一种梅毒螺旋体感染依赖性抗原及其试剂盒和应用的制作方法

本发明属于梅毒螺旋体试剂盒制备领域，特别涉及一种梅毒螺旋体感染依赖性抗原及其试剂盒和应用。

背景技术：

梅毒(syphilis)是由梅毒螺旋体苍白亚种[Treponema pallidum subspecies pallidum(Tp)]引起的一种慢性、系统性的疾病，主要经性传播、输血传播以及垂直传播。梅毒的报道始于15世纪末欧洲，曾一度被称为“大水痘”，其诊断和临床管理一直困扰着临床医生。有流行病学数据表明世界范围内有3600万梅毒患者，每年有大于1100万的新发病例。尽管近年来这一数据有所下降，梅毒依然是引起畸胎、流产、死胎的重要原因，严重影响出生人口质量。此外，由于传播途径和艾滋病(AIDS)相同，梅毒大大增加了感染艾滋病的风险。因而及时、准确、可靠的诊断方法特别是早期梅毒的诊断对于梅毒的管理来说尤为重要。

由于梅毒螺旋体(Tp)不能进行体外培养，很大程度上限制了其致病机制的阐明和诊断方法的发展。Tp全基因组序列的解析为Tp的蛋白功能研究提供了新的契机。梅毒的血清学诊断始于100多年前,事实上，梅毒的诊断主要也是依靠血清学诊断。分为非梅毒螺旋体和梅毒螺旋体为基础的血清学试验。前者包括：TRUST、RPR、VDRL等；后者包括：TPPA、TPHA、FTA-ABS、EIA和CIA等。目前主要有2种梅毒的血清学筛查实验程序：传统的程序和与之对应的逆序法。美国疾病预防控制中心(CDC)建议使用传统方法:即梅毒血清学筛查实验始于一种非梅毒螺旋体的实验：RPR、TRUST或者VDRL，进而用一种梅毒螺旋体实验予以确证。实验室协会，英国健康保护署,国际反性传播疾病联盟则鼓励采用逆序筛查程序。近年来学者们对逆序筛查的态度不完全一致。TPPA试验具有极高的敏感性和特异性，是目前公认的梅毒确证方法，但是价格昂贵，数据不易保存，难以自动化且不能用于疗效和再感染的判断。近年来，以梅毒螺旋体外膜蛋白和鞭毛蛋白为基础的酶联免疫法和化学发光法因其独到的优势(客观、准确、耗时短，易于自动化和数字化等)，在梅毒的血清学诊断中得到了一定的发展和应用。代表性的诊断抗原包括：TPN15(Tp1071)、TPN17(Tp0435)、TPN47(Tp0574)、TPN44.5(TmpA,Tp0768)、Tp0663、Tp0965和Tp0821等,以及鞭毛蛋白FlaB1,FlaB2,FlaB3。尽管这些抗原在梅毒的血清学诊断中均有较好的表现，但目前没有数据确切表明哪一种蛋白或者重组蛋白的诊断价值最好；另外，基于以上梅毒抗原的ELISA试验等试验方法不能评价梅毒的治疗效果，而以非梅毒螺旋体为基础的血清学试验(RPR、TRUST等)主要原理是基于反应素。它们的滴度变化通常与疾病的活跃程度有着密切的关系，通常用于梅毒疗效监测。但是由于反应素在其它疾病如SLE、疟疾、单核细胞增多症等也会存在，所以假阳性率较高。

申请者前期在Tp动物实验研究过程中用活的和灭活的TpNichols标准株分组分别进行兔背部皮内接种观察免疫应答效应过程中发现：活Tp接种组新西兰兔诱导产生的抗体总水平与灭活Tp接种组并无显著差异，但前者血清中检测到有较高滴度的抗Tp0134和抗Tp0760的特异性抗体，这两种均为非菌体膜蛋白，而后者血清中并无相关抗体；活Tp接种组兔脾细胞受Tp抗原刺激后，INF-γ,TNF-α,IL-1β诱生水平均显著高于灭活Tp接种组；同时发现在早期、二期、晚期及潜伏期梅毒患者血清中均能检测到Tp0134和Tp0760的表达。以上现象我们初步推断：活的Tp感染和灭活的Tp接种，诱导机体产生免疫应答的抗原存在一定差异，活的Tp在感染阶段可能新合成分泌了一些抗原(如Tp0134和Tp0760等)到菌体内外或胞浆，以调控宿主细胞信号转导通路，介导Tp与宿主细胞间的相互作用，从而在梅毒感染早期的炎症反应以及在宿主体内持续慢性感染过程中发挥重要作用。由于这些抗原蛋白是在活的Tp感染阶段产生、合成分泌的，并不是Tp菌体膜蛋白，我们称其为梅毒螺旋体感染依赖性抗原(infection phase_dependent antigens)。

分析和比较活Tp感染后和灭活Tp接种后血清抗体与Tp“高通量融合蛋白微阵列”反应谱的差异，将极大促进Tp感染依赖性免疫优势抗原的筛选，由于目前人用Tp灭活疫苗的空白，所以目前无法获取Tp死疫苗接种的人类免疫血清；本研究采用新西兰兔血清进行抗原的筛选，理由如下：1.由于Tp的特殊生物学特性，新西兰兔是目前唯一较成熟的Tp感染模型构建对象，申请者的课题组也是国内最早成功开展新西兰兔动物感染模型构建的研究队伍，并保存有国内为数不多几家机构所有的TpNichols标准株；2.人与外界环境接触多，其它病原体接触诱导机体所产生的抗体可能与Tp抗原有交叉反应，而实验动物新西兰兔生活环境相对单一，与病原菌接触少，血清非特异性反应背景低；3.人类和新西兰兔Tp感染的抗原表达谱可能存在一定差异，如将活Tp感染的人血清与灭活的Tp免疫兔血清直接进行比较，由于种属差异对抗原表达的影响，筛选结果会出现较高的假阳性。

以非梅毒螺旋体为基础的血清学试验(RPR、TRUST等)主要原理是基于反应素。它们的滴度变化通常与疾病的活跃程度有着密切的关系，因此可以作为梅毒的判愈实验。但是由于反应素在其它疾病如SLE、疟疾、单核细胞增多症等也会存在，所以假阳性率较高。

技术实现要素：

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种梅毒螺旋体感染依赖性抗原及其试剂盒和应用，本发明在国内外首次进行梅毒感染依赖性诊断抗原的过程中，发现Tp0971、Tp0768、Tp0462符合感染依赖性抗原的特点且均具有良好的免疫活性，Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462-ELISA在与新西兰兔血清和临床病人的血清标本中均显示具有良好的诊断性能(较高的敏感性和特异性)。并且我们通过Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462-ELISA的A450值与RPR滴度变化进行相关分析，发现Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA和Tp0462-ELISA的A450值与RPR滴度变化均呈正相关。这就提示我们可以采用一种基于梅毒新类型抗原的ELISA方法来充实临床梅毒诊断方法学，且同时能替代传统的RPR/TRUST，作为梅毒的临床判愈试验。综上，Tp0971、Tp0768和Tp0462可以作为梅毒诊断的候选抗原，并且有望为新的梅毒判愈试验方法的研究奠定基础。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

梅毒螺旋体感染依赖性抗原，其为Tp0971、Tp0768和Tp0462，其氨基酸序列分别为：Tp0971：SEQ ID NO.3、Tp0768：SEQ ID NO.2和Tp0462：SEQ ID NO.1。

所述的梅毒螺旋体感染依赖性抗原，其制备方法包括如下步骤：

步骤一、软件分析TpNichils标准株全基因组所有ORFs，建立Tp疫苗候选抗原体系；

(1)采用BLAST软件，对TpNichils标准株全基因组ORFs的编码蛋白与人的全部蛋白质序列进行同源性分析，去掉有高度同源性的抗原；

以人的全部蛋白质序列为数据库，使用BLASTP程序，用Tp全基因组ORFs的编码蛋白与人的全部蛋白质序列进行比对，去掉有高度同源性的抗原；

(2)对以上初筛出的候选抗原采用细菌亚细胞定位及结构预测软件进行预测，去掉不适合作为疫苗抗原的蛋白，包括细菌胞质蛋白、跨膜结构超过4个的膜蛋白；

步骤二、Tp“高通量融合蛋白微阵列”制备技术的建立

(1)大规模抽提pGEX-6p-1和pGEX-6p-2融合蛋白表达质粒，分别采用不同组合的限制性内切酶，进行双酶切，酶切产物切胶回收，纯化后分装保存；

(2)以TpNichils标准株基因组DNA为模板，对筛选出的有价值ORFs进行PCR扩增，将每个扩增产物构建ORF/pGEX重组质粒，转化大肠杆菌；采用pGEX载体通用引物及每个ORF的特异性引物对转化生长的细菌克隆进行筛查和鉴定；

(3)将鉴定阳性的单克隆菌落扩大培养，离心收集菌体，超声裂解细胞收集含有大量可溶性的GST-融合蛋白的上清液，分装、-80℃保存备用；取1ml上述上清液预处理后，SDS-PAGE胶电泳，考马斯亮蓝染色，鉴定融合蛋白的表达情况；

(4)将上述可溶性GST-融合蛋白和采用相同方法制备的GST对照蛋白，依次点样固相化于预先包被有谷胱甘肽的微量反应板中，20μL/well，制备高通量的Tp“融合蛋白微阵列”；

步骤三、新西兰兔TpNichils标准株活Tp感染和灭活Tp免疫血清的制备

(1)常规方法进行Tp的培养与纯化；

(2)紫外线灭活Tp的制备；

将纯化的Tp菌悬液转入无菌细胞培养皿，置G36T5L/C型紫外灯下5cm²处照射45min，每15min晃动平皿一次，NS定容至原体积，分装、-80℃保存备用；

(3)新西兰兔Tp感染和免疫血清的制备

选用2.5-3kg成年新西兰兔40只，随机分为两组：其中一组在背部剃毛处理后皮下接种8个皮丘，每个位点接种量为Tp Nichols株菌数10⁵个，感染期间喂饲无抗生素的饲料和饮水；另一组用佐剂联合高剂量的灭活Tp，10⁶IFU/每个位点，同法接种免疫新西兰兔，共接种3次，0d,14d,28d，第三次免疫后2周，两组兔均抽血分离血清-20℃保存备用；

步骤四、Tp感染依赖性免疫优势抗原筛选和鉴定：

Tp Nichols株感染组和灭活Tp免疫组的所有兔血清各20份为一抗，分别与Tp“高通量融合蛋白微阵列”中的每一种GST-融合蛋白和采用相同方法制备的GST对照蛋白反应，以HRP标记的抗兔抗体为二抗，酶标仪读取405nm波长OD值。GST-融合蛋白孔OD值大于或等于GST对照孔2倍以上判断为阳性。比较分析活Tp感染组和灭活Tp免疫组血清与Tp抗原反应谱差异，筛选仅被Tp感染组血清抗体特异性识别的Tp抗原，即感染依赖性抗原。

进一步的，其制备方法的步骤一(1)中，确定两个蛋白高度同源性的标准为：E-value’值低于1e-10，以及同源序列高于蛋白序列总长的30％。

进一步的，其制备方法的步骤一(2)中Tp胞质蛋白选择标准如下：SignalP3.0软件预测无信号肽；TMHMM3.0软件预测无跨膜结构；5种细菌亚细胞定位软件至少有3种预测该蛋白为胞质蛋白；Tp跨膜结构超过4个的膜蛋白标准如下：被TMHMM3.0软件预测出至少有4个或4个以上的跨膜结构；5种细菌亚细胞定位软件至少有3种预测该蛋白为膜蛋白。

基于梅毒螺旋体感染依赖性抗原Tp0971、Tp0768和Tp0462的梅毒诊断及临床判愈用试剂盒。

进一步的，所述试剂盒为酶标法试剂盒、胶体金试剂盒、免疫荧光标记试剂盒、化学发光试剂盒或PCR试剂盒，WB试剂盒等。

所述梅毒螺旋体感染依赖性抗原在梅毒感染检测及临床判愈方面的应用。

所述梅毒螺旋体感染依赖性抗原制备的试剂盒在梅毒感染检测及临床判愈方面的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明公开了基于梅毒螺旋体感染依赖性抗原Tp0971、Tp0768和Tp0462，基于梅毒螺旋体感染依赖性抗原Tp0971、Tp0768和Tp0462筛选建立的ELISA法不仅有良好的临床诊断效能，还有可能成为特异性高的梅毒临床判愈试验方法替代目前现有的非特性且具有假阳性的RPR、TRUST临床判愈试验方法，具有广阔的应用前景和临床价值。本发明在国内外首次进行梅毒感染依赖性诊断抗原的过程中，发现Tp0971、Tp0768、Tp0462符合感染依赖性抗原的特点且均具有良好的免疫活性，Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462-ELISA在与新西兰兔血清和临床病人的血清标本中均显示具有良好的诊断性能(较高的敏感性和特异性)。并且我们通过Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462-ELISA的A450值与RPR滴度变化进行相关分析，发现Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA和Tp0462-ELISA的A450值与RPR滴度变化均呈正相关。这就提示我们或许可以采用一种基于梅毒新类型抗原的ELISA方法来充实临床梅毒诊断方法学，且同时能替代传统的RPR/TRUST，作为梅毒的临床判愈试验。综上，Tp0971、Tp0768和Tp0462可以作为梅毒诊断的候选抗原，并且有望为新的梅毒判愈试验方法的研究奠定基础。同时鉴于其良好的免疫原性，可在后期考虑作为梅毒疫苗的候选抗原用于梅毒各类型疫苗的研发应用。

附图说明

图1A、1B、1C分别为Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462-ELISA ROC曲线图。

图2：Tp0971-ELISA、TP0462-ELISA、Tp768-ELISA与168份梅毒血清的韦恩氏图

图3A、3B、3C分别为168份梅毒阳性血清标本Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462ELISA A450值与RPR滴度散点分布图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：

试验例：一、Tp疫苗感染依赖性免疫优势抗原的筛选及鉴定

1)软件分析TpNichils标准株全基因组所有ORFs，建立Tp疫苗候选抗原体系

(1)采用BLAST软件，对TpNichils标准株全基因组ORFs的编码蛋白与人的全部蛋白质序列进行同源性分析，去掉有高度同源性的抗原

以人的全部蛋白质序列为数据库，使用BLASTP程序，用Tp全基因组ORFs的编码蛋白与人的全部蛋白质序列进行比对，去掉有高度同源性的抗原(确定两个蛋白高度同源的标准：E-value’值低于1e-10，以及同源序列高于蛋白序列总长的30％)。

(2)对以上初筛出的候选抗原采用细菌亚细胞定位及结构预测软件进行预测，去掉不适合作为疫苗抗原的蛋白，包括细菌胞质蛋白、跨膜结构超过4个的膜蛋白

根据反向疫苗学理论，除细菌胞质蛋白外，其他亚细胞定位的蛋白如膜蛋白、周质蛋白和分泌蛋白均可能引起宿主免疫反应而成为可能的疫苗候选抗原。而从实验角度考虑，细菌膜蛋白跨膜结构超过4个，以可溶性形式表达蛋白将非常困难，不适合大规模纯化和生产疫苗，所以也被排除

Tp胞质蛋白标准如下：SignalP3.0软件预测无信号肽；TMHMM3.0软件预测无跨膜结构；5种细菌亚细胞定位软件至少有3种预测该蛋白为胞质蛋白。Tp跨膜结构超过4个的膜蛋白标准如下：被TMHMM3.0软件预测出至少有4个或4个以上的跨膜结构；5种细菌亚细胞定位软件至少有3种预测该蛋白为膜蛋白。

2)Tp“高通量融合蛋白微阵列”制备技术的建立

(1)大规模抽提pGEX-6p-1和pGEX-6p-2融合蛋白表达质粒，分别采用不同组合的限制性核酸内切酶，进行双酶切，酶切产物切胶回收，纯化后分装保存；

(2)以TpNichils标准株基因组DNA为模板，对筛选出的有价值ORFs进行PCR扩增，将每个扩增产物构建ORF/pGEX重组质粒，转化大肠杆菌；采用pGEX载体通用引物及每个ORF的特异性引物对转化生长的细菌克隆进行筛查和鉴定；

(3)将鉴定阳性的单克隆菌落扩大培养，离心收集菌体，超声裂解细胞收集上清液(即含有大量可溶性的GST-融合蛋白)，分装、-80℃保存备用；取1ml上述上清液预处理后，SDS-PAGE胶电泳，考马斯亮蓝染色，鉴定融合蛋白的表达情况；

(4)将上述可溶性GST-融合蛋白和采用相同方法制备的GST对照蛋白，依次点样固相化于预先包被有谷胱甘肽的微量反应板(Pierce,Rockford,IL)中，20μL/well，制备高通量(300待测抗原以上)的Tp“融合蛋白微阵列”。

3)新西兰兔TpNichils标准株活Tp感染和灭活Tp免疫血清的制备

(1)Tp的培养与纯化：【具体详细步骤可参考申请者赵飞骏博士学位论文《梅毒螺旋体膜蛋白纳米核酸疫苗的优化及免疫接种策略初步研究》第一章节】

(2)紫外线灭活Tp的制备

将纯化的Tp菌悬液转入无菌细胞培养皿，置G36T5L/C型紫外灯下5cm2处照射45min，每15min晃动平皿一次，NS定容至原体积，分装、-80℃保存备用。

(3)新西兰兔Tp感染和免疫血清的制备

选用3kg左右成年新西兰兔40只，随机分为两组：其中一组在背部剃毛处理后皮下接种8个皮丘，每个位点接种量为Tp Nichols株菌数10⁵个左右，感染期间喂饲无抗生素的饲料和饮水。另一组用佐剂联合高剂量的灭活Tp(10⁶IFU/每个位点)同法接种免疫新西兰兔，共接种3次(0d,14d,28d)，第三次免疫后2周，两组兔均抽血分离血清-20℃保存备用。

4)Tp感染依赖性免疫优势抗原筛选和鉴定：

Tp Nichols株感染组和灭活Tp免疫组的所有兔血清各20份(一抗)，分别与Tp“高通量融合蛋白微阵列”中的每一种GST-融合蛋白和采用相同方法制备的GST对照蛋白反应，以HRP标记的抗兔抗体为二抗，酶标仪读取405nm波长OD值。GST-融合蛋白孔OD值大于或等于GST对照孔2倍以上判断为阳性。比较分析活Tp感染组和灭活Tp免疫组血清与Tp抗原反应谱差异，筛选仅被Tp感染组血清抗体特异性识别的Tp抗原，即感染依赖性抗原。

试验例二、梅毒螺旋体感染依赖性抗原Tp0971，Tp0462,Tp0768在梅毒筛查以及判愈试验中的血清学评价

2.1梅毒螺旋体(Nichols株)全基因组的提取

梅毒螺旋体(Nichols株)由南华大学病原生物研究所保存。动物实验严格按照国家的相关规定，由南华大学动物伦理委员会审查批准。以Qiagen基因组提取试剂盒(Qiagen，Hilden,Germany)，按说明书操作流程提取梅毒螺旋体全基因组DNA模板。

2.2重组蛋白的克隆表达、纯化及鉴定

从GenBank(http://www.ncbi.nlm.nhi.gov/)中分别获取Tp0768、Tp0971和Tp0462的基因序列，利用Primer 6.0软件，根据引物设计和酶切位点设计原则，结合PET30a(+)酶切位点图谱，分别在上下游引物前加入酶切位点和保护性碱基，设计引物及引入酶切位点分别如下:

Tp0768：

P1：5’CGCGGATCC ATGAATGCTCATACGCTTGTGT 3’ BamHI

P2：5’CCGGAATTCTCATCGAGAGGCTCCTTCTT 3’EcoR I

Tp0971：

P1：5’CGCGGATCC ATGAAGAGGGTGAGTTTGCTC 3’ BamHI

P2：5’CCGCTCGAGCTACCACTGAGGCCCCTTC 3’ XhoI

Tp0462：

P1：5’CGCGGATCCGTGCGCCGCATAGTCTGT 3’ BamHI

P2：5’CCGCTCGAGTCAGTGTTGCCCGTTTTTGA 3’ XhoI

以提取的Tp Nichols株DNA为模板，分别以Tp0768(P1)、Tp0768(P2)；Tp0971(P1)、Tp0971(P2)；Tp0462(P1)、Tp0462(P2)为引物，PCR分别扩增得到相应的基因Tp0768、Tp0971和Tp0462，

以Tp Nichols株DNA为模板，分别以Tp0462(P1)、Tp0462(P2)；Tp0768(P1)、Tp0768(P2)；Tp0971(P1)、Tp0971(P2)为引物，PCR分别扩增得到相应的基因Tp0462、Tp0768和Tp0971。PCR扩增的条件分别如下：

以pET30a为载体，分别构建重组质粒pET30a(﹢)-Tp0462、pET30a(﹢)-Tp0768、pET30a(﹢)-Tp0971，酶切鉴定和PCR鉴定，筛选阳性克隆并测序，将经测序鉴定正确的重组质粒分别转化至表达菌E.coli BL21(DE3)中。分别挑选阳性单个菌落，在含50μg/mL卡那霉素的LB培养基上37℃培养过夜，次日分别取培养物1：100转种继续培养至菌体A₆₀₀＝0.6时，加入IPTG诱导表达(终浓度分别为0.5mmol/L，1.0mmol/L,0.5mmol/L):Tp0768和Tp0462于20℃诱导培养4小时；Tp0971于37℃诱导培养4小时。同时设立未诱导组合阴性对照组。离心收集菌体，用超声波破碎菌体后分别收集上清液和沉淀，SDS-PAGE电泳分析表达结果。

然后克隆进入pET30a中分别构建重组质粒pET30a(﹢)-Tp0768、pET30a(﹢)-Tp0971、pET30a(﹢)-Tp0462，酶切鉴定和PCR鉴定，筛选阳性克隆并测序，将经测序鉴定正确的重组质粒分别转化至表达菌E.coli BL21(DE3)中。分别挑选阳性单个菌落，在含50μg/mL卡那霉素的LB培养基上37℃培养过夜，次日分别取培养物1：100转种继续培养至菌体A600＝0.6时，加入IPTG诱导表达(终浓度分别为1.0mmol/L,0.5mmol/L,0.5mmol/L):Tp0768和Tp0462于20℃诱导培养4小时；Tp0971于37℃诱导培养4小时。同时设立未诱导组合阴性对照组。离心收集菌体，用超声波破碎菌体后分别收集上清液和沉淀，SDS-PAGE电泳分析表达结果。分别大量诱导表达重组蛋白，Ni-NTA亲和层析柱纯化表达产物，Western-blot鉴定重组蛋白的抗原特异性,BCA试剂盒(Pierce,Rockford,USA)测蛋白浓度，纯化后且经浓度测定的重组蛋白用于后续的ELISA实验。

2.3 Tp0971-ELISA，Tp0462-ELISA,Tp0768-ELISA的建立及在梅毒筛查以及判愈试验中的血清学评价

分别以Tp0971、Tp0768和Tp0462为抗原包被于ELISA 96孔板(Costar,USA)，经反复摸索、优化条件，最终确定Tp0971、Tp0768、Tp0462的包被浓度分别为5μg/ml，3μg/ml，10μg/ml，然后均采用5％脱脂牛奶(5.0g脱脂奶粉溶解于100mLPBS)在4℃条件下封闭24h,PBST(0.05％Tween 20的PBS)洗板3次。336份血清样本为一抗(1：100，以5％的脱脂牛奶稀释)，每孔100μL,于37℃孵育1h,PBST(0.05％Tween 20的PBS)洗板5次。HRP标记的山羊抗人IgG抗体(Proteintech)为二抗(1：10000，以5％的脱脂牛奶稀释)，每孔100μL,37℃孵育30min,PBST(0.05％Tween 20的PBS)洗板5次。37℃TMB显色20min，加终止液(2mol/L H₂SO₄)终止反应，在全自动酶标检测仪(Multiskan MK3)上于450nm下读数，记录结果。同时对这336份血清分别按照试剂盒的操作说明书进行TPPA试验(日本富士瑞必欧株式会社)、梅毒初筛ELISA试剂盒(珠海丽珠试剂股份有限公司，IgG/IgM)和RPR(上海科华生物工程股份有限公司)检测。所有样本重复测定3次，取平均值。

3、结果

3.1 Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462ELISA与TPPA比较的评价:

与TPPA相比，336份血清的诊断阳性标本数和灵敏度、特异度等指标分别见表1和表2。结合ROC曲线分析(图1)，Tp0971、Tp0768、Tp0462均可望成为梅毒螺旋体诊断抗原。图1Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462-ELISA ROC曲线图

注：图1A、1B、1C分别为Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462-ELISA ROC曲线图，横坐标为1-特异度(真阴性率)，纵坐标为敏感度(真阳性率)。ROC曲线下面积值在0.5～1.0之间。在AUC﹥0.5的情况下，AUC越接近1，说明诊断效果越好。AUC在0.7～0.9之间有一定的准确性，在0.9以上时具有较高的准确性。Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462-ELISA ROC曲线下面积分别为0.983、0.990和0.997。

表1：Tp0971、Tp0768、Tp0462对336份标本的诊断阳性数(率)

表2：Tp0971、Tp0768、Tp0462与TPPA相比的诊断性能评价

·注：“+”代表阳性结果，“-”代表阴性结果.

3.2 Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462ELISA与丽珠梅毒初筛ELISA试剂诊断评价：

336份血清标本Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462ELISA结果与丽珠梅毒初筛ELISA试剂盒相比(表3)，一致性极好。

表3：Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462-ELISA与丽珠梅毒初筛ELISA试剂盒的符合率比较

·注：注：“+”代表阳性结果，“-”代表阴性结果.

·

与TPPA相比，丽珠梅毒ELISA初筛试剂盒的结果为：168份梅毒阳性标本全部检出阳性，168份阴性血清标本检出12例阳性，其诊断的灵敏度为100％，特异度为92.8％；一般认为，kappa值大于0.75认为有极好的一致性，kappa值在0.4和0.75之间为中高度一致，kappa值≤0.4认为一致性较差。

3.3 Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462ELISA的韦恩氏图(交并集关系)分析：

168份梅毒阳性血清中，有148份血清与Tp0971、Tp0768、Tp0462均反应，1份血清仅与Tp0971反应，0份血清仅与Tp0768反应，0份血清仅与Tp0462反应，Tp0768和Tp0971的交集为12份，Tp0462和Tp0768，Tp0462和Tp0791的交集均为3份。其中仅有一份标本与Tp0971、Tp0768、Tp0462均不反应(图2)。

图2：Tp0971-ELISA、TP0462-ELISA、Tp768-ELISA与168份梅毒血清的韦恩氏图

注：图示Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA和Tp0462-ELISA分别对168份梅毒阳性标本测定的交并集关系，数字均代表检出阳性例数。

3.4 Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462ELISA OD450nm与RPR滴度变化的分析:

经SPSS软件(版本18.0)Spearman秩相关分析：Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462-ELISA的A₄₅₀值与RPR滴度变化(图3)，提示Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA和Tp0462-ELISA的A₄₅₀值与RPR滴度变化均呈正相关。此外，临床诊断阳性而与Tp0971、Tp0768、Tp0462建立的ELISA-IgG反应均呈阴性的个体中，我们发现一个有趣的现象:即他们的年龄均大于40岁，且这部分样本的RPR滴度均小于1：4(表4)。

图3:Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462-ELISA A₄₅₀nm与RPR滴度散点分布

图3A、3B、3C分别为168份梅毒阳性血清标本Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462ELISA A₄₅₀值与RPR滴度散点分布图，利用SPSS软件包(版本18.0)作Spearman秩相关分析，得到Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462ELISA A₄₅₀值与RPR滴度相关系数分别为0.374，0.432和0.286。如果我们收集梅毒病人从就诊到治愈期间的血清标本，作同样的分析，得到的结果会更趋向于我们的目的：Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462ELISA法有望为梅毒的疗效监测奠定基础。

表4：TPPA阳性而Tp0971、Tp0768、Tp0462ELISA-IgG为阴性的标本分析

结果分析：

Tp0768一般认为是梅毒螺旋体的一种质膜蛋白，又名TmpA抗原，由345个氨基酸组成，分子量约37kDa。前已述及，该抗原有较好的免疫活性，可以作为一种梅毒诊断抗原。Tp0971，由204个氨基酸组成，分子量约为22kDa，相关初步研究认为其为可能为梅毒螺旋体内膜脂蛋白，跟梅毒螺旋体的新陈代谢和离子稳定有关，McKevitt M报道，重组GST-Tp0971融合蛋白与梅毒患者血清可以发生抗原抗体反应。Tp0462，由392个氨基酸组成，分子量约40kDa，属于TP013X家族，是一种目前功能未知的假定蛋白，经生物信息学分析，推测Tp0462具有信号肽，有可能是一种具有多个抗原表位区的分泌蛋白。

本研究前期在Tp动物实验研究过程中用活的和灭活的Tp Nichols标准株分组分别进行兔背部皮内接种观察免疫应答效应,分别分离兔血清大范围筛选梅毒螺旋体感染依赖性抗原的过程中发现：活Tp接种组新西兰兔诱导产生的抗体总水平与灭活Tp接种组并无显著差异，但前者血清中检测到有较高滴度的抗Tp0134和抗Tp0470的特异性抗体，这两种均为非菌体膜蛋白，而后者血清中并无相关抗体。经大范围(约200个的梅毒螺旋体抗原蛋白)的进一步筛选验证，本研究选取的蛋白Tp0971、Tp0768、Tp0462均符合感染依赖性抗原的特性，这一结果与传统认为的Tp0768可能为质膜蛋白，Tp0971为内膜脂蛋白的推测有差异，这有待进一步研究。

用336份血清分别与Tp0971、Tp0768、Tp0462这3个蛋白建立的ELISA实验进行反应,Tp0971、Tp0768、Tp0462均具有较高的敏感性和特异性。经ROC曲线分析，曲线下面积分别为98.3％,99.0％和99.7％，说明这3个蛋白均可以作为梅毒的诊断抗原使用。而通过韦恩图的绘制我们发现，Tp0971、Tp0768、Tp0462都存在漏检，这从侧面反映出了单个抗原诊断效果可能不如多个重组蛋白联合使用好。此外，Tp0971、Tp0768、Tp0462均检测不出的这1例梅毒患者可能是因为个体差异以及ELISA方法本身的局限性决定了其不能作为梅毒诊断的“金标准”。而通过与TPPA试验、丽珠公司生产的梅毒初筛ELISA试剂盒及上海科华生物工程股份有限公司生产的RPR试剂对比显示，分别以Tp0971、Tp0768、Tp0462建立的ELISA方法与TPPA和丽珠梅毒初筛ELISA试剂盒具有较高的符合率，而与RPR试剂一致性不理想。本实验中，TPPA阳性而3个蛋白的ELISA-IgG结果为阴性的这部分梅毒患者共有21例，年龄均大于40岁，可能是跟这一部分人机体的抗体水平低下有关。另外，这部分个体的样本RPR的滴度均小于1：4，我们猜测有可能是a:血清抵抗(血清固定)现象，b：这部分病人可能经历了梅毒感染到梅毒治愈的这一过程，导致ELISA-IgG结果从阳转阴，提示这几个蛋白作为临床疗效监测指标的可能性。我们下一步将收集各期梅毒患者从就诊到治愈期间的标本，来验证我们的猜测。

RPR和VDRL的敏感性取决于疾病的进程，有报道称在一期梅毒中二者的敏感性分别为86％和78％，而在二期梅毒中二者的敏感性可达到100％。虽然ELISA的敏感性被认为很高，但据报道有些ELISA试剂在一期梅毒中的敏感性可能不如RPR,另有学者发现眼梅毒患者若RPR滴度很高的话，应警惕合并HIV感染。本试验中，RPR与Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462ELISA相比诊断的一致性较差，这反映了2种梅毒血清学诊断方法在梅毒初筛中的差异性。RPP的主要意义在于评价梅毒的治疗效果以及用于梅毒再感染的判断。

如若能将敏感性和特异性较高的ELISA试验和用于梅毒疗效监测的RPR实验的优势结合，寻找到某种蛋白，既可以用于梅毒的诊断，又能作为梅毒治疗效果评判的ELISA试验，无论从梅毒诊断还是从降低梅毒治疗的成本来说，都将是一种福音。与TPPA相比，丽珠梅毒初筛ELISA试剂盒的灵敏度为100％，而其特异度为92.8％，反映了其作为梅毒初筛试剂盒极高的灵敏度，主要目的在于防止漏检，但是通过Spearman秩相关分析，其OD值与RPR结果为不相关。而我们建立的Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA和Tp0462-ELISA的A450值与RPR的滴度相关系数分别为0.374，0.432和0.286，具有一定的正相关，符合本研究三种蛋白建立的ELISA可能作为梅毒疗效监测的设想。如前面所述，单个蛋白的诊断效果可能比不上多个重组蛋白联合检测。本研究准备下一步通过生物信息学分析，筛选出Tp0971、Tp0768、Tp0462的优势表位肽段，合成多聚肽，并建立ELISA方法，期望合成的多聚肽在梅毒的诊断中具有更高的敏感性和特异性，且能用于梅毒的疗效监测。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。