT66与假单胞菌的混合菌液离心，弃去部分上清液，重新悬浮后涂布于含浓度分别为100mg/L的Amp和50mg/L的Kan的LB平板上，置于28℃培养箱中培养48h；

2、生长的菌落即为导入了重组质粒并发生单交换的假单胞菌，使用PCR扩增融合片段进行验证。

四、双交换阳性克隆筛选

1、取菌体重悬并适当稀释，涂布于含有15％(w/v)蔗糖的LB平板上，置于28℃培养箱中培养24h；

2、用灭菌牙签挑取菌落分别接种于LB平板和含50mg/L的Kan的LB平板中，位置一一对应，置于28℃培养箱中培养24h；

3、在Kan平板上不能长出菌落的即为发生双交换脱去质粒的菌株，使用外部引物F1和R3进行PCR验证，验证电泳图见图3，该片段为2.8kb，与融合质粒构建的phzS和phzH上下游同源臂的大小一致。结果表明替换成功，该菌株命名为HT66-S菌株。

实施例2

本实施例涉及一种利用实施例1制备的1-羟基吩嗪的液相色谱分析方法，包括如下步骤：

从发酵液中取出1mL菌液，12000rpm离心90s，取400μL上清液置于另一干净的1.5mL离心管中；向离心管中加入800μL乙酸乙酯，充分震荡；将萃取混合液于5000rpm离心5min，取400μL上层有机相，置于另一干净的1.5mL离心管中；将萃取后的乙酸乙酯相减压蒸馏，完全蒸干后，加入200μL甲醇，充分溶解后进行HPLC检测(若产量较大，需进行进一步稀释后进样)。HPLC检测条件：检测波长254nm，C18反相柱，流速1mL/min，柱温30℃。流动相：水相为5mM乙酸铵溶液，有机相为甲醇。

表1 流动相检测梯度

菌株HT66和HT66-S发酵液的HPLC检测结果如图4A和4B所示，根据相关化合物的标准品的HPLC图，吩嗪-1-羧酸(PCA)的出峰时间为2.8min，PCN的出峰时间为11.7min，1-羟基吩嗪的出峰时间为14.4min，将phzH基因替换为phzS基因后，菌株HT66-S的发酵液中化合物PCN消失，而1-羟基吩嗪化合物出现。

实施例3

本实施例涉及一种利用实施例1得到的基因工程菌株制备1-羟基吩嗪的方法，包括如下步骤：

将充分活化的菌株HT66WT和HT66-S分别接种到含5mL KB培养基的小瓶中于28℃，180rpm进行震荡培养。12h后以1％的接种比接种到装有100mL KB培养基的250mL三角瓶中，在相同条件下继续培养48h。定时从发酵液中取出1mL菌液，12000rpm离心90s，用移液枪吸净上清。使用1mL去离子水重悬菌体，以去离子水作为空白，在分光光度计波长600nm处测试其光密度值，即OD600。测量时需要将菌液进行适当的稀释，使得最终测量OD600读数处于0.4～0.8之间。将测量的数据绘制生长曲线，以表征菌体生长情况，见图5。结果表明，将基因phzH替换为phzS后，菌株生长无明显变化，菌株的稳定性好。

同时取样1mL，以乙酸乙酯萃取发酵液，将有机相浓缩至干后以甲醇重新溶解，用HPLC检测1-羟基吩嗪的产量，见图6。结果表明，将基因phzH替换为phzS后，能够合成1-羟基吩嗪，且发酵48h的产量为33.4mg/L，是目前报道的最高1-羟基吩嗪产量。

实施例4

对常见植物病原真菌的抑菌活性

称取适量1-OH-PHZ溶于二甲基亚砜，配制成1000mg/L的药剂溶液。按一定比例加入到融化好的PDA培养基中，混合后倒入灭菌的培养皿中，分别制成含药剂浓度为0，20，40mg/L的含药培养基平板。供试的菌株，用直径为5mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，然后将菌饼移到上述含药的培养基平板中央。以不加药的平板培养基为对照。每平板接种1块，每种药剂为1个处理，每处理重复3次。28℃全黑暗培养5天，每天用“十”字交叉法测定各处理的菌落增长直径。其中的菌落生长直径指的是菌落实际直径减去打孔器的直径。

测量了五天的菌丝生长直径后，明显观察到不同浓度的1-OH-PHZ对不同植物病原真菌的抑制效果有明显的差异，且浓度越高，抑制效果越好。为了方便鉴定，下面只列出第五天测定的植物病原真菌菌丝生长直径数据，见表2。从其中可以清晰的看出当1-OH-PHZ的药剂浓度为40mg/L时，除西瓜枯萎病原真菌外其他几种真菌均被完全抑制住。通过与空白对照比较可以发现，1-OH-PHZ对四种植物病原真菌的抑制效果由强到弱依次为：油菜菌核病原真菌>水稻稻瘟病原真菌>小麦赤霉病原真菌>西瓜枯萎病原真菌。

表2 四种植物病原真菌菌落生长直径(单位：mm)

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。