程序性死亡受体1基因抑制剂及其制备方法与应用与流程

本发明涉及药物领域，具体涉及一种程序性死亡受体1的表达抑制剂。

背景技术：

PD-1(程序性死亡受体1)是免疫检查点蛋白，是I型跨膜蛋白，由PDCD1基因编码的268个氨基酸组成，是CD28/CTLA4家族中重要成员。PD-1的主要功能是在免疫反应发生时抑制T细胞的活性。其蛋白质结构分三个部分：细胞外的免疫球蛋白可变区、跨膜结构域以及细胞内结构域；胞内结构域中ITSM(immunorecptor tyrosine-based switch motif)和ITIM(immunorecptor tyrosine-based inhibitory motif)两个基序，其中含有磷酸化位点，其中ITSM基序和PD-1的抑制功能相关。当T细胞表面的PD-1分子与抗原提呈细胞表面的受体PDL-1/PDL-2结合后，ITSM被磷酸化，然后磷酸酯酶SHP-1和SHP-2与ITSM结合，直接导致TCR复合物下游的信号分子去磷酸化，从而抑制T细胞的激活。在肿瘤微环境中，肿瘤细胞表面会表达大量的PDL-1/PDL-2分子，当T细胞浸润进入肿瘤组织中时，T细胞表面的PD-1分子能够识别PDL-1/PDL-2，T细胞则不能被肿瘤抗原激活，无法发挥杀伤肿瘤细胞的功能。

PDCD1基因启动子区转录调控原件的基础研究为本专利的设计提供了靶点依据。1997年Finger等人研究了人类PDCD1基因的结构，在启动子区域预测了很多顺式作用元件如Sp1、PU.1box、AP-2、E-box MYC site等。2008年Oestreich等人在小鼠EL4细胞系和小鼠原初CD8⁺T细胞模型中发现PDCD1基因启动子区域有两个组织特异性的调控位点：CR-B(Conserved Region-B)和CR-C(Conserved Region-C)；而位于CR-C区域内的N1NFAT cis-element位点是PDCD1转录所必需的调控元件。同年Cho等人发现在小鼠巨噬细胞系RAW264.7中IFN-α应答元件ISRE(IFN-Sensitive Response Element)参与了IFN-α响应的PDCD1表达；随后在2011年Terawaki等人在T细胞中也得到了相似的结果，并且用IFN-α处理，联合PD-1的阻断去治疗荷瘤小鼠，有效的增强了IFN-α抗肿瘤活性。c-Fos是AP1蛋白的一个亚基，T细胞中该蛋白的异常表达能够促进肿瘤的生长。Xiao等人发现c-Fos能够和PDCD1启动子区CR-B区域的AP1结合位点结合，从而激活PDCD1基因在T细胞中的表达。异常表达PD-1的T细胞与肿瘤细胞表面的PDL1/PDL2受体结合，大大降低了对肿瘤细胞的识别和杀伤能力，从而促进了肿瘤的生长。Xiao等人通过AP1结合位点的敲除小鼠阐明了该机制。PDCD1基因的表达不仅受启动子区域里的一系列顺式作用元件调控，其启动子上游远端约10-50kb范围内也存在一些元件由STAT3、STAT4、NFATc1和CTCF等转录因子调控。

PD1单克隆抗体是通过抗体-抗原结合的原理来阻断PD1蛋白与其受体PDL1/PDL2的结合，从而阻断T细胞免疫激活的抑制。目前已经有很多单抗药物成功上市。

抗体药物生产工艺复杂，产量低，不利于大规模生产；抗体药物属于蛋白质稳定性差，保存条件高，不利于运输和保存。

技术实现要素：

本发明的目的为提供多种化合物，其通过吡咯咪唑聚酰胺分子从基因转录水平阻断PDCD1基因的表达，从而实现PD1的抑制效果。

本专利中使用的多肽小分子是吡咯-咪唑聚酰胺多肽(PIPs)，具有很强的DNA序列识别特异性。它是由N-甲基吡咯(N-methylpyrrole，Im)和N-甲基咪唑(N-methylimidazole，Py)组成。Im/Py配对能够识别G:C碱基对；Py/Py配对能够识别A:T和T:A碱基对；Hp(hydroxypyrrole)/Py配对能够识别T:A碱基对；N末端的Ct(3-chlorothiophene)/Py配对更易于结合T:A碱基对。按照这种结合的规律PIPs分子能够识别特定的DNA序列并的结合在双螺旋结构的小沟中。本专利依据PDCD1基因启动子区域的顺式作用元件DNA序列设计并合成吡咯-咪唑聚酰胺多肽分子。多肽分子与转录因子竞争性结合这些顺式作用元件，阻断PDCD1基因的转录激活，从基因转录水平抑制PD1的表达。

本发明公开了一种用于抑制程序性死亡受体1基因转录的吡咯-咪唑聚酰胺多肽分子。该分子的序列为：1.PyPyPyIm-γ-PyPyImIm；2.PyPyImIm-γ-PyPyImIm。Im为甲基咪唑，Py为甲基吡咯，γ代表γ-氨基丁酸。1A、1B、1C、2A、2B、2C和2D为分别在1和2上的不同修饰。

本发明一个方面提供了一种抑制程序性死亡受体1表达的化合物及其药学上可接受的盐，其具有式I所示结构

其中，A选自C或N；

R₁选自H、CH₃、(CH₂)₃-N(CH₃)₂、(CH₂)₂-N(CH₃)₂、CH₂-N(CH₃)₂、(CH₂)₃-N(CH₃)CH₂CH₂NHR₃；

R₂选自H、CH₃、

R₃选自H、CH₃、

在本发明的一个技术方案中提供了一种抑制程序性死亡受体1表达的化合物及其药学上可接受的盐，其具有式I所示结构

其中，A为C；

R₁选自H、CH₃、(CH₂)₃-N(CH₃)₂、(CH₂)₂-N(CH₃)₂、CH₂-N(CH₃)₂；且R₂选自或者

R₁选自(CH₂)₃-N(CH₃)CH₂CH₂NHR₃；且R₂选自H、CH₃；R₃选自H、CH₃、

在本发明的技术方案中提供了一种抑制程序性死亡受体1表达的化合物及其药学上可接受的盐，其具有式I所示结构

其中，A为N；

R₁选自H、CH₃、(CH₂)₃-N(CH₃)₂、(CH₂)₂-N(CH₃)₂、CH₂-N(CH₃)₂；且R₂选自或者

R₁选自(CH₂)₃-N(CH₃)CH₂CH₂NHR₃；且R₂选自H、CH₃；R₃选自H、CH₃、

在一个具体实施方案中，式I结构选自1A、1B、1C、2A、2B、2C或2D中的一种。

本发明另一个方面提供了上述化合物及其药学上可接受的盐在制备抑制在细胞表面表达PD-1的药物中的用途。

本发明另一个方面提供了一种体外调节PD1基因在细胞中的表达的方法，所述方法包括以本发明的化合物或其药学上可接受的盐施用于待处理细胞的步骤。

本发明另一个方面提供了用于制备治疗PD-1基因表达或调控异常的疾病的药物中的用途，优选地，所述PD-1基因表达或调控异常的疾病选自癌症、病毒感染或自身免疫性疾病。

癌症选自器官或体组织中存在细胞无限增殖的疾病。优选为卵巢癌、白血病、肺癌、结直肠癌/结肠癌、CNS癌、黑素瘤、肾细胞癌、浆细胞瘤/骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌等。

自身免疫性疾病选自受试者对其自身组织产生破坏性免疫反应的疾病。优选为桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、全身性红斑狼疮、干燥综合征(Sjogren′s syndrome)、格雷夫斯病(Graves′disease)、硬皮病、类风湿性关节炎、多发性硬化、重症肌无力和糖尿病。

本发明再一个方面提供了一种药物组合物，包括治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐。

本发明再一个方面提供了前述化合物的制备方法，其包括如下步骤：

1)在固相树脂上依次偶联2个4-氨基-1-甲基-2-羧基-吡咯和2个4-氨基-1-甲基-2-羧基-咪唑；或者

1)在固相树脂上依次偶联3个4-氨基-1-甲基-2-羧基-吡咯和1个4-氨基-1-甲基-2-羧基-咪唑；

2)在步骤1)所得中间体的咪唑基4位氨基上偶联2，4-二氨基丁酸的羧基；

3)在步骤2)所得中间体的2，4-二氨基丁酸的4位氨基上依次偶联2个4-氨基-1-甲基-2-羧基-吡咯、1个4-氨基-1-甲基-2-羧基-咪唑和一个1-甲基-2-羧基-咪唑；

4)裂解树脂，并在步骤3)所得中间体上进行修饰间苯二甲酸、赫斯特酸衍生物Ht-1、赫斯特酸衍生物Ht-2或叶酸FA，获得终产品；或

4)在步骤3)所得中间体上进行修饰间苯二甲酸、赫斯特酸衍生物Ht-1、赫斯特酸衍生物Ht-2或叶酸FA，并裂解树脂，获得终产品。

其中步骤1)为：

脱除固相树脂苯肼上的保护基，偶联2个4-氨基-1-甲基-2-羧基-吡咯，以及2个4-氨基-1-甲基-2-羧基-咪唑，或

脱除固相树脂苯肼上的保护基，偶联3个4-氨基-1-甲基-2-羧基-吡咯，以及1个4-氨基-1-甲基-2-羧基-咪唑；

优选地，步骤1)或3)中偶联4-氨基-1-甲基-2-羧基-吡咯的步骤为：

活化4-叔丁氧羰基氨基-1-甲基-1H-吡咯-2-羧酸上的羧基，并与脱除保护基的苯胺固相合成树脂或中间体上的氨基进行偶联；脱除叔丁氧羰基的氨基保护基；

更优选地，步骤1)或3)中偶联4-氨基-1-甲基-2-羧基-吡咯的步骤为：

4-叔丁氧羰基氨基-1-甲基-1H-吡咯-2-羧酸与三光气共同溶解于有机溶剂中，滴加三甲基吡啶，反应完全后，加入碱剂后与脱除保护基中间体上的氨基进行偶联混合，并在惰性气氛下至反应完全；TFA/苯酚/H₂O(v:v:v＝92:5:2.5)混合溶液脱除叔丁氧羰基保护基。

步骤1)或3)中偶联4-氨基-1-甲基-2-羧基-咪唑的步骤为：

活化4-叔丁氧羰基氨基-1-甲基-1H-咪唑-2-羧酸上的羧基，并与脱除保护基的苯胺固相合成树脂或中间体上的氨基进行偶联；脱除叔丁氧羰基的氨基保护基；

更优选地，步骤1)或3)中偶联4-氨基-1-甲基-2-羧基-咪唑的步骤为：

4-叔丁氧羰基氨基-1-甲基-1H-吡咯-2-羧酸与三光气共同溶解于有机溶剂中，滴加三甲基吡啶，反应完全后，加入碱剂后与脱除保护基的苯胺固相合成树脂或中间体上的氨基进行偶联混合，并在惰性气氛下至反应完全；TFA/苯酚/H₂O(v:v:v＝92:5:2.5)混合溶液脱除叔丁氧羰基保护基。

在本发明的技术方案中，步骤2)为活化R-2-(9-芴甲氧羰基氨基)-4-叔丁氧羰基氨基丁酸，并于步骤1)所得中间体上的氨基偶联；脱除叔丁氧羰基保护基；

优选地，步骤2)为将R-2-(9-芴甲氧羰基氨基)-4-叔丁氧羰基氨基丁酸和三光气共同溶解于有机溶剂中，滴加三甲基吡啶，反应完全后，加入碱剂和缩合剂至反应完全，并与脱除保护基中间体上的氨基进行偶联混合，并在惰性气氛下至反应完全；TFA/苯酚/H₂O(v:v:v＝92:5:2.5)混合溶液脱除叔丁氧羰基保护基。

在本发明的技术方案中，步骤3)中偶联1-甲基-2-羧基-咪唑的步骤为：

活化1-甲基-1H-咪唑-2-羧酸上的羧基，并与脱除保护基的前步所得中间体上的氨基进行偶联；随后脱除Fmoc保护基。

优选为，将1-甲基-1H-咪唑-2-羧酸和缩合剂溶于有机溶剂中，加入碱剂反应至完全，加入前步所得中间体中，在惰性气氛下缩合反应至完全；以20％哌啶/DMF条件脱除Fmoc保护基。

本发明中所用的缩合剂选自HATU、HOBt、HCTU、DCC、DIC、EDC、HBTU、HOAt、PyBOP、PyAOP、BOP-Cl、SOCl2、草酰氯中的一种或多种组合。

本发明所述的碱剂指能够提供碱性环境的化合物，选自DIEA、三甲基吡啶、三乙胺中的一种或多种

在本发明的技术方案中，步骤4)为以叔丁氧羰基保护步骤3)步产物中丁酸2位氨基；然后加入N,N-双(3-氨丙基)甲胺，反应至完全后纯化；所得产物加入化合物A、缩合剂和碱剂反应至完全后纯化，得到最终产物；所述化合物A选自间苯二甲酸、叶酸、赫斯特酸衍生物Ht-2或赫斯特酸衍生物Ht-1。

在本发明的技术方案中，步骤4)为将化合物A与缩合剂和碱剂进行活化，然后与步骤3)所得产物反应至完全，并与二甲氨基丙胺及Cu(OAc)₂反应至完全，纯化得到最终产物；所述化合物A选自间苯二甲酸、叶酸、赫斯特酸衍生物Ht-2或赫斯特酸衍生物Ht-1。

有益效果

本发明公开的聚酰胺分子属于多肽类小分子，能够实现化学合成，有利于大规模生产，为PD1功能的抑制提供更多的方法。

附图说明

图1为式1A化合物的HRMS谱图。

图2为式1B化合物的HRMS谱图

图3为式1C化合物的HRMS谱图。

图4为式2A化合物的HRMS谱图。

图5为式2B化合物的HRMS谱图

图6为式2C化合物的HRMS谱图。

图7为式2D化合物的HRMS谱图。

图8为Ht-2的HNMR谱图。

图9为本发明化合物抑制程序性死亡受体1基因表达实验结果图。

具体实施方式

实施例1 化合物1A的制备方法

(a)树脂溶胀：于一个10mL的固相反应器中加入400mg Fmoc保护的苯肼树脂(0.66mmol/g，0.264mmol)及3mL CH₂Cl₂，将树脂溶胀30min，抽除CH₂Cl₂，备用；

(b)脱除Fmoc保护基：将3mL20％哌啶/DMF溶液加入步骤(a)溶胀后的树脂中，N₂鼓泡混匀，10min后，抽除溶剂，再加入3mL 20％哌啶/DMF溶液，N₂鼓泡混匀，10min后，用DMF(4×3mL)洗涤树脂，再用3mL无水DMF洗涤树脂，备用；

(c)氨基酸缩合：将4-叔丁氧羰基氨基-1-甲基-1H-吡咯-2-羧酸(254mg，1.056mmol)和三光气(BTC，128mg，0.433mmol)溶于2mL无水THF，向该溶液中缓慢滴加三甲基吡啶(collidine，488μL，3.696mmol)，反应立即产生大量白色沉淀，加完反应3min，再加入2mLDIEA/DMF溶液(5％,v/v)，白色沉淀完全消失，将该反应液转移到步骤(b)脱除保护基的苯肼树脂中，N₂鼓泡混匀，缩合反应0.5～1h，抽除反应液，用DMF(4×3mL)洗涤树脂，备用；

(d)脱除叔丁氧羰基保护基：用CH₂Cl₂(2×3mL)洗涤，抽除CH₂Cl₂，加入3.0mLTFA/苯酚/H₂O(v:v:v＝92:5:2.5)混合溶液脱除步骤(b)所得缩合产物上的叔丁氧羰基保护基，2min后抽除溶剂，再次加入3.0mLTFA/苯酚/H₂O(v:v:v＝92:5:2.5)混合溶液反应20min，用CH₂Cl₂(2×3mL)及DMF(4×3mL)洗涤树脂，再用3mL无水DMF洗涤树脂，备用；

重复上述缩合及脱保护步骤(c)和(d)，直至完成式(1)所示的负载在苯肼树脂上的肽的合成；

(e)氨基酸缩合：将4-叔丁氧羰基氨基-1-甲基-1H-咪唑-2-羧酸(254mg，1.056mmol)和三光气(BTC，128mg，0.433mmol)溶于2mL无水THF，向该溶液中缓慢滴加三甲基吡啶(collidine，488μL，3.696mmol)，反应立即产生大量白色沉淀，加完反应3min，再加入2mLDIEA/DMF溶液(5％,v/v)，白色沉淀完全消失，将该反应液转移到步骤(b)脱除保护基的苯肼树脂中，N₂鼓泡混匀，缩合反应0.5～1h，抽除反应液，用DMF(4×3mL)洗涤树脂，得到式(2)所示负载在苯肼树脂上的肽；

(g)γ-氨基酸的缩合：将R-2-(9-芴甲氧羰基氨基)-4-叔丁氧羰基氨基丁酸(465mg，1.056mmol)和三光气(128mg，0.433mmol)溶于2mL无水THF，向该溶液中缓慢滴加三甲基吡啶(488μL，3.696mmol)，反应立即产生大量白色沉淀，加完反应1min，加入HOAt(144mg，1.056mmol)，再加入2mLDIEA/DMF溶液(5％,v/v)，反应5min，白色沉淀完全消失，将该反应液转移到式(1)所示的负载在苯肼树脂上的直链肽(NH₂-Im-Im-Py-Py-苯肼树脂)中，N₂鼓泡混匀，缩合反应0.5～1h，抽除反应液，用DMF(4×3mL)洗涤树脂，得到式(3)所示的负载在苯肼树脂上的肽；

(h)重复脱保护及缩合护步骤(d)和(c)，其中，直至完成得到式(4)所示的负载在苯肼树脂上的肽的合成；

(i)重复脱保护及缩合护步骤(d)和(e)，其中，直至完成得到式(5)所示的负载在苯肼树脂上的肽的合成；

(j)末端氨基酸的缩合：将1-甲基-1H-咪唑-2-羧酸(132mg，1.056mmol)和PyBOP(550mg，1.056mmol)溶于3mL无水DMF，加入DIEA(350μL，2.112mmol)，反应5min，将该反应液转移到步骤(h)所得的式(4)所示的负载在苯肼树脂上的肽中，N₂鼓泡混匀，缩合反应2h，抽除反应液，用DMF(4×3mL)洗涤树脂，并采用步骤(b)方法脱除式(5)所示的负载在苯肼树脂上的肽中的Fmoc保护基，得式(6)所示的负载在苯肼树脂上的肽；

(k)将Boc₂O(243μL，1.056mmol)溶于3mL无水DMF，加入DIEA(350μL，2.112mmol)，将该反应液转移到脱除Fmoc的式(6)所示的负载在苯肼树脂上的肽中，N₂鼓泡混匀，缩合反应20min。抽除反应液，用DMF(4×3mL)洗涤树脂，得到Boc保护的式(7)所示的负载在苯肼树脂上的肽；

将以上所得树脂取出，加入1mL DMF、200μL N,N-双(3-氨丙基)甲胺，90℃振摇反应1h，冷至室温，将树脂滤除，并用20mL CH₂Cl₂洗涤树脂；将有机相浓缩，残留物用半制备型HPLC纯化：10％乙腈-H₂O(含1％的TFA)等梯度洗脱5min，10％至100％的乙腈-H₂O(含1％的TFA)梯度洗脱25min，保留时间T_R＝16min，收集产物，冷冻干燥，得到淡黄色固体，备用；

取上述固体4mg(3μmol)溶于0.5mL无水DMF，加入间苯二甲酸IPA(0.99mg，6μmol)、PyBOP(3.1mg，6μmol)和DIEA(5μL，30μmol)，室温振摇反应2h，用半制备型HPLC纯化：10％乙腈-H₂O(含1％的TFA)等梯度洗脱5min，10％至100％的乙腈-H₂O(含1％的TFA)梯度洗脱25min，保留时间T_R＝18min，收集产物，冷冻干燥得固体；将该固体溶于1mL CH₂Cl₂，冰浴下加入1mL TFA，0℃反应1h，加入20mL冷的乙醚，离心收集沉淀，用半制备型HPLC纯化：10％乙腈-H₂O(含1％的TFA)等梯度洗脱5min，10％至100％的乙腈-H₂O(含1％的TFA)梯度洗脱25min，保留时间T_R＝15min，收集产物，冷冻干燥，得到淡黄色固体产物化合物1A，

其HRMS如图1所示。

HRMS(ESI)m/z:[M+H]⁺1358.6041。

实施例2 化合物1B的制备方法

按实施例1同样的步骤制得式(7)所示的负载在苯肼树脂上的肽，

将以上所得树脂取出，加入1mL DMF、200μL N,N-双(3-氨丙基)甲胺，90℃振摇反应1h，冷至室温，将树脂滤除，并用20mL CH₂Cl₂洗涤树脂；将有机相浓缩，残留物用半制备型HPLC纯化：10％乙腈-H₂O(含1％的TFA)等梯度洗脱5min，10％至100％的乙腈-H₂O(含1％的TFA)梯度洗脱25min，保留时间T_R＝16min，收集产物，冷冻干燥，得到淡黄色固体，备用；

取上述固体4mg(3μmol)溶于0.5mL无水DMF，加入赫斯特酸衍生物Ht-2(2.7mg，6μmol)、PyBOP(3.1mg，6μmol)和DIEA(5μL，30μmol)，室温振摇反应2h，用半制备型HPLC纯化：10％乙腈-H₂O(含1％的TFA)等梯度洗脱5min，10％至100％的乙腈-H₂O(含1％的TFA)梯度洗脱25min，保留时间T_R＝18min，收集产物，冷冻干燥得固体；将该固体溶于1mL CH₂Cl₂，冰浴下加入1mL TFA，0℃反应1h，加入20mL冷的乙醚，离心收集沉淀，用半制备型HPLC纯化：10％乙腈-H₂O(含1％的TFA)等梯度洗脱5min，10％至100％的乙腈-H₂O(含1％的TFA)梯度洗脱25min，保留时间T_R＝17min，收集产物，冷冻干燥，得到淡黄色固体产物化合物1B，

其HRMS如图2所示。

HRMS(ESI)m/z：[M+H]⁺：1644.7748

其中，赫斯特酸衍生物Ht-2的结构及合成路线如下：

将Ht-2-B(11.4g,44.2mmol)与4-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)苯-1,2-二胺(Ht-2-A，10g,31.0mmol，制备方法参见Inorg.Chem.1998,37,6018-6022)溶于乙酸(100mL)中，油浴加热回流反应4小时。减压蒸除乙酸，冷却至室温，柱层析纯化，得到草绿色固体。将所得产物溶于甲醇(100ml)，磁力搅拌，氮气保护，冰水浴冷却，缓慢滴加3.1g氢氧化钠的50ml水溶液，滴毕，室温反应8h，TLC检测反应完全，蒸除甲醇，稀盐酸调pH酸性，析出固体，过滤，干燥，得黄绿色固体Ht-2，其HNMR分别如图8所示。

HNMR(DMSO-d₆，400MHz)：2.44(s,3H),2.79(s,2H),3.23(s,2H),6.96(m,1H),7.05(br s,1H),7.47(m,1H),7.69-7.73(m,2H),8.08(m,1H),8.33-8.49(m,2H),8.83(s,1H)，12.73(br s,1H),13.41(br s,1H)。

实施例3 化合物1C的制备方法

按实施例1同样的步骤制得式(7)所示的负载在苯肼树脂上的肽，

将以上所得树脂取出，加入1mL DMF、200μL N,N-双(3-氨丙基)甲胺，90℃振摇反应1h，冷至室温，将树脂滤除，并用20mL CH₂Cl₂洗涤树脂；将有机相浓缩，残留物用半制备型HPLC纯化：10％乙腈-H₂O(含1％的TFA)等梯度洗脱5min，10％至100％的乙腈-H₂O(含1％的TFA)梯度洗脱25min，保留时间T_R＝16min，收集产物，冷冻干燥，得到淡黄色固体，备用；

取上述固体4mg(3μmol)溶于0.5mL无水DMF，加入叶酸FA(1.8mg，6μmol)、PyBOP(3.1mg，6μmol)和DIEA(5μL，30μmol)，室温振摇反应2h，用半制备型HPLC纯化：10％乙腈-H₂O(含1％的TFA)等梯度洗脱5min，10％至100％的乙腈-H₂O(含1％的TFA)梯度洗脱25min，保留时间T_R＝18min，收集产物，冷冻干燥得固体；将该固体溶于1mL CH₂Cl₂，冰浴下加入1mL TFA，0℃反应1h，加入20mL冷的乙醚，离心收集沉淀，用半制备型HPLC纯化：10％乙腈-H₂O(含1％的TFA)等梯度洗脱5min，10％至100％的乙腈-H₂O(含1％的TFA)梯度洗脱25min，保留时间T_R＝17min，收集产物，冷冻干燥，得到淡黄色固体产物化合物1C，

其HRMS如图3所示。

HRMS(ESI)m/z:[M+H]⁺:1633.7277。

其中，叶酸FA的结构：

实施例4 化合物2A的制备方法

(a)树脂溶胀：于一个10mL的固相反应器中加入400mg Fmoc保护的苯肼树脂(0.66mmol/g，0.264mmol)及3mL CH₂Cl₂，将树脂溶胀30min，抽除CH₂Cl₂，备用；

(b)脱除Fmoc保护基：将3mL 20％哌啶/DMF溶液加入步骤(a)溶胀后的树脂中，N₂鼓泡混匀，10min后，抽除溶剂，再加入3mL 20％哌啶/DMF溶液，N₂鼓泡混匀，10min后，用DMF(4×3mL)洗涤树脂，再用3mL无水DMF洗涤树脂，备用；

(c)氨基酸缩合：将4-叔丁氧羰基氨基-1-甲基-1H-吡咯-2-羧酸(254mg，1.056mmol)和三光气(BTC，128mg，0.433mmol)溶于2mL无水THF，向该溶液中缓慢滴加三甲基吡啶(collidine，488μL，3.696mmol)，反应立即产生大量白色沉淀，加完反应3min，再加入2mL DIEA/DMF溶液(5％,v/v)，白色沉淀完全消失，将该反应液转移到步骤(b)脱除保护基的苯肼树脂中，N₂鼓泡混匀，缩合反应0.5～1h，抽除反应液，用DMF(4×3mL)洗涤树脂，备用；

(d)脱除叔丁氧羰基保护基：用CH₂Cl₂(2×3mL)洗涤，抽除CH₂Cl₂，加入3.0mLTFA/苯酚/H₂O(v:v:v＝92:5:2.5)混合溶液脱除步骤(b)所得缩合产物上的叔丁氧羰基保护基，2min后抽除溶剂，再次加入3.0mLTFA/苯酚/H₂O(v:v:v＝92:5:2.5)混合溶液反应20min，用CH₂Cl₂(2×3mL)及DMF(4×3mL)洗涤树脂，再用3mL无水DMF洗涤树脂，备用；

重复上述缩合及脱保护步骤(c)和(d)，直至完成式(8)所示的负载在苯肼树脂上的肽的合成；

(e)氨基酸缩合：将4-叔丁氧羰基氨基-1-甲基-1H-咪唑-2-羧酸(254mg，1.056mmol)和三光气(BTC，128mg，0.433mmol)溶于2mL无水THF，向该溶液中缓慢滴加三甲基吡啶(collidine，488μL，3.696mmol)，反应立即产生大量白色沉淀，加完反应3min，再加入2mLDIEA/DMF溶液(5％,v/v)，白色沉淀完全消失，将该反应液转移到步骤(b)脱除保护基的苯肼树脂中，N₂鼓泡混匀，缩合反应0.5～1h，抽除反应液，用DMF(4×3mL)洗涤树脂，备用；

重复上述缩合及脱保护步骤(e)和(d)，直至完成式(9)所示的负载在苯肼树脂上的肽的合成；

(g)γ-氨基酸的缩合：将R-2-(9-芴甲氧羰基氨基)-4-叔丁氧羰基氨基丁酸(465mg，1.056mmol)和三光气(128mg，0.433mmol)溶于2mL无水THF，向该溶液中缓慢滴加三甲基吡啶(488μL，3.696mmol)，反应立即产生大量白色沉淀，加完反应1min，加入HOAt(144mg，1.056mmol)，再加入2mLDIEA/DMF溶液(5％,v/v)，反应5min，白色沉淀完全消失，将该反应液转移到式(9)所示的负载在苯肼树脂上的直链肽(NH₂-Im-Im-Py-Py-苯肼树脂)中，N₂鼓泡混匀，缩合反应0.5～1h，抽除反应液，用DMF(4×3mL)洗涤树脂，得到式(10)所示的负载在苯肼树脂上的肽；

(h)重复脱保护及缩合护步骤(d)和(c)，其中，直至完成得到式(11)所示的负载在苯肼树脂上的肽的合成；

(i)重复脱保护及缩合护步骤(d)和(e)，其中，直至完成得到式(12)所示的负载在苯肼树脂上的肽的合成；

(j)末端氨基酸的缩合：将1-甲基-1H-咪唑-2-羧酸(132mg，1.056mmol)和PyBOP(550mg，1.056mmol)溶于3mL无水DMF，加入DIEA(350μL，2.112mmol)，反应5min，将该反应液转移到步骤(h)所得的式(12)所示的负载在苯肼树脂上的肽中，N₂鼓泡混匀，缩合反应2h，抽除反应液，用DMF(4×3mL)洗涤树脂；并采用实施例1中的步骤(b)脱除式(12)所示的负载在苯肼树脂上的肽中的Fmoc保护基，得式(13)所示的负载在苯肼树脂上的肽；

将Boc₂O(243μL，1.056mmol)溶于3mL无水DMF，加入DIEA(350μL，2.112mmol)，将该反应液转移到脱除Fmoc的式(13)所示的负载在苯肼树脂上的肽中，N₂鼓泡混匀，缩合反应20min。抽除反应液，用DMF(4×3mL)洗涤树脂，得到Boc保护的式(14)所示的负载在苯肼树脂上的肽；

将以上式(14)所示的负载在苯肼树脂上的肽取出，加入1mL DMF、200μLN,N-双(3-氨丙基)甲胺，90℃振摇反应1h，冷至室温，将树脂滤除，并用20mLCH₂Cl₂洗涤树脂；将有机相浓缩，残留物用半制备型HPLC纯化：10％乙腈-H₂O(含1％的TFA)等梯度洗脱5min，10％至100％的乙腈-H₂O(含1％的TFA)梯度洗脱25min，保留时间T_R＝16min，收集产物，冷冻干燥，得到淡黄色固体，备用；

取上述固体4mg(3μmol)溶于0.5mL无水DMF，加入间苯二甲酸IPA(0.99mg，6μmol)、PyBOP(3.1mg，6μmol)和DIEA(5μL，30μmol)，室温振摇反应2h，用半制备型HPLC纯化：10％乙腈-H₂O(含1％的TFA)等梯度洗脱5min，10％至100％的乙腈-H₂O(含1％的TFA)梯度洗脱25min，保留时间T_R＝18min，收集产物，冷冻干燥得固体；将该固体溶于1mL CH₂Cl₂，冰浴下加入1mL TFA，0℃反应1h，加入20mL冷的乙醚，离心收集沉淀，用半制备型HPLC纯化：10％乙腈-H₂O(含1％的TFA)等梯度洗脱5min，10％至100％的乙腈-H₂O(含1％的TFA)梯度洗脱25min，保留时间T_R＝15min，收集产物，冷冻干燥，得到淡黄色固体产物化合物2A，

其HRMS如图4所示。

HRMS(ESI)m/z:[M+H]⁺：1359.5992。

实施例5 化合物2B的制备方法

按实施例4同样的步骤制得式(14)所示的负载在苯肼树脂上的肽。

将以上所得式(14)所示的负载在苯肼树脂上的肽取出，加入1mL DMF、200μL N,N-双(3-氨丙基)甲胺，90℃振摇反应1h，冷至室温，将树脂滤除，并用20mL CH₂Cl₂洗涤树脂；将有机相浓缩，残留物用半制备型HPLC纯化：10％乙腈-H₂O(含1％的TFA)等梯度洗脱5min，10％至100％的乙腈-H₂O(含1％的TFA)梯度洗脱25min，保留时间T_R＝16min，收集产物，冷冻干燥，得到淡黄色固体，备用；

取上述固体4mg(3μmol)溶于0.5mL无水DMF，加入赫斯特酸衍生物Ht-2(2.7mg，6μmol)、PyBOP(3.1mg，6μmol)和DIEA(5μL，30μmol)，室温振摇反应2h，用半制备型HPLC纯化：10％乙腈-H₂O(含1％的TFA)等梯度洗脱5min，10％至100％的乙腈-H₂O(含1％的TFA)梯度洗脱25min，保留时间T_R＝18min，收集产物，冷冻干燥得固体；将该固体溶于1mL CH₂Cl₂，冰浴下加入1mL TFA，0℃反应1h，加入20mL冷的乙醚，离心收集沉淀，用半制备型HPLC纯化：10％乙腈-H₂O(含1％的TFA)等梯度洗脱5min，10％至100％的乙腈-H₂O(含1％的TFA)梯度洗脱25min，保留时间T_R＝17min，收集产物，冷冻干燥，得到淡黄色固体产物化合物2B，

其HRMS如图5所示。

HRMS(ESI)m/z:[M+H]⁺：1645.7797.

赫斯特酸衍生物Ht-2的结构及合成路线如下：

将Ht-2(11.4g,44.2mmol)与4-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)苯-1,2-二胺(Ht-2-A，10g,31.0mmol，制备方法参见Inorg.Chem.1998,37,6018-6022)溶于乙酸(100mL)中，油浴加热回流反应4小时。减压蒸除乙酸，冷却至室温，柱层析纯化，得到草绿色固体。将所得产物溶于甲醇(100ml)，磁力搅拌，氮气保护，冰水浴冷却，缓慢滴加3.1g氢氧化钠的50ml水溶液，滴毕，室温反应8h，TLC检测反应完全，蒸除甲醇，稀盐酸调PH酸性，析出固体，过滤，干燥，得黄绿色固体Ht-2，其HNMR分别如图8所示。

HNMR(DMSO-d₆，400MHz)：2.44(s,3H),2.79(s,2H),3.23(s,2H),6.96(m,1H),7.05(brs,1H),7.47(m,1H),7.69-7.73(m,2H),8.08(m,1H),8.33-8.49(m,2H),8.83(s,1H)，12.73(brs,1H),13.41(brs,1H)。

实施例6 化合物2C的制备方法

按实施例4同样的步骤制得式(14)所示的负载在苯肼树脂上的肽；

将以上式(14)所示的负载在苯肼树脂上的肽取出，加入1mLDMF、200μLN,N-双(3-氨丙基)甲胺，90℃振摇反应1h，冷至室温，将树脂滤除，并用20mLCH₂Cl₂洗涤树脂；将有机相浓缩，残留物用半制备型HPLC纯化：10％乙腈-H₂O(含1％的TFA)等梯度洗脱5min，10％至100％的乙腈-H₂O(含1％的TFA)梯度洗脱25min，保留时间T_R＝16min，收集产物，冷冻干燥，得到淡黄色固体，备用；

取上述固体4mg(3μmol)溶于0.5mL无水DMF，加入叶酸FA(1.8mg，6μmol)、PyBOP(3.1mg，6μmol)和DIEA(5μL，30μmol)，室温振摇反应2h，用半制备型HPLC纯化：10％乙腈-H₂O(含1％的TFA)等梯度洗脱5min，10％至100％的乙腈-H₂O(含1％的TFA)梯度洗脱25min，保留时间T_R＝18min，收集产物，冷冻干燥得固体；将该固体溶于1mLCH₂Cl₂，冰浴下加入1mLTFA，0℃反应1h，加入20mL冷的乙醚，离心收集沉淀，用半制备型HPLC纯化：10％乙腈-H₂O(含1％的TFA)等梯度洗脱5min，10％至100％的乙腈-H₂O(含1％的TFA)梯度洗脱25min，保留时间T_R＝17min，收集产物，冷冻干燥，得到淡黄色固体产物化合物2C，

其HRMS如图6所示。

HRMS(ESI)m/z:[M+H]⁺：1633.7277。

叶酸FA的结构

实施例7 化合物2D的制备方法

按实施例4同样的步骤制得式(13)所示的负载在苯肼树脂上的肽。

(k)将赫斯特酸衍生物Ht-1(539mg，1.056mmol)和PyBOP(550mg，1.056mmol)溶于3mL无水DMF，加入DIEA(350μL，2.112mmol)，反应5min，将该反应液转移到式(13)所示的负载在苯肼树脂上的肽中，N₂鼓泡混匀，缩合反应1h，抽除反应液，得到式(15)负载在苯肼树脂上的肽。

赫斯特酸衍生物Ht-1的结构如下(制备方法参见J.AM.CHEM.SOC.2004,126,3736-3747)：

(l)式(15)树脂取出，加入1mLDMF、200μL二甲氨基丙胺及10mgCu(OAc)₂，室温振摇反应12h，将树脂滤除，并用20mLCH₂Cl₂洗涤树脂；将有机相浓缩，残留物用半制备型HPLC纯化：10％乙腈-H₂O(含1％的TFA)等梯度洗脱5min，10％至100％的乙腈-H₂O(含1％的TFA)梯度洗脱25min，保留时间T_R＝15min，收集产物，冷冻干燥，得到淡黄色固体化合物2D，

其HRMS如图7所示。

HRMS(ESI)m/z:理论计算值C₈₂H₉₄N₂₉O₁₁[M+H]⁺1660.7682实测:1660.7652。

实施例8 化合物抑制程序性死亡受体1基因表达实验

1)从新鲜血液中分离出外周血单个核细胞，采用Takara+10％FBS+IL2培养；

2)外周血单个核细胞接种到96孔板中，每孔接种细胞为50万，体积为150ul；加入化合物浓度为20uM，同时加入CD3抗体进行刺激；

3)在培养48小时后，将72h组的细胞均分为两组，其中一组再次加入相同化合物进行培养，一组不加化合物，新加入化合物一组按照药物浓度为20uM，总体积200ul；

4)收集0、24、48、72小时的细胞样品，用PE-PD1抗体和FITC-CD3抗体染色细胞，然后做流式检测，结果参见图9。从图9可以发现1A和2D两个序列的抑制效果较好，1A在48小时的处理中对PD1的抑制率达到了40％，而2D的抑制率接近50％。