一种高强度双网络抗菌生物水凝胶的制备方法与流程

本发明涉及生物医用水凝胶的合成领域，具体涉及一种高强度双网络抗菌生物水凝胶的制备方法。

背景技术：

水凝胶是一种能够吸收与存储大量水分的三维高分子材料，这种优异的性能归功于水凝胶具有亲水基团和交联的三维网络骨架结构。由于水凝胶具备良好的亲水性、渗透性和生物相容性，以及低摩擦系数性能(Jason W. Nichol , Sandeep T. Koshy, et, al. Cell-laden micro-engineered gelatin methacrylate hydrogels. Bio-materials 31,2010,5536-5544)，使得水凝胶广泛的应用在药物缓释、角膜接触镜、组织工程支架、生物免疫调节、体外诊断等领域。但是，良好的生物相容性导致易被细菌侵染，类生物组织的构造使得力学性能较差，限制了水凝胶的应用。所以，提高水凝胶的力学性能与抗菌性能，使水凝胶的功能多样化，具有重要的科研和应用价值。

金属离子与杂环化合物的螯合作用启发于对生物仿生学的应用(Stephan S，Antje R ,et al. Metal-Mediated Molecular Self-Healing in Histidine Rich Mussel Peptides. Bio-macromolecules 2014, 15, 1644−1652)，贝类生物利用丝足能够将自身牢固的结合在形貌复杂的海岸岩石上，并且抵御高强度与高频率的浪击。由于丝足中存在离子螯合作用，在被破坏后具有高度的自修复能力，能够使贝类在恶劣的海岸环境中生存下来，具有离子螯合作用构建物理交联网络的水凝胶力学性能良好。

在水凝胶中构筑不同结合性质的网络结构，是为了达到改善水凝胶力学性能的目的(Matthew S., Craig J. ,et al. Versatile tuning of supra-molecular hydrogels through metal complexation of oxidation-resistant catecholinspired ligands. Soft Matter, 2013, 9, 10314–10323)。目前在一级共价键化学网络的基础上构建二级物理网络结合作用的包括氢键、双硫键、π-π交互作用、离子交互作用和金属螯合交互作用等 (Marcel E, Stefan B, Jürgen V, et, al. Self-healing response in supra-molecular polymers based on reversible zinc histidine interactions. Polymer 69 ,2015, 274-282)。选用金属螯合交互作用，可以在水凝胶中引入特征基团与金属离子的同时，考虑引入基团与离子的功能性。使水凝胶在构建二级网络改善了力学性能的同时，通过引入的特定基团与离子，获取一些新的特征功能。锌离子与咪唑基是公认的具有抗菌功能的无机与有机材料（Dominic E, Li H ,et al. Mussel Inspired Histidine Based Transient Network Metal Coordination Hydrogels. Macromolecule 2013, 46, 1167−1174）。在明胶水凝胶的两步改性过程中引入了咪唑基与锌离子，制备出的双网络水凝胶力学性良好，生物性能优异，同时也具有了抗菌功能。能很好的解决现有技术面临的接枝组氨酸过程容易氧化的问题，现阶段的技术采用其他类型的离子仅仅使双网络水凝胶的力学性能得到增强，而引入锌离子改善双网络水凝胶力学性能的同时引入了抗菌功能。

制备物理螯合力与化学共价键共存的双网络生物水凝胶的方法，其核心思想在于，通过在明胶上引入咪唑基团，（Clemens N. Z. Schmitt, Yael Politi, et al. Role of Sacrificial Protein−Metal Bond Exchange in Mussel Byssal Thread Self-Healing. Bio-macromolecules 2015, 16, 2852−2861）使明胶水凝胶具备螯合金属离子构筑二级螯合力物理网络能力的基础。制备出的双网络水凝胶力学性良好，刚度、韧性得到了极大提高，对大肠杆菌（革兰氏阴性菌）与金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）的杀菌率均达到99.9%，同时又保留了基材水凝胶良好的生物相容性，在生物医用材料、组织工程等领域具有很好的应用前景。

技术实现要素：

为达到上述目的，本发明提供了一种高强度双网络抗菌生物水凝胶的制备方法。制备的高强度双网络抗菌生物水凝胶，提高了基材水凝胶的力学性能，赋予了基材水凝胶的高效抗菌性能，保留了基材水凝胶的生物活性。

本发明通过如下技术方案实现。

一种高强度双网络抗菌生物水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

（1）将改性的明胶与改性的组氨酸混合后，溶解在磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，得到预聚液，加入光引发剂，在紫外点光源下引发聚合，构建一级共价键化学网络，并引入活性位点，得到引入了咪唑基团的明胶水凝胶；

（2）采用二价金属离子盐溶液浸泡引入了咪唑基团的明胶水凝胶，浸泡过程中，二价金属离子螯合咪唑活性位点，构建二级物理网络；浸泡结束后，用无菌水洗涤，得到所述高强度双网络抗菌生物水凝胶。

进一步地，步骤（1）中，所述改性的明胶是采用甲基丙烯酸酐进行改性得到的甲基丙烯酸酐明胶，改性反应过程中，明胶和甲基丙烯酸酐的质量之比为5:2~4，反应的时间为2~4h，反应的温度为40~60℃；改性结束后，通过透析分离产物，透析的时间为6~10天，透析的温度为40~60℃。

进一步地，步骤（1）中，所述改性的组氨酸是采用丙烯酰氯进行改性得到的组氨酸，改性反应的全过程在氮气氛围中避光进行，反应溶剂为氢氧化钠碱性溶液；改性反应过程中，组氨酸与丙烯酰氯物质的量之比为5：4~6，反应的时间为30~60min，反应的温度为0~5℃；改性反应结束后，产物采用丙酮离心洗涤后收集，再低温负压干燥。

进一步地，步骤（1）中，所述改性的明胶与改性的组氨酸的质量比为1:0.5~1。

进一步地，步骤（1）中，所述光引发剂为Irgacure2959，用量为预聚液的0.3~0. 5w/v %。

进一步地，步骤（1）中，所述紫外点光源的参数设置为：光的强度6~8mW/cm²，光的波长360~480nm。

进一步地，步骤（1）中，所述紫外点光源与预聚液的垂直距离为8~12cm。

进一步地，步骤（1）中，所述聚合的时间为30~50s。

进一步地，步骤（2）中，所述二价金属离子盐包括二价金属离子的硫酸盐、氯盐或硝酸盐。

进一步地，步骤（2）中，所述二价金属离子包括锌离子。

进一步地，步骤（2）中，所述二价金属离子盐溶液中，二价金属离子的浓度为12~24mM。

进一步地，步骤（2）中，所述浸泡的时间为2~4h。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

（1）本发明得到的高强度双网络抗菌生物水凝胶的力学性良好，刚度、韧性得到了极大提高，达到甲基丙烯酸酐明胶水凝胶的4倍；

（2）本发明得到的高强度双网络抗菌生物水凝胶具有广谱抗菌功能，对以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌与以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌的杀菌率均达到99.9%；

（3）本发明得到的高强度双网络抗菌生物水凝胶保留了甲基丙烯酸酐明胶水凝胶良好的生物相容性，在生物医用材料、组织工程等领域具有很好的应用前景；

（4）本发明制备方法具有反应条件温和、可操作性强、技术流程可控等优点。

附图说明

图1是实施例1中制备的高强度双网络抗菌生物水凝胶的微观形貌的扫描电镜图；

图2是实施例2中制备的高强度双网络抗菌生物水凝胶与对照样的力学性能曲线图；

图3是实施例2中合成的高强度双网络抗菌生物水凝胶的抗菌性能测试结果柱状图；

图4是实施例3中制备的高强度双网络抗菌生物水凝胶对MC-3T3细胞的死活细胞荧光染色图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，实施方法并不仅限于此。

实施例1

（1）称取5g明胶到50ml磷酸盐缓冲溶液中，在40℃下搅拌溶解；取2ml甲基丙烯酸酐，缓慢滴加到上述溶液中，搅拌反应2h；将反应后的混合液倒入40℃的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌2min，终止反应；用透析袋分装上述液体，在40℃的去离子水中透析6天；将透析过的溶液用离心管分装后离心，收集上清液，在超低温冰箱冻存24h，再在冷冻干燥机中冻干，得到高纯度甲基丙烯酸酐明胶样品。

（2）称取3g 组氨酸溶解到7ml氢氧化钠溶液中，通入氮气并冰浴溶解；取1.5ml的丙烯酰氯，在氮气氛围与避光条件下，逐滴缓慢加入到上述溶液中；保持0℃反应30min后，将反应混合液避光加入到丙酮中，搅拌3min，得到沉积物；沉积物用丙酮离心洗涤4次，收集最后一次离心沉淀，在超低温冰箱冻存24h，再在冷冻干燥机中冻干，得到高纯度丙烯酰氯改性组氨酸样品。

（3）按质量比2：1称取冻干的甲基丙烯酸酐明胶样品与丙烯酰氯改性组氨酸样品，在恒温箱中溶解在含光引发剂的磷酸盐缓冲溶液中，得到预聚液，光引发剂用量为预聚液的0.3w/v%；用移液枪移取预聚液到48孔板内，在紫外点光源下进行聚合；紫外点光源的光强度为6mW/cm²，波长360nm；紫外点光源与预聚液的垂直距离为8cm，聚合时间30s，得到引入了咪唑活性位点的明胶水凝胶。

（4）制备锌离子浓度为12mM的氯化锌无菌溶液，用于浸泡48孔板内的光聚合产物，浸泡时间为2h，结束后用无菌水反复洗涤2次，得到所述高强度双网络抗菌生物水凝胶。

得到的高强度双网络抗菌生物水凝胶的微观形貌的扫描电镜图如图1所示，由图1可知，冻干后的双网络水凝胶孔洞均匀连续且没有析出物，锌离子良好的分散到水凝胶内部。

得到的高强度双网络抗菌生物水凝胶的力学性能明显改善，具有高效的杀菌性能，且具有优异的生物相容性。

实施例2

（1）称取5g明胶到50ml 磷酸盐缓冲溶液中，在50℃下搅拌溶解；取3ml甲基丙烯酸酐，缓慢滴加到上述溶液中，搅拌反应3h；将反应后的混合液倒入50℃的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌2min，终止反应；用透析袋分装上述液体，在50℃的去离子水中透析8天；将透析过的溶液用离心管分装后离心，收集上清液，在超低温冰箱冻存24h，再在冷冻干燥机中冻干，得到高纯度甲基丙烯酸酐明胶样品。

（2）称取3g组氨酸溶解到7ml氢氧化钠溶液中，通入氮气并冰浴溶解；取1.7ml的丙烯酰氯，在氮气氛围与避光条件下，逐滴缓慢加入到上述溶液中；保持2℃反应40min后，将反应混合液避光加入到丙酮中，搅拌3min，得到沉积物；沉积物用丙酮离心洗涤4次，收集最后一次离心沉淀，在超低温冰箱冻存24h，再在冷冻干燥机中冻干，得到高纯度丙烯酰氯改性组氨酸样品。

（3）按质量比1：1称取冻干的甲基丙烯酸酐明胶样品与丙烯酰氯改性组氨酸样品，在恒温箱中溶解在含光引发剂的磷酸缓冲液中，得到预聚液，光引发剂用量为预聚液的0.4w/v%；用移液枪移取预聚液到48孔板内，在紫外点光源下进行聚合；紫外点光源的光强度为7mW/cm²，波长400nm；紫外点光源与预聚液的垂直距离为9cm，聚合时间40s，得到引入了咪唑活性位点的明胶水凝胶。

（4）制备锌离子浓度为18mM的氯化锌无菌溶液，用于浸泡48孔板内的光聚合产物，浸泡时间为3h，结束后用无菌水反复洗涤2次，得到所述高强度双网络抗菌生物水凝胶。

得到的高强度双网络抗菌生物水凝胶的微观形貌扫描电镜图参见图1，双网络水凝胶孔洞均匀连续，锌离子在水凝胶内部的分散良好；且得到的高强度双网络抗菌生物水凝胶具有优异的生物相容性。

得到的高强度双网络抗菌生物水凝胶的力学性能测试结果如图2所示，由图2可知，形成双网络后的水凝胶最大形变量处断裂应力达到59KPa，比甲基丙烯酸酐明胶水凝胶的最大形变量处断裂应力14KPa高出4倍，体现出明显的力学性能改善。

将得到的高强度双网络抗菌生物水凝胶、咪唑/甲基丙烯酸酐明胶水凝胶、甲基丙烯酸酐明胶水凝胶与大肠杆菌（革兰氏阴性细菌）、金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性细菌）分别共同培养24h，得到的抗菌性能测试结果如图3所示，由图3可知，高强度双网络抗菌生物水凝胶对大肠杆菌（革兰氏阴性细菌）与金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性细菌）的抗菌率均达到99.9%，相比没有抗菌作用的明胶水凝胶，体现出高效的抗菌性能。

实施例3

（1）称取5g明胶到50ml 磷酸盐缓冲溶液中，在60℃下搅拌溶解；取4ml甲基丙烯酸酐，缓慢滴加到上述溶液中，搅拌反应4h；将反应后的混合液倒入60℃的磷酸盐缓冲溶液，搅拌2min，终止反应；用透析袋分装上述液体，在60℃的去离子水中透析10天；将透析过的溶液用离心管分装后离心，收集上清液，在超低温冰箱冻存24h，再在冷冻干燥机中冻干，得到高纯度甲基丙烯酸酐明胶样品。

（2）称取3g 组氨酸溶解到7ml氢氧化钠溶液中，通入氮气并冰浴溶解；取1.8ml的丙烯酰氯，在氮气氛围与避光条件下，逐滴缓慢加入到上述溶液中；保持0℃反应60min后，将混合液避光加入到丙酮中，搅拌3min，得到沉积物；沉积物用丙酮离心洗涤4次，收集最后一次离心沉淀，在超低温冰箱冻存24h，再在冷冻干燥机中冻干，得到高纯度丙烯酰氯改性组氨酸样品。

（3）按质量比1：0.8称取冻干的甲基丙烯酸酐明胶样品与丙烯酰氯改性组氨酸样品，在恒温箱中溶解在含光引发剂的磷酸缓冲液中，得到预聚液，光引发剂的用量为预聚体的0.5w/v%；用移液枪移取预聚液到48孔板内，在紫外点光源下进行聚合；紫外点光源的强度为8mW/cm²，波长480nm；紫外点光源与预聚物垂直距离为12cm，聚合时间50s，得到引入了咪唑活性位点的明胶水凝胶。

（4）制备锌离子浓度为24mM的硝酸锌无菌溶液，用于浸泡48孔板内的光聚合产物，浸泡时间为4h，结束后用无菌水反复洗涤2次，得到所述高强度双网络抗菌生物水凝胶。

得到的高强度双网络抗菌生物水凝胶的微观形貌扫描电镜图参见图1，双网络水凝胶孔洞均匀连续，锌离子在水凝胶内部的分散良好；且得到的高强度双网络抗菌生物水凝胶的力学性能明显改善，具有高效的杀菌性能。

分析得到的高强度双网络抗菌生物水凝胶的生物相容性，得到的高强度双网络抗菌生物水凝胶对MC-3T3细胞的死活细胞荧光染色图如图4所示，由图4可知，细胞在合成的双网络水凝胶表面生长状态良好，双网络水凝胶保留了原有的优异生物相容性。