一种产碱性果胶酶的重组菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种产碱性果胶酶的重组菌及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术：

果胶酶是一种复合酶，能够将果胶聚合物分解成不饱和寡聚半乳糖醛酸。该酶分布广泛，在部分寄生线虫、植物和微生物内都有发现。果胶酶应用广泛，已有40多年的工业应用史。根据最适反应pH的不同将果胶酶分为酸性果胶酶和碱性果胶酶(Alkaline Polygalacturonate Lyase，PGL)，其中酸性果胶酶主要应用于澄清果汁果酒，提取果蔬汁，果实脱皮等方面。PGL应用主要应用于纺织、食品、造纸行业和环境领域。应用酶法作用上述领域相关反应具有环保、节约原料耗材和反应条件温和等优点。然而目前对PGL进行分子改造研究较少，进行商品化的PGL也很少。

目前表达碱性果胶酶的宿主主要是毕赤酵母、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。虽然通过发酵优化等手段可以有效提高碱性果胶酶的产量，但当达到一定限度碱性果胶酶的产量不能进一步提高，限制了碱性果胶酶的工业化生产，因此需从源头解决限制碱性果胶酶表达的因素。

毕赤酵母宿主虽然具有表达蛋白易于纯化等优点，然而目前的碱性果胶酶在毕赤酵母中表达时，存在表达量不高或者是外源基因原始核苷酸序列并不十分适合于毕赤酵母宿主的问题，从而限制了碱性果胶酶在毕赤酵母中的高效表达，酵母真核表达系统中存在的糖基化现象对碱性果胶酶的高效表达及性质存在极大影响。

因此，有必要对碱性果胶酶糖基化位点的处理，进一步提高碱性果胶酶生产菌株的生产能力以更适应工业化的需要。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种糖基化位点删除的碱性果胶酶，以及表达该碱性果胶酶的毕赤酵母基因工程菌。

本发明的第一个目的是提供一种碱性果胶酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是所述基因编码的碱性果胶酶。

本发明的第三个目的是提供含有所述基因的载体或细胞系。

本发明的第四个目的是提供一株毕赤酵母基因工程菌，以pPIC9K为载体，表达SEQ ID NO.1所示的碱性果胶酶基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以Pichiapastoris GS115为宿主。

本发明的第五个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，所述方法是将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的碱性果胶酶基因与表达载体pPIC9K连接，转化至毕赤酵母中。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤如下：

(1)以基因K314Mopt(申请号为201610170070.0，公开日为2016年7月13日的专利申请中公开)为起始基因，通过点突变改造碱性果胶酶基因PGL/N185Q，其序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)将步骤(1)获得的碱性果胶酶基因连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K上，得到重组质粒pPIC9K-N185Q；

(3)将步骤(2)获得的重组质粒pPIC9K-N185Q转化Pichia pastoris GS115得到糖基化位点删除的表达碱性果胶酶的基因工程菌株。

本发明的第六个目的是提供一种摇瓶生产碱性果胶酶的方法，是将所述的基因工程菌接种至BMGY培养基中，发酵生产碱性果胶酶。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是先将基因工程菌接种至BMGY培养基中培养16～24h后再转接至含有占培养基体积7-10％的甲醇的BMMY培养基中，于22-28℃、200～220rpm下诱导，诱导过程中每24h添加终浓度为10-20mL/L发酵液的甲醇。

在本发明的一种实施方式中，所述BMGY培养基每升含：蛋白胨20g，酵母粉10g，甘油40g，YNB 13.4g，pH6.0的0.1mol的磷酸盐缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，所述BMMY培养基每升含：蛋白胨20g，酵母粉10g，70-100mL甲醇，YNB 13.4g，pH6.0的0.1mol的磷酸盐缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，所述方法在发酵罐中进行，将所述基因工程菌在液体培养基中活化，将活化后的菌液以10～15mL菌液/100mL培养基的接种量接种于装液量500～1000mL发酵培养基的3L发酵罐中，初始搅拌转速为500～550r/min，通气量为1.5～2vvm，控制pH 5.5-6.0，生长期培养温度为28-30℃；当甘油耗尽溶氧反弹时以指数流加方式补加甘油，待甘油再次耗尽溶氧反弹时，饥饿培养1～2h，再流加诱导培养基，并将温度降低至22-28℃，搅拌转速升高至900-1000r/min；所述诱导培养基是含有12ml/L PTM₁的甲醇。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基含有85％磷酸26.7ml/L，CaSO₄0.93g/L，K₂SO₄18.2g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油40.0g/L，PTM₁4.35ml/L。

本发明还提供所述碱性果胶酶在食品、纺织、环境、造纸方面的应用。

本发明的有益效果：相对于未删除糖基化位点的基因工程菌株，本发明的基因工程菌株Pichia pastoris GS115-N185Q在摇瓶水平上的酶活可达到566.4U/mL(96h)，提高了87.9％；在3L罐上22℃诱导时酶活提高143.14％，28℃诱导时酶活提高213.81％，达到2411.57U/mL，是现有报道的毕赤酵母中的最高水平，且实现了在28℃(相对于现有技术的较高温度)下高效表达，为碱性果胶酶的大规模生产奠定了良好的基础。本发明得到的碱性果胶酶可在碱性条件下催化通过反式消去作用聚半乳糖醛酸的α-1,4糖苷键裂解，广泛应用于食品、纺织和造纸等行业。

附图说明

图1为不同点突变对PGL糖基化程度及分泌的影响；泳道1为K314Mopt；2-8分别为K314Mopt、N128Q、N185Q、N353Q、N128Q-N185Q、N128Q-N353Q、N185Q-N353Q、N128Q-N185Q-N353Q；

图2为不同点突变对PGL胞外酶活及热稳定性的影响；

图3为28℃诱导条件下K314Mopt及N185Q 3L罐发酵水平；a代表K314Mopt，b代表N185Q。

具体实施方式：

样品预处理：发酵液8000rpm离心10min，胞外PGL即包含于发酵上清液之中，取一定量做检测。

碱性果胶酶酶活测定：采用分光光度法测定，在235nm处测定吸光度值。

PGL反应体系：含0.2％聚半乳糖醛酸(底物)的甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2mol·L_-¹，0.44mmol·L^-1的CaCl₂，pH9.4)2mL，待测样品20μL，无活性的酶液为空白对照。

PGL反应条件：将反应体系置于45℃下水浴15min，用3mL磷酸溶液(0.03mol·L^-1)终止反应，在235nm处测定吸光度值。

单位酶活定义：单位时间裂解聚半乳糖醛酸产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸所用的酶量。

酶的热稳定性测定：取离心后的发酵上清液，于55℃反应30min，测定残余酶活。

BMGY培养基(1L)：蛋白胨20g，酵母粉10g，甘油40g，商业YNB培养基13.4g，pH6.0的0.1mol的磷酸盐缓冲液。

BMMY培养基(1L)：蛋白胨20g，酵母粉10g，70-100mL，商业YNB培养基13.4g，pH6.0的0.1mol的磷酸盐缓冲液。

实施例1：重组菌的构建及鉴定

以基因K314Mopt为起始对照基因，通过点突变改造形成糖基化位点删除的碱性果胶酶基因PGL/N185Q，获得如SEQ ID NO.1的碱性果胶酶基因，再设计引物，通过PCR的方法获得碱性果胶酶基因N185Q，将其克隆至表达载体pPIC9K上，获得重组质粒pPIC9K-N185Q，将重组载体转化Pichia pastoris GS115，经筛选鉴定获得重组菌株Pichia pastoris GS115-pPIC9K-N185Q。

引物如下：

PGL-F：GCTGAAGCTTACGTAGAATTCGCTGATTTGGGTCATCAAACACTTG

PGL-R：AAGGCGAATTAATTCGCGGCCGCTTAGTTCAATTTTCCAGCACCTGCT

采用电转化法将基因转入毕赤酵母细胞。具体步骤如下：挑取酵母受体菌的单菌落接种于25mL YPD液体培养基中，30℃摇床过夜；以5％接种量转接50mLYPD液体培养基，30℃摇床培养至OD₆₀₀＝1.3-1.5；4℃离心5000rpm，5min，弃上清；用50mL冰预冷无菌水将菌体重悬；4℃离心5000rpm，5min，弃上清；用25mL冰预冷无菌水将菌体重悬；4℃离心5000rpm，5min，弃上清；再用5mL 1mol·L^-1的冰预冷的山梨醇洗涤1次，重悬，4℃，5000rpm离心5min，弃上清；加入适量体积1mol·L^-1的冰预冷的山梨醇，重悬；分装至无菌EP管中，每管80ul，以备转化。将提取的共表达载体pPIC9K-PGL用酶Sal I线性化，在80μl酵母感受态细胞中加入线性化的质粒1-5μg冰上放置15分钟，迅速加入0.2cm电击杯中(冰预冷)，1500v电击，迅速加入1mL冰预冷的山梨醇，涂MD平板，培养3-4天后挑取单克隆进行下一步筛选。

采用上述相同的策略构建删除其他几个糖基化位点的菌株N128Q、N353Q，及组合突变的菌株N128Q-N185Q、N128Q-N353Q、N128Q-N185Q-N353Q。

实施例2：基因工程菌株摇瓶发酵

培养方法：菌株在种子活化后接种到基本发酵培养基YPD，于30℃、220rpm条件下培养14h，转接至优化后的生长培养基BMGY培养基于30℃、220rpm条件下培养24h，再将菌株转入诱导培养基BMMY中22℃、220rpm，每24h添加1.5％(1.5mL甲醇/100mL发酵液)的甲醇，诱导碱性果胶酶的表达。

选用碧云天SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒配制12％分离胶和5％浓缩胶，具体操作方法见产品说明书。样品与5×上样缓冲液以体积比4:1混合，沸水浴10min，冷却后上样。电泳时，80V恒压电压，待指示剂进入分离胶后，电压调至150V，待指示剂至胶底时结束电泳。用考马斯亮蓝染色液对凝胶进行染色，染色1h后脱色。

SDS-PAGE结果如图1所示，从图中可以看出，糖基化位点删除的各突变株所表达的PGL蛋白条带有不同程度的下移，说明糖基化程度有不同程度缓解，在相同点样量下重组菌GS115/N185Q、GS115/N185Q-N353Q及GS115/N128Q-N185Q-N353Q较GS115/K314Mopt分泌量有明显增加。

摇瓶发酵及酶热稳定性检测结果如图2所示，从图中可以看出重组菌GS115/N185Q、GS115/N185Q-N353Q及GS115/N128Q-N185Q-N353Q分别较GS115/K314Mopt胞外酶活提高87.9％，114.8％及101.4％，极大促进了PGL的表达水平。但突变菌株碱性果胶酶热稳定性有所降低，如图2所示，单点突变N128Q及N353Q残余酶活分别为47.6％及7.43％，较K314Mopt的59.2％有所下降，组合突变N128Q-N185Q、N128Q-N353Q及N128Q-N185Q-N353Q 55℃保温30min残余酶活分别为14.5％、3.6％及3.7％，稳定性下降更加明显。而N185Q 55℃保温30min残余酶活分别为57.9％相比于K314Mopt的59.2％变化不大。

实施例3：基因工程菌株3L罐发酵

从平板上挑取单菌落接种于YPD培养基中30℃，220rpm培养24h，以10％接种量接种于包含800mL分批发酵培养基(85％磷酸26.7mL/L，CaSO₄0.93g/L，K₂SO₄18.2g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油40.0g/L，PTM₁4.35mL/L)的3L发酵罐(美国NBS公司)中，初始搅拌转速为500-550r/min，通气量为1.5-2vvm，50％氨水及30％磷酸控制pH5.5，生长期培养温度为28-30℃，当甘油耗尽溶氧反弹时以指数流加方式补加50％(w/v含12mL/L PTM₁)甘油。流加速率按下式计算：(t)为流加速率(L/h)，X₀为细胞密度(g/L)，V₀为初始体积(L)，S_f代表补料液中甘油浓度(g/L)，Y_X/S对底物细胞得率(g/L)，μ_set为设定的比生长速率(h^-1)。其中μ_set为0.176h^-1，Y_X/S为0.435g/g，S_f为500g/L。

待甘油再次耗尽溶氧反弹时，饥饿培养1～2h，开始流加诱导培养基(100％甲醇含12mL/L PTM₁)，同时温度降低至22-28℃，搅拌转速升高至900r/min，诱导PGL表达。诱导培养基采用分阶段流加方式：0-8h流速2mL/h，8-90h流速9.6mL/h，＞90h流速2mL/h。

对工程菌GS115/K314Mopt及GS115/N185Q进行3L罐发酵，结果如图3所示，基因工程菌株GS115/N185Q28℃诱导时96h时酶活达到2411.57U/ml，较GS115/K314Mopt提高了213.81％，极大的提高了碱性果胶酶的表达水平。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。