CYP2C19基因多态性检测引物、探针及试剂盒的制作方法

本发明涉及基因多态性检测技术领域，具体涉及CYP2C19基因多态性检测引物、探针及试剂盒。

背景技术：

氯吡格雷英文名称Clopidogrel，药品名称波立维，化学式为C₁₆H₁₆C_lNO₂S。该药品为口服抗血小板药物，可用于防治心肌梗死、缺血性脑血栓、闭塞性脉管炎、动脉粥样硬化及血栓栓塞引起的并发症。罹患中风、心肌梗死或确诊为外周动脉疾病的患者，用药后可减少动脉粥样硬化的发生；经皮冠状动脉介入治疗后的病人，应用氯吡格雷可以降低血栓形成的风险。该药品经体内P450酶生物转化后可与血小板表面ADP受体P2Y12发生不可逆的结合，从而抑制ADP诱导的血小板的聚集，达到抗凝血的功效。

在临床工作中发现，并非所有患者都能在应用氯吡咯雷中获得预期效果，表现为心血管不良事件的发生，这个现象称为“氯吡咯雷抵抗”。另外，服用氯吡咯雷也存在出血的风险，严重出血事件的发生率为1.4％。氯吡格雷抵抗主要原因是CYP2C19基因突变致使氯吡格雷的活性代谢产物减少。2009年1月，哈佛大学JessicaL.M.等在《新英格兰医学杂志》上发表了最新临床研究结果，证实CYP2C19基因突变所导致的弱代谢个体，其栓塞重新形成的风险增加，心脑血管事件的发生风险增加，病死率升高。目前，公认的与氯吡咯雷代谢减弱相关的CYP2C19基因多态性主要包括CYP2C19*2和CYP2C19*3，与氯吡咯雷代谢增强相关的CYP2C19基因多态性则为CYP2C19*17。基于以上原因，氯吡格雷遭遇了美国食品药品监督管理局(FDA)的黑框警告，警告内容为“建议服用氯吡格雷的患者做CYP2C19基因检测”。

目前，针对CYP2C19基因多态性检测的方法有多种，主要包括DNA测序法、高分辨率溶解曲线法和液相芯片法。DNA测序法虽然是金标准，但步骤繁琐，耗时长。高分辨率溶解曲线法，快速，简便，经济实用，但对仪器的需求较高，绝大部分的实时荧光定量PCR仪无法适用。液相芯片法操作过程复杂，且容易污染，假阳性率高。因此需要建立一种快速操作方便，快速，特异性好、灵敏的基因检测方法。

技术实现要素：

为了克服现有检测技术的上述不足，本发明在Taqman探针法的基础上提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的CYP2C19基因CYP2C19*2(G681A)、CYP2C19*3(G836A)和CYP2C19*17(C-806T)多态性位点的引物和探针，本发明的另一目的是提供包括检测以上多态性位点的试剂盒，以及检测方法。

本发明提供的检测CYP2C19基因多态性的引物和探针，用于检测第681位点、第836位点以及第806位点基因多态性，其具体核苷酸序列如下：

(1)检测CYP2C19*2(G681A)基因多态性的引物和探针：

G681A位点突变型ARMS上游引物：

5’-CCCACTATCATTGATTATTTCACA-3’(SEQ ID NO.1)，

G681A位点野生型ARMS上游引物：

5’-TTCCCACTATCATTGATTATTGCCGG-3’(SEQ ID NO.2)，

G681A位点公用的下游引物：5’-CCATTTTGATCAGGAAGCAATC-3’(SEQ ID NO.3)，

G681A位点公用的探针：5’-CCTTGCTTTTATGG-3’(SEQ ID NO.4)；

(2)检测CYP2C19*3(G836A)基因多态性的引物和探针：

G836A位点突变型ARMS上游引物：

5’-GATTGTAAGCACCACCTGA-3’(SEQ ID NO.5)，

G836A位点野生型ARMS上游引物：

5’-GATTGTAAGCACCCACTGG-3’(SEQ ID NO.6)，

G836A位点公用的下游引物：5’-CTAGGCAAGACTGTAGTATTC-3’(SEQ ID NO.7)，

G836A位点公用的探针：5’-CCAGGTAAGGCCAAGT-3’(SEQ ID NO.8)；

(3)检测CYP2C19*17(C-806T)基因多态性的引物和探针：

C-806T位点突变型ARMS上游引物：

5’-GTGTCTTCTGTTCTCAACGT-3’(SEQ ID NO.9)，

C-806T位点野生型ARMS上游引物：

5’-GTGTCTTCTGTTCTCAAGGC-3’(SEQ ID NO.10)，

C-806T位点公用的下游引物：5’-CTCATAGCTGGCAGAACTGG-3’(SEQ ID NO.11)，

C-806T位点公用的探针：5’-CGCCACGATGGGCATC-3’(SEQ ID NO.12)；

所述探针均为MGB探针，探针核苷酸序列5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。

优选地，上述检测CYP2C19基因多态性的引物和探针，所述荧光你报告基团为FAM。

本发明还提供了一种CYP2C19基因多态性检测试剂盒，包括以上任一所述的检测CYP2C19基因多态性的引物和探针。

该试剂盒针对不同基因位点，分别采用上述设计的野生型和突变型ARMS引物和Taqman-MGB探针，结合荧光定量PCR反应，对从人外周血中提取的基因组DNA进行检测，一次性在一条6联PCR反应条上实现对CYP2C19*2(G681A)、CYP2C19*3(G836A)和CYP2C19*17(C-806T)基因多态性进行检测，通过实时荧光PCR仪上收集信号，计算野生型和突变型的△Ct值来确定样本DNA的基因型，准确度好，操作简单方便。

优选地，所述CYP2C19基因多态性检测试剂盒，还包括一组内控基因的检测引物和探针，具体核苷酸序列如下：

上游引物：5’-GGAAAGTGATATTTTGGAGAA-3’(SEQ ID NO.13)，

下游引物：5’-CCATTTTGATCAGGAAGCAA-3’(SEQ ID NO.14)，

内控探针：5’-CACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGAC-3’(SEQ ID NO.15)；

所述内控探针为Taqman探针，探针核苷酸序列的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团，且荧光报告基团不同于权利要求1所述的MGB探针。

优选地，上述CYP2C19基因多态性检测试剂盒，内控探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为JOE，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。

优选地，所述CYP2C19基因多态性检测试剂盒，还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括dNTPs、PCR缓冲液、Fast Advanced Master Mix、矿物油和超纯水。

优选地，所述CYP2C19基因多态性检测试剂盒，还包括非模板对照和阳性对照。

本发明还提供了上述CYP2C19基因多态性检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待检测样品中的DNA；

(2)用权利要求1所述的检测CYP2C19基因多态性的引物和探针，每个基因型的检测引物和探针对应一个反应体系，每个反应体系里均含有内控引物和探针，每个反应体系均使用提取的DNA作为模板，进行荧光定量PCR；同时设置非模板对照和阳性对照；

(3)检测结果分析：

在非模板对照FAM及JOE信号不起线，或Ct>28；阳性对照FAM及JOE信号Ct值≤25；待检测样本产生的JOE信号Ct值≤25的情况下，代表扩增正常，按照以下标准判断基因型：

其中，Ct₁为CYP2C19*2G基因型反应体系的FAM信号Ct值，Ct₂为CYP2C19*2A基因型反应体系的FAM信号Ct值，Ct₃为CYP2C19*3G基因型反应体系的FAM信号Ct值，Ct₄为CYP2C19*3A基因型反应体系的FAM信号Ct值，Ct₅为CYP2C19*17C基因型反应体系的FAM信号Ct值，Ct₆为CYP2C19*17T基因型反应体系的FAM信号Ct值。

本发明具有以下有益效果：

本发明经过大量试验、研究和分析成功研究出能够用于快速、灵敏、有效的检测CYP2C19基因多态性检测引物、探针和试剂盒。利用这个试剂盒可以检测出CYP2C19*2(G681A)、CYP2C19*3(G836A)和CYP2C19*17(C-806T)三个位点的基因多态性情况。

与现有技术相比，本发明运用ARMS引物区分野生型和突变型基因，有如下有益效果和显著进步：

(1)灵敏度高，可以准确检出低至1ng的基因组DNA。对于保存时间过长，提取浓度很低的样本能准确检出。

(2)特异性强，对于高至200ng及以上的基因组DNA不会出现非特异性的结果。

(3)成本低，ARMS分型法相对于Taqman探针分型法，不仅能保留Taqman的高灵敏度和高特异性，而且还能节约成本。

(4)操作简单，检测速度快，整个检测过程只需要120分钟。

(5)应用Fast Advanced Master Mix预混在反应体系中，减少了酶与样本混合的步骤，减少了样本的污染，避免了气溶胶污染引起的假阳性。

总之，本发明涉及的CYP2C19基因多态性检测试剂盒适用于临床多种样本类型选择，具有特异性强，灵敏度高，实验周期短，操作简单，成本低等显著优点。

附图说明

图1是实施例3中样本1第1、2孔扩增曲线(CYP2C19*2 G/A)；

图2是实施例3中样本1第3、4孔扩增曲线(CYP2C19*3 G/G)；

图3是实施例3中样本1第5、6孔扩增曲线(CYP2C19*17 C/C)；

图4是实施例3中样本2第1、2孔扩增曲线(CYP2C19*2 G/A)；

图5是实施例3中样本2第3、4孔扩增曲线(CYP2C19*3 G/A)；

图6是实施例3中样本2第5、6孔扩增曲线(CYP2C19*17 C/C)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：试剂盒组成

本发明所述的检测试剂盒组成如下表。

注：Fast Advanced Master Mix(简称AB premix)，购自美国应用生物系统公司；10×buffer(PCR缓冲液，含Mg²⁺等)购自宝生物工程(大连)有限公司。试剂盒中，内控探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为JOE，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。检测探针均为MGB探针，探针核苷酸序列5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团。

实施例2：样本基因组DNA的提取

本实施例中收集人体全血样本，从中提取基因组DNA。

从EDTA抗凝血中提取基因组DNA，并对其进行定量，作为PCR检测的模板。采用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒，按照说明进行，具体详述如下：

1、处理血液材料：

(1)当血液样品体积小于200μL时，可加缓冲液GS补足体积至200μL，再进行下一步实验(如血液样品体积为200μL，可直接进行下一步实验，不需加入GS)。

(2)当血液样品体积超过200μL时，需用细胞裂解液CL处理，具体步骤如下：在样品中加入1～2.5倍体积的细胞裂解液CL，颠倒混匀，10,000rpm(～11,500×g)离心1min，吸去上清，留下细胞核沉淀(如果裂解不彻底，可重复以上步骤一次)，向离心收集到的细胞核沉淀中加200μL缓冲液GS，振荡至彻底混匀。

2、加入20μL roteinase K溶液，混匀。

3、加200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮。

4、加200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

5、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

6、向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7、向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8、重复操作步骤7。

9、12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10、将吸附柱CB3转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。

11、定量

将提取的DNA用紫外分光光度计进行定量，稀释DNA浓度到1ng/μL。

实施例3：样本基因组DNA的检测

本实施例采用实施例1中所列举的引物、探针组合来扩增实施例2所提取的基因组DNA样品。

检测CYP2C19基因多态性的反应体系组成：

10×buffer(Mg²⁺Plus)：4～8μL，

dNTPs：50～250μM(each)，

各条引物：150～300nM，

各条探针：50～200nM，

FastAdvanced Master Mix：6～12μL，

模板：10μL，

总体积：40μL。

PCR反应条件设置：

检测方法如下：

1、每次PCR反应中，同时进行非模板对照(No Template Control；NTC)、阳性对照和待测样本的检测。

2、将阳性对照取出解冻后震荡混匀，并离心30sec。

3、将6联PCR反应条取出解冻后离心30sec，防止反应液在开盖时溅出。

4、将ddH₂O(NTC)、实施例1中提取的DNA样本、阳性对照分别加入6联PCR反应条，每孔10μL。

5、将以上6联PCR反应条盖好管盖于离心机上离心30sec，确保管壁上不沾有液滴。

6、将6联PCR反应条放于实时PCR仪器中，用预设的反应程序进行PCR扩增。

检测结果分析：

根据荧光定量PCR扩增仪Ct值分析检测结果：以非模板对照(NTC)和阳性对照(STD)FAM及JOE信号Ct值作为实验数据是否有效的判定标准(非模板对照FAM及JOE信号不起线，或Ct>28；阳性对照FAM及JOE信号Ct值≤25，体系性能良好，结果有效)；以待测样本JOE信号Ct值作为PCR反应是否成功的判定标准(JOE信号Ct值≤25，扩增正常)，以待测样本每组SNP位点检测孔FAM信号Ct值的差值作为判断标准。

注：Ct₁～Ct₆分别表示第1到第6孔的FAM信号Ct值。其中第1、2孔为一组，3、4孔为一组，5、6孔为一组；分别计算三组Ct值的差值。当ct值为Undetermined(无扩增曲线)时，该孔的Ct值记为∞。

附图1～3中，Ct₂-Ct₁＝-0.39，Ct₄-Ct₃＝∞,Ct₆-Ct₅＝∞。结果显示样本1为CYP2C19*2杂合型(G/A)，CYP2C19*3纯野生型(G/G),CYP2C19*17纯野生型(C/C)。

附图4～6中，Ct₂-Ct₁＝-0.44，Ct₄-Ct₃＝0.2,Ct₆-Ct₅＝17.81。结果显示样本2为CYP2C19*2杂合型(G/A)，CYP2C19*3杂合型(G/A)，CYP2C19*17纯野生型(C/C)。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉海吉力生物科技有限公司

<120> CYP2C19基因多态性检测引物、探针及试剂盒

<130> WH1610026-1

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

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<213> 人工序列

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cccactatca ttgattattt caca 24

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccattttgat caggaagcaa tc 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

caccaagaat cgatggacat caacaaccct cgggac 36