本发明属于生物技术领域，具体涉及一种结肠上皮间淋巴细胞(IEL)的分离方法。
背景技术：
肠上皮间淋巴细胞(intestineintraepitheliallymphocyteiIEL)是位于肠上皮细胞间基侧膜表面的一类淋巴细胞,在粘膜免疫防御、口服免疫耐受形成等方面起着十分重要的作用。目前，现有技术中的结肠上皮间淋巴细胞的分离方法，操作步骤比较繁琐，费时费力。
技术实现要素：
为了解决现有技术存在的不足，本发明提供一种结肠上皮间淋巴细胞的分离方法，该方法具有操作方便、省时省力的特点，适合推广应用。
其技术方案为：
一种结肠上皮间淋巴细胞的分离方法，包括以下步骤：
步骤1、安乐死老鼠，从回盲部到直肠位置，把整个大肠拉出再横切把肠放到一个小培养皿中，培养皿中有置于冰上，RPMI 1640含谷氨酰胺2mmol/L，把肠拉开放到平滑的工作台上，灯光要好，去掉脂肪和结缔组织，检查并切除淋巴集结，纵切开肠暴露整个粘膜表面回到4℃含新鲜RPMI 1640的新鲜培养皿中，轻轻用镊子搅动，洗掉粘液和残渣；
步骤2、把肠放入20ml IEL分离液isolation buffer，在水浴中预热至37℃，用150ml烧杯装，轻轻地搅成漩涡持续约15秒。倒出缓冲液，重复步骤2两次；
步骤3、洗好后，把肠切成4-5mm小段，放入60ml IEL isolation buffer中在IEL分离液isolation buffer中搅拌组织30min，温度37℃，在搅拌过程期间，准备玻璃棉过滤管：2个10cc-注射器，填充少量的疏松的玻璃棉在注射剂针芯内，把两个注射器叠加。把这2个注射器装到一个125ml组织培养瓶上，用含谷氨酰胺的15ml RPMI 1640洗，用过滤系统过滤肠提取物，用含谷氨酰胺的20ml RPMI 1640冲洗烧杯，洗液也过滤把IEL提取物分装到2个塑料50ml管中，每个大概装40ml，1600转/分离心5min，4℃，取所得沉淀染流式抗体。
本发明的有益效果：
本发明完全不需要不同浓度percoll液来分层分离上皮细胞与上皮间淋巴细胞。因为结肠细胞数量较少。通过流式细胞FSC和SSC即可划出上皮间淋巴细胞。这在分离过程中，至少节省了30分钟。IEL分离液配制，不用PBS，而用1640培养基，提高了细胞的活性。经过以上方法的尝试，可以顺利地从一只老鼠的结肠组织中分离出IEL，与以前的4-5只小鼠一组才可以分出很少的细胞作比较在一定程度上大大节约实验对象，同时也节约相当部分时间(约50分钟)，同时通过流式细胞术分析，所得数据显示，目前从约10动物的结肠组织分离出的IEL，通过流式显示成功率100％，与之前的5只小鼠同时分离10次约成功8次比较，效率和实验结果也得到保障。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细地说明。
实验材料
RPMI 1640培养基加谷氨酰胺2mmol/L
IEL分离液IEL isolation Buffer(1x1640 RPMI 500ml，EDTA 190mg，Dithiotheritol 80mg，37度搅拌一小时，充分溶解)与老方法比，不再需要PBS，而是使用1640培养基。
小鼠胃肠道手术器械一套
烧杯(100ml)*2 培养皿*2 注射器10ml*2 组织培养瓶上
50ml离心管*2
一种结肠上皮间淋巴细胞的分离方法，包括以下步骤：
步骤1、安乐死老鼠，从回盲部到直肠位置，把整个大肠拉出再横切把肠放到一个小培养皿中，培养皿中有置于冰上，RPMI 1640含谷氨酰胺2mmol/L，把肠拉开放到平滑的工作台上，灯光要好，去掉脂肪和结缔组织，检查并切除淋巴集结，纵切开肠暴露整个粘膜表面回到4℃含新鲜RPMI 1640的新鲜培养皿中，轻轻用镊子搅动，洗掉粘液和残渣；
步骤2、把肠放入20ml IEL分离液isolation buffer，在水浴中预热至37℃，用150ml烧杯装，轻轻地搅成漩涡持续约15秒。倒出缓冲液，重复步骤2两次；
步骤3、洗好后，把肠切成4-5mm小段，放入60ml IEL isolation buffer中在IEL分离液isolation buffer中搅拌组织30min，温度37℃，在搅拌过程期间，准备玻璃棉过滤管：2个10cc-注射器，填充少量的疏松的玻璃棉在注射剂针芯内，把两个注射器叠加。把这2个注射器装到一个125ml组织培养瓶上，用含谷氨酰胺的15ml RPMI 1640洗，用过滤系统过滤肠提取物，用含谷氨酰胺的20ml RPMI 1640冲洗烧杯，洗液也过滤把IEL提取物分装到2个塑料50ml管中，每个大概装40ml，1600转/分离心5min，4℃，取所得沉淀染流式抗体。
本发明分小肠上皮间淋巴细胞IEL时，在37度消化那一步会混入大量上皮细胞，所以需要40％Percoll通过离心去下层沉淀，将IEL与上皮细胞分离。而结肠，细胞数量较少，所以混入的上皮细胞就少。完全不需要Percol来分离两种细胞。直接离心得到混合沉淀后，上流式细胞检测即可。
该方法分离后的IEL，适用于做流式细胞检测或者流式分选。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。