本发明属于微生态制剂领域，具体涉及一种可用于生料固体发酵的保鲜菌粉及其制备工艺。
背景技术：
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随着畜牧业的快速发展，饲料安全问题已成为养猪生产者和消费者关注的焦点。全价生饲料固体发酵饲料作为绿色、环保型饲料已成为当今动物营养研究的热点。
全价生饲料经发酵后原料中的纤维素、碳水化合物、蛋白质等大分子物质降解成乳酸、氨基酸等小分子物质，易于公猪消化和吸收，提高了饲料的转化率。同时经发酵后的湿鲜饲料富含各种维生素、抗菌素、促生长素等，并富含益生菌群，复合酶系等既有益于促进猪的生长，又有益于公猪肠道微生态的平衡。
固体发酵全价生饲料具有广阔的市场前景，但经发酵后的湿鲜饲料由于水分含量大，营养丰富，其保质期较短，严重影响了湿鲜饲料的广泛使用。
本发明提供的植物乳杆菌KT-Lp9可高产乳酸、苯乳酸等天然抑制大肠杆菌、霉菌的物质，可保证发酵后的湿鲜饲料在长期贮存过程中具有较好的品质，为其在市场中广泛使用提供质量保证。
技术实现要素：
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为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于生料固体发酵的保鲜菌粉，该菌粉由植物乳杆菌制备，用于公猪全价生饲料固体发酵并能够在发酵和贮藏过程中杀灭大肠杆菌和霉菌、降低湿鲜料黄曲霉毒素B1的含量、提高湿鲜料保质期，且具有优异的耐酸、耐胆盐特性且能广谱的抑制致病菌。
所述植物乳杆菌具体为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KT-Lp9，该菌株已于2016年9月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号CGMCC No.12950；
所述菌粉，具体制备方法如下：
(1)植物乳杆菌的活化和培养：
将冷冻保存的植物乳杆菌KT-Lp9接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下静态培养18-22h，如此传代培养2-3次得到活化发酵液；
所述的MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min；
(2)菌粉制备：将上述发酵液离心后，添加菌种保护剂冻干成菌粉；
所述菌体与保护剂的混合质量比为1：2，使其含KT-Lp9活菌数在3.0×1011cfu/g以上。
所述的保护剂为：脱脂奶粉10％、乳糖8％、谷氨酸钠0.1％(m:v)，其余为水。
植物乳杆菌KT-Lp9菌粉在发酵饲料中的使用方法：
向饲料原料中加入自来水，使饲料含水量达到45％，以接种量为2×106cfu/g向生料中接种KT-Lp9菌粉稀释液，充分混匀后，准确称取50g于真空包装袋中，将包装袋压实排空空气，用封口机将包装袋封口，常温发酵5天。
发酵饲料品质检测：分别取样测定生料发酵起始、常温发酵5天、常温贮藏15天、30天、60天、90天、120天、150天、180天饲料样品酵母菌、霉菌及大肠杆菌等微生物指标。
有益效果：
本发明提供的植物乳杆菌KT-Lp9菌粉具有下述积极效果：
1、KT-Lp9具有广谱抑制致病菌的优良特性且菌株在pH2.5的人工模拟胃液中消化3h后继续在pH8.0的人工肠液中消化8h，其存活率高达81.57％；
2、本发明通过植物乳杆菌KT-Lp9菌粉在全价生饲料固体发酵过程中的动态变化，在发酵过程中快速降低pH，乳酸菌活菌数快速增加，对生料中的酵母菌、霉菌、尤其对大肠杆菌具有安全杀灭效果，同时能够降低生鲜料黄曲霉毒素的含量，更为重要的是经发酵后的湿鲜料在长期贮存过程中其品质能得到较好的保持。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步说明：下述实施例只是说明性的，并不限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施1：KT-Lp9抑菌特性及其耐酸、耐胆盐特性
将冷冻保存的植物乳杆菌KT-Lp9接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下静态培养18h，如此传代培养2次得到活化发酵液；
所述的MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min；
在pH2.5(用1mol/L HCl调整)灭菌PBS缓冲液中，加入3.5g/L胃蛋白酶，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟胃液；将活化好的菌株离心收集菌体，加入与培养基等量的pH2.5模拟胃液，37℃培养3h，于0h、3h用MRS琼脂培养基倾注法测定其活菌数。
在pH8.0(用0.1mol/L NaOH调整)灭菌PBS中，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛胆盐用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟肠液；将模拟胃液中处理3h后的菌液，离心洗菌两次收集菌体后，加入与之前模拟胃液等量的模拟肠液继续37℃培养，于4h、8h用MRS琼脂培养基倾注法测活菌数，试验结果见表1：存活率＝[N1/N0]×100％(N0－0h活菌数；N1－经模拟肠、胃液消化后的活菌数)
表1 KT-Lp9人工模拟胃液和肠液的存活率
用琼脂孔扩散法(Well-diffusion Agar Assay)测定植物乳杆菌KT-Lp9发酵液的抑菌效果：将灭菌后冷却至50℃左右的MRS琼脂培养基(20ml)与200μL肠道致病菌液(106cfu/ml)一起倒入平板混匀。待加有肠道致病菌的MRS琼脂培养基冷却凝固结实后，使用打孔器在平板上打出直径8mm左右的孔。每孔加入100μL植物乳杆菌KT-Lp9发酵液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小。抑菌圈直径大小使用游标卡尺进行测量(保留两位有效数字)，实验结果见表2：
表2 KT-Lp9发酵液中苯乳酸、4-羟基苯乳酸含量和抑菌特性
注：打孔器直径为8mm
由表1、表2试验结果可知，KT-Lp9具有广谱抑制致病菌的优良特性且菌株在pH2.5的人工模拟胃液中消化3h后继续在pH8.0的人工肠液中消化8h，其存活率高达81.57％。
实施2：植物乳杆菌KT-Lp9菌粉可加速全价生饲料固体发酵
植物乳杆菌菌粉的制备：
(1)植物乳杆菌的活化和培养：
将冷冻保存的植物乳杆菌KT-Lp9接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下静态培养22h，如此传代培养3次得到活化发酵液；
所述的MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min；
(2)菌粉制备：将上述发酵液离心后，添加菌种保护剂冻干成菌粉；
所述菌体与保护剂的混合质量比为1：2，使其含KT-Lp9活菌数在4.0×1011cfu/g。
所述的保护剂为：脱脂奶粉10％、乳糖8％、谷氨酸钠0.1％，其余为水。
生料固体发酵配方见表3(原料均为市售)，实验组向混合均匀的全价生饲料中加入自来水，使饲料含水量达到45％，以接种量为2×106cfu/g向饲料中接种KT-Lp9稀释后的菌粉，对照组加入等量的自来水，充分混匀后，分别准确称取50g实验组和对照组饲料原料于包装袋中，将包装袋压实尽量排空空气，用封口机将包装袋封口常温发酵5天，发酵结束后取样测定pH、酵母菌、霉菌、大肠杆菌及KT-Lp9活菌数；
表3 饲料组成(％)
从密封袋中分别准确称取25g发酵5天后的实验组和对照组样品于装有玻璃珠的1000mL灭菌三角瓶中，加入225g灭菌蒸馏水，置于摇床上200r/min摇动20min，取1mL移液枪吸取1mL样品加入到9mL盛有稀释液的无菌试管中，按上述倍比稀释方法稀释至一定倍数时，采用MRS琼脂培养基(加抗生素)，平板倾注，37℃厌氧培养48h后，对乳酸菌进行计数；分别选用选择性培养基对酵母菌、霉菌、大肠杆菌进行选择性计数(其中酵母菌和霉菌选择用孟加拉红培养基，30℃培养120h，大肠杆菌选择用结晶紫中性红胆盐琼脂培养24小时)。取适量上述发酵饲料10倍稀释液测定pH值。平行实验重复3次取平均值，结果见表4、表5。
表4 生料发酵添加植物乳杆菌前后乳酸菌和pH动态变化
注：同列肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
表5 生料发酵添加植物乳杆菌前后酵母菌、霉菌和大肠杆菌的活菌数
由表4实验结果可知，添加植物乳杆菌KT-Lp9的发酵饲料与对照组相比，发酵终点乳酸菌活菌数和pH与对照组相比均存在显著性差异(P<0.05)，说明添加KT-Lp9可加速全价生饲料的固体发酵。
由表5实验结果可知，酵母菌、霉菌在发酵前后实验组与对照组活菌数均显著降低(P＜0.05)，但发酵后实验组酵母菌和霉菌活菌数均显著低于对照组(P＜0.05)，说明植物乳杆菌KT-Lp9具有抑制生料发酵酵母菌和霉菌增长的效果；KT-Lp9对大肠杆菌具有杀灭效果，其在全价生饲料固体发酵过程中将具有广泛的应用前景。
实施3：KT-Lp9具有降解湿鲜料中黄曲霉毒素B1的作用
植物乳杆菌菌粉的制备：
(1)植物乳杆菌的活化和培养：
将冷冻保存的植物乳杆菌KT-Lp9接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下静态培养20h，如此传代培养3次得到活化发酵液；
所述的MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min；
(2)菌粉制备：将上述发酵液离心后，添加菌种保护剂冻干成菌粉；
所述菌体与保护剂的混合质量比为1：2，使其含KT-Lp9活菌数在5.0×1011cfu/g；
所述的保护剂为：脱脂奶粉10％、乳糖8％、谷氨酸钠0.1％，其余为水；
生料固体发酵配方见表3(原料均为市售)，实验组向混合均匀的全价生饲料中加入自来水，使饲料含水量达到45％，以接种量为2×106cfu/g向饲料中接种KT-Lp9稀释后的菌粉，对照组加入等量的自来水，充分混匀后，分别准确称取50g实验组和对照组饲料原料于包装袋中，将包装袋压实尽量排空空气，用封口机将包装袋封口常温发酵5天；
分别抽取发酵好的对照组与实验组湿鲜料样品，分别测定样品中黄曲霉毒素B1的含量，采用黄曲霉毒素B1(AFB1)ELISA快速检测试剂盒机型测定，结果见表6；
表6 湿鲜料中黄曲霉毒素B1的含量
由表6实验结果可知，实验组湿鲜料黄曲霉毒素B1显著低于对照组，说明KT-Lp9具有降低湿鲜料黄曲霉毒素的作用，从而提高湿鲜料的饲用安全性。
实施4：KT-Lp9可提高湿鲜料贮藏稳定性
植物乳杆菌菌粉的制备：
(1)植物乳杆菌的活化和培养：
将冷冻保存的植物乳杆菌KT-Lp9接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下静态培养20h，如此传代培养3次得到活化发酵液；
所述的MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min；
(2)菌粉制备：将上述发酵液离心后，添加菌种保护剂冻干成菌粉；
所述菌体与保护剂的混合质量比为1：2，使其含KT-Lp9活菌数在4.0×1011cfu/g；
所述的保护剂为：脱脂奶粉10％、乳糖8％、谷氨酸钠0.1％，其余为水。
生料固体发酵配方见表3(原料均为市售)，向混合均匀的全价生饲料中加入自来水，使饲料含水量达到45％，以接种量为2×106cfu/g向饲料中接种KT-Lp9稀释后的菌粉，充分混匀后，准确称取50g饲料原料于包装袋中，将包装袋压实尽量排空空气，用封口机将包装袋封口常温发酵5天；
将发酵好的湿鲜料常温贮藏6个月，分别于15天、30天、60天、90天、120天、150天、180天取样测定酵母菌、霉菌及大肠杆菌含量，结果见表7。
表7 湿鲜料贮藏过程中酵母菌、霉菌和大肠杆菌的活菌数
由表7实验结果可知，湿鲜料在贮藏过程中，植物乳杆菌KT-Lp9对酵母菌有一定的抑制效果，对霉菌和大肠杆菌具有显著的杀灭效果(P＜0.05)。
由上述实验结果，植物乳杆菌KT-Lp9即可加速全价生饲料固体发酵，同时又能保证发酵好的湿鲜料在长期贮存过程中保持较好的品质。这种优异的特性为其在市场中广泛应用提供可能。