hESCs‑TK细胞系及其构建方法和应用与流程

本发明涉及生物技术，具体是涉及hESCs-TK细胞系及其构建方法和应用。

背景技术：

人类胚胎干细胞(hESCs)具有无限的自我更新能力，同时能够保持其分化成为所有类型的人类体细胞的全能性。因此，hESCs在人类疾病治疗和模型建立的应用上具有广阔的发展前景。自从Thomson在1998年成功建立了第一株hESCs，人类干细胞疗法在发展中实现了重大的突破。在此背景下，脊髓损伤、黄斑部退化以及I型糖尿病的干细胞治疗已经进入临床试验阶段。目前1/2阶段的临床研究显示来源于hESC的视网膜色素上皮细胞可以有效改善衰老引起的黄斑部退化以及Stargardt黄斑部营养不良病人的视力。

在干细胞疗法显示出广阔应用前景的同时，几个严重的瓶颈阻碍了其临床应用发展。其中一个关键的瓶颈是hESC分化的同种异体移植物遭遇机体的免疫排斥。为了解决这个问题，医学界研发了多种免疫抑制或者免疫耐受治疗策略。通过应用具有人类免疫系统的人源化小鼠动物模型，在hESCs及其分化的细胞表面过表达两个免疫抑制蛋白CTLA4-Ig和PD-L1，我们研发了一种新型的抑制同种异体免疫排斥的方法。随后的研究显示，使用抗体阻断CD28和CD40共激活通路可以实现hESC分化的胰腺内胚层细胞在另一种人源化小鼠模型的免疫耐受。然而，这些免疫抑制或者耐受的策略会显著提高移植后的hESC分化细胞的癌变风险，即使免疫抑制是可逆转的，这些移植后的细胞可以逃避机体免疫监视。另外，移植后的细胞可能会引起诸如细胞不受控制的迁移至其他部位等严重问题。因此，研发一种在免疫抑制条件下改善移植后细胞的安全性的方法非常重要。

单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK，以下简称为TK)基因编码了一种可以把无毒性的更昔洛韦(GCV)转变为有毒性的更昔洛韦三磷酸盐，其可以整合到分裂期细胞的DNA中抑制DNA的合成，导致细胞死亡。前期研究表明这个基因可以有效并安全的应用于小鼠模型和肿瘤基因治疗法。因此，利用TK的特性开发一种消除移植后的免疫耐受hESC分化细胞的癌变风险的策略对胚胎干细胞疗法的安全性具有重要意义。

技术实现要素：

基于上述，本发明的目的之一为构建CPTK-hESCs细胞系，构建得到的胚胎干细胞表面能够高水平表达TK。

实现上述目的的技术方案如下：

一种CPTK-hESCs的构建方法，包括以下步骤：

A.hESCs的培养；

B.构建同源重组修复模板pBACe3.6RP11-671P4-452CNP-CPTK细菌人工染色体：细菌人工染色体pBACe3.6RP11-671P4购自Invitrogen。该修复模板DNA载体5’端至3’端依次包括有约124kb的HPRT1基因上游同源臂、LoxP位点、CAG启动子、抗性筛选基因Puro/IRES/Neo、LoxP位点、CAG启动子、目标基因CTLA4-Ig/IRES/PD-L1/IRES/TK、polyA多聚腺苷酸和约71kb的HPRT1基因下游同源臂；

C.将线性化的修复模板电转染进入hESCs细胞，转染后加入培养液令细胞恢复生长，随后加入含有嘌呤霉素的培养基培养，筛选分离出单克隆，再加入含有6-硫代鸟嘌呤的培养基培养筛选，选取阳性单克隆细胞株，再次转染表达Cre酶的pCAG/Cre/polyA质粒进去该细胞，筛选无嘌呤霉素抗性的单克隆细胞，得到CPTK-hESCs细胞系。

在其中一个实施例中，电转染的具体参数为：0.4cm电击杯，320volt，200μF，10x10⁶-40x10⁶，DNA质量为20-40μg。

在其中一个实施例中，嘌呤霉素浓度为1.5-2.0μg/ml。

在其中一个实施例中，培养基中的6-硫代鸟嘌呤浓度为0.5-1.5mM。

本发明的另一目的是提供一种CPTK-hESCs细胞系，其可用于提高胚胎干细胞疗法的安全性。

在其中一个实施例中，LoxP位点的碱基序列为：如SEQ ID NO.1所示的序列，或如SEQ ID NO.1所示，且有一个或多个碱基被取代，但活性不改变的序列；和/或所述CAG启动子碱基序列为：如SEQ ID NO.2所示的序列，或如SEQ ID NO.2所示的，且有一个或多个碱基被取代，但活性不改变的序列。

在其中一个实施例中，抗性筛选基因Puro/IRES/Neo碱基序列为:如SEQ ID NO.3所示的序列；或如SEQ ID NO.3所示的，且有一个或多个碱基被取代，但活性不改变的序列；和/或polyA多聚腺苷酸碱基序列为：如SEQ ID NO.5所示的序列,或如SEQ ID NO.5所示的，且有一个或多个碱基被取代，但活性不改变的序列。

在其中一个实施例中，所述目标基因CTLA4-Ig/IRES/PD-L1/IRES/TK碱基序列为：如SEQ ID NO.4所示的序列；或如SEQ ID NO.4所示的，且有一个或多个碱基被取代，但活性不改变的序列。

在其中一个实施例中，所述HPRT1基因上游同源臂的序列为：NCBI的序列编号为NC_000023.11中从134376991至134500246的碱基序列，或如NCBI的序列编号为NC_000023.11中从134376991至134500246的，且有一个或多个碱基被取代，但活性不改变的序列；和/或

所述HPRT1基因下游同源臂碱基序列组成为：NCBI的序列编号为:NC_000023.11中从134500874到134571880的序列，或如NC_000023.11中从134500874到134571880的，且有一个或多个碱基被取代，但活性不改变的序列。

根据上述构建方法得到的CPTK-hESCs细胞系。

本发明的另一目的是提供上述CPTK-hESCs细胞系的应用。

具体技术方案如下。

上述的CPTK-hESCs细胞系在制备消除逃逸免疫监测的干细胞衍生细胞癌变风险的生物制剂中的应用。

通过本发明基因敲入的设计，本发明通过把TK基因敲入至hESCs的管家基因HPRT1位点，PCR鉴定基因是否已经敲入至hESCs，结晶紫染色实验及数细胞鉴定体外培养的CPTK-hESCs细胞系是否对GCV敏感。随后CPTK-hESCs分别皮下注射至NSG小鼠或者人源化小鼠，畸胎瘤成型后腹腔注射GCV，以确定GCV能否有效去除体内的hESCs。CPTK分化为心肌细胞后肌肉注射至NSG小鼠或者人源化小鼠后腿肌肉，1至2周后进行冰冻切片并且染色以鉴定GCV能否消除分化后的hESCs。以CPTK-hESCs为系统，本发明建立了在hESCs中以TK基因/GCV为基础的消除技术，提供所述的CPTK-hESCs细胞系在制备消除逃逸免疫监测的干细胞衍生细胞癌变风险的生物制剂中的应用，为胚胎干细胞的临床治疗应用提供了更加安全的保障。

附图说明

图1为利用细菌人工染色体技术，通过同源重组将pCAG/CTLA4-lg/IRES/PD-L1/IRES/TK/polyA基因表达框敲入hESCs细胞HPRT1基因位点，其中：

A.人类HPRT1基因位点的构型。黑框代表HPRT1的外显子编码区，白框代表HPRT1的3‘非翻译区；黑色三角箭头代表PCR鉴定的引物位置；

B.同源重组后等位基因的构型，其中黑框代表HPRT1的外显子编码区，白框代表HPRT1的3‘非翻译区；黑色三角箭头代表PCR鉴定的引物位置。虚线箭头标识范围分别是上下游同源臂，其中上游同源臂为124kb，下游同源臂为71kb；

C.同源重组后的PCR鉴定；图片上半部分使用的引物为p1、p2和p5，其中如A和B所示，引物p1和p2扩增长度为404bp的野生型片段，引物p1和p5扩增长度为503bp的加Cre重组后没有抗性筛选基因的等位基因片段，引物p1和p5扩增长度为311bp的加Cre重组前具有抗性筛选基因的等位基因片段；图片下半部分使用的引物为p3、p4和p5，其中如A和B所示，引物p3和p4扩增长度为406bp的野生型片段，引物p3和p5扩增长度为277bp的加Cre重组前/后的等位基因片段；

D.药物毒性实验验证等位基因的同源重组；

E.Western Blotting验证CPTK-hESCs中CTLA4-Ig基因的表达；

F.流式细胞术验证CPTK-hESCs细胞表面高表达PD-L1基因。

图2为CPTK-hESCs的ES细胞特性及TK基因的功能鉴定，其中：

A.流式细胞术比较了野生型hESCs和CPTK-hESCs的全能性标记物的表达。验证了CPTK-hESCs的全能性；

B.qPCR比较了野生型hESCs和CPTK-hESCs的全能性基因的表达。再次验证了CPTK-hESCs的全能性；

C.免疫缺陷的NSG小鼠的畸胎瘤形成实验，验证了CPTK-hESCs能有效形成畸胎瘤的全能性；

D.体外GCV梯度药物毒性实验验证了CPTK-hESCs对GCV的敏感性；

E.体外GCV时间药物毒性实验验证了GCV能在4天能彻底清除CPTK-hESCs。

图3验证了TK基因并不影响CTLA4-Ig和PD-L1基因的功能，其中：

A.在免疫缺陷的NSG小鼠中野生型hESCs和CPTK-hESCs均能有效形成畸胎瘤，而在具有人类免疫系统的人源化小鼠中野生型hESCs不能形成正常畸胎瘤，表明CPTK-hESCs具有免疫耐受的功能。

B.流式细胞术验证野生型hESCs中具有大量的人CD3T细胞的浸润，而CPTK-hESCs中只有少量CD3T细胞。

C.免疫荧光实验验证野生型hESCs中具有大量的人CD3T细胞的浸润，而CPTK-hESCs中只有少量CD3T细胞。

D.在NSG小鼠或者人源化小鼠中野生型hESCs和CPTK-hESCs被排斥的统计。

E.H&E染色验证了人源化小鼠中野生型hESCs不能形成正常的畸胎瘤，而CPTK-hESCs能形成完整的畸胎瘤。

图4验证了GCV能有效消除小鼠体内的CPTK-hESCs，其中，

A.在NSG小鼠和人源化小鼠体内，腹腔注射GCV后，CPTK-hESCs形成的畸胎瘤随着时间变化而缩小。最后仅残留极小的一块组织；

B.免疫荧光染色实验表明了残留的组织不是人类组织，证明了CPTK-hESCs已被GCV完全清除；

C.在NSG小鼠或者人源化小鼠中野生型hESCs和CPTK-hESCs被GCV清除的统计。

图5验证了CPTK-hESCs分化为心肌细胞后仍然可以被GCV在小鼠体内清除；其中，

A.qPCR验证了野生型hESCs和CPTK-hESCs分化的心肌细胞均具有相似表达量的心肌细胞相关基因表达；

B.流式细胞术验证野生型hESCs和CPTK-hESCs分化的心肌细胞表面表达了相关的标记物；

C.免疫荧光染色实验表明了GCV能清除注射在人源化小鼠后腿肌肉上的CPTK-hESCs分化的心肌细胞。

具体实施方式

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人的《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂均为市售产品。

实施例1：CPTK-hESCs细胞株的建立

1.1细胞培养

hESCs细胞(Hues3,NIHhESC-09-0016)培养维持在CF1小鼠胚胎成纤维细胞制备的饲养层细胞上，在基础培养基Knockout Dulbecco’s modified Eagle’s medium加入10％的Knockout serum replacement、10％的plasmanate，0.1mM的非必需氨基酸，2mM的Glutamax，100units/ml青霉素，100μg/ml链霉素，10ng/ml的basic fibroblast growth factor(bFGF)和55μM的β-Mercaptoethanol。

hESCs用TrypLE来消化传代。

1.2BAC载体的构建

HPRT1 Bac载体(细菌人工染色体)RP11-671P4购自Invitrogen，靶向Bac载体如现有⁽[1]Song H,Chung SK,Xu Y.Modeling disease in human ESCs using an efficient BAC-based homologous recombination system.Cell stem cell.2010；6:80-89；

[2]Rong Z,Wang M,Hu Z et al.An effective approach to prevent immune rejection of human ESC-derived allografts.Cell stem cell.2014；14:121-130)所述通过E.coli菌株SW102感受态细胞同源重组而成。

pCAG/CTLA4-Ig/IRES/PD-L1/IRES/TK/polyA基因表达框敲入HPRT1基因终止子下游约600bp处。两端具有Loxp位点的抗性筛选基因表达框。

该修复模板DNA载体5’端至3’端依次包括有约124kb的HPRT1基因上游同源臂、LoxP位点、CAG启动子、抗性筛选基因Puro/IRES/Neo、LoxP位点、CAG启动子、目标基因CTLA4-Ig/IRES/PD-L1/IRES/TK、polyA多聚腺苷酸和约69kb的HPRT1基因下游同源臂。

所述HPRT1基因上游同源臂的序列构成为：NCBI的序列编号为NC_000023.11从134376991至134500246的碱基序列(Homo sapiens chromosome X,GRCh38.p7 Primary Assembly.NCBI Reference Sequence:NC_000023.11from base 134376991 to 134500246)。

LoxP位点的碱基序列组成为:ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT(SEQ ID NO.1)

CAG启动子碱基序列组成为：

TCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATT(SEQ ID NO.2)。

抗性筛选基因Puro/IRES/Neo碱基序列组成为:

ATGGGATCGGCCATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGATGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGGGGATCAATTCAATTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGA(SEQ ID NO.3)

目标基因CTLA4-Ig/IRES/PD-L1/IRES/TK碱基序列组成为：

ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTACTGGCCAGCAGCCGAGGCATCGCCAGCTTTGTGTGTGAGTATGCATCTCCAGGCAAAGCCACTGAGGTCCGGGTGACAGTGCTTCGGCAGGCTGACAGCCAGGTGACTGAAGTCTGTGCGGCAACCTACATGATGGGGAATGAGTTGACCTTCCTAGATGATTCCATCTGCACGGGCACCTCCAGTGGAAATCAAGTGAACCTCACTATCCAAGGACTGAGGGCCATGGACACGGGACTCTACATCTGCAAGGTGGAGCTCATGTACCCACCGCCATACTACCTGGGCATAGGCAACGGAACCCAGATTTATGTAATTGATCCAGAACCGTGCCCAGATTCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGATCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGAATTGAATTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCGGATCTTCCAGAAAGATGAGGATATTTGCTGTCTTTATATTCATGACCTACTGGCATTTGCTGAACGCATTTACTGTCACGGTTCCCAAGGACCTATATGTGGTAGAGTATGGTAGCAATATGACAATTGAATGCAAATTCCCAGTAGAAAAACAATTAGACCTGGCTGCACTAATTGTCTATTGGGAAATGGAGGATAAGAACATTATTCAATTTGTGCATGGAGAGGAAGACCTGAAGGTTCAGCATAGTAGCTACAGACAGAGGGCCCGGCTGTTGAAGGACCAGCTCTCCCTGGGAAATGCTGCACTTCAGATCACAGATGTGAAATTGCAGGATGCAGGGGTGTACCGCTGCATGATCAGCTATGGTGGTGCCGACTACAAGCGAATTACTGTGAAAGTCAATGCCCCATACAACAAAATCAACCAAAGAATTTTGGTTGTGGATCCAGTCACCTCTGAACATGAACTGACATGTCAGGCTGAGGGCTACCCCAAGGCCGAAGTCATCTGGACAAGCAGTGACCATCAAGTCCTGAGTGGTAAGACCACCACCACCAATTCCAAGAGAGAGGAGAAGCTTTTCAATGTGACCAGCACACTGAGAATCAACACAACAACTAATGAGATTTTCTACTGCACTTTTAGGAGATTAGATCCTGAGGAAAACCATACAGCTGAATTGGTCATCCCAGAACTACCTCTGGCACATCCTCCAAATGAAAGGACTCACTTGGTAATTCTGGGAGCCATCTTATTATGCCTTGGTGTAGCACTGACATTCATCTTCCGTTTAAGAAAAGGGAGAATGATGGATGTGAAAAAATGTGGCATCCAAGATACAAACTCAAAGAAGCAAAGTGATACACATTTGGAGGAGACGTAATCCGAATTCCGCTAGCAATTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCAAACTAGTATGGCTTCGTACCCCGGCCATCAACACGCGTCTGCGTTCGACCAGGCTGCGCGTTCTCGCGGCCATAGCAACCGACGTACGGCGTTGCGCCCTCGCCGGCAGCAAGAAGCCACGGAAGTCCGCCCGGAGCAGAAAATGCCCACGCTACTGCGGGTTTATATAGACGGTCCCCACGGGATGGGGAAAACCACCACCACGCAACTGCTGGTGGCCCTGGGTTCGCGCGACGATATCGTCTACGTACCCGAGCCGATGACTTACTGGCGGGTGCTGGGGGCTTCCGAGACAATCGCGAACATCTACACCACACAACACCGCCTCGACCAGGGTGAGATATCGGCCGGGGACGCGGCGGTGGTAATGACAAGCGCCCAGATAACAATGGGCATGCCTTATGCCGTGACCGACGCCGTTCTGGCTCCTCATATCGGGGGGGAGGCTGGGAGCTCACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCCTCATCTTCGACCGCCATCCCATCGCCGCCCTCCTGTGCTACCCGGCCGCGCGGTACCTTATGGGCAGCATGACCCCCCAGGCCGTGCTGGCGTTCGTGGCCCTCATCCCGCCGACCTTGCCCGGCACCAACATCGTGCTTGGGGCCCTTCCGGAGGACAGACACATCGACCGCCTGGCCAAACGCCAGCGCCCCGGCGAGCGGCTGGACCTGGCTATGCTGGCTGCGATTCGCCGCGTTTACGGGCTACTTGCCAATACGGTGCGGTATCTGCAGTGCGGCGGGTCGTGGCGGGAGGACTGGGGACAGCTTTCGGGGACGGCCGTGCCGCCCCAGGGTGCCGAGCCCCAGAGCAACGCGGGCCCACGACCCCATATCGGGGACACGTTATTTACCCTGTTTCGGGCCCCCGAGTTGCTGGCCCCCAACGGCGACCTGTATAACGTGTTTGCCTGGGCCTTGGACGTCTTGGCCAAACGCCTCCGTTCCATGCACGTCTTTATCCTGGATTACGACCAATCGCCCGCCGGCTGCCGGGACGCCCTGCTGCAACTTACCTCCGGGATGGTCCAGACCCACGTCACCACCCCCGGCTCCATACCGACGATATGCGACCTGGCGCGCACGTTTGCCCGGGAGATGGGGGAGGCTAACTGA(SEQ ID NO.4)

polyA多聚腺苷酸碱基序列组成为：

CTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGACTAGAGCTTGCGGAACCCTTC(SEQ ID NO.5)

和HPRT1基因下游同源臂碱基序列组成为：NCBI Reference Sequence:NC_000023.11中的由134500874至134571880的序列(Homo sapiens chromosome X,GRCh38.p7 Primary Assembly.NCBI Reference Sequence:NC_000023.11 from base 134500874 to 134571880)。

在上述各段序列的基础上，可以有一个或多个碱基的被取代，但是活性不变，这样的每段序列也适合本发明的hESCs-TK细胞系构建。

参见图1B.同源重组后等位基因的构型，其中黑框代表HPRT1的外显子编码区，白框代表HPRT1的3‘非翻译区。黑色三角箭头代表PCR鉴定的引物位置。虚线箭头标识范围分别是上下游同源臂，其中上游同源臂为124kb，下游同源臂为71kb。

pCAG/Neo/IRES/Puro/polyA敲入HPRT1基因的3’非翻译区开端，该基因表达框能破坏HPRT1基因的功能，细胞从而对硫代鸟嘌呤敏感。因此我们可以使用嘌呤霉素和硫代鸟嘌呤(6-TG)对正确敲入基因的阳性克隆进行双重筛选，在转染pCAG/Cre/polyA后，Cre酶介导的Loxp同源重组能删除抗性筛选基因表达框，从而使细胞恢复正常的HPRT1功能。

1.3hESCs细胞转染及筛选

应用Ⅱ型基因脉冲细胞电穿孔仪转染线性化的靶向Bac载体进入hESCs细胞。电转染的具体参数为：0.4cm电击杯，320volt，200μF，细胞数量为2X10⁷，Bac载体质量为30μg，重悬于750μl的PBS中进行电转染。转染后加入含有DR4小鼠胚胎成纤维细胞饲养层和培养液的培养皿中令细胞恢复生长48小时，随后加入含有嘌呤霉素浓度为0.5μg/ml的培养液培养3天。待细胞长至显微镜下可见单克隆时，加入含有1mM硫代鸟嘌呤的培养液进行二次筛选三天，然后分离出存活的单克隆，接种至96孔板，得到CPTK-hESCs细胞。

实施例2：CPTK-hESCs细胞的鉴定

2.1PCR检测

应用PCR技术鉴定同源重组后的基因敲入细胞系CPTK-hESCs。如图1A和C所示，正向引物p1(5’-AATGTCAGTTGCTGCATTCC-3’)和反向引物p2(5’-CTGCTGACAAAGATTCACTGG-3’)、p5(5’-GAAAGTCCCTATTGGCGTTAC-3’)，野生型的等位基因由p1和p2扩增得到长度为404bp的野生型条带；Bac同源重组后、Loxp-Cre同源重组前，由p1和p5扩增得到长度为311bp的条带；Bac同源重组后、Loxp-Cre同源重组后，由p1和p5扩增得到长度为503的条带。正向引物p3和反向引物p4、p5，野生型的等位基因由p3(5’-CTGTTGGTTCCATTTTCCTTG-3’)和p4(5’-GGCTCCTAAGTTTGATAGTTC-3’)扩增得到长度为406bp的条带；Bac同源重组后，由p3和p5扩增得到长度为277bp的条带。参见图1C。

2.2药物敏感实验

相应的hESCs接种于12孔细胞培养板，24小时后，把培养液分别替换为：1、正常hESCs细胞培养液；2、含有100μM hypoxanthine/0.4μM amimopterin/6μM thymidine(HAT)的hESCs培养液；3、含有1mM 6-TG的hESCs培养液。培养3天后根据生产商的说明书进行了Alkaline phosphatase检测。

野生型的细胞HPRT基因的功能正常，Bac同源重组后、由于筛选抗性基因框的插入，导致了HPRT基因失去了功能，而Loxp-Cre同源重组后把筛选抗性基因框删去，细胞重新获得了HPRT的功能。HPRT功能的缺失导致了细胞对6-TG的不敏感、而HPRT功能正常的细胞对HAT敏感。图1D验证了细胞HPRT的功能存在与否。野生型(WT)hESCs细胞对6TG敏感、对HAT不敏感表示HPRT基因功能正常；Loxp-Cre同源重组前(Cre-)细胞对6TG不敏感、对HAT敏感表示HPRT功能缺失；Loxp-Cre同源重组后(Cre+)细胞对6TG敏感、对HAT不敏感表示细胞重新获得HPRT功能。

2.3Western Blotting实验

相应的hESCs培养密度长至90％以上，把培养液替换为基础的DMEM培养液。24小时后，各取出两等份约1ml的培养液，加入1X的上样缓冲液煮沸，其中一份加β-mercaptoethanol，按照常规的Western blotting进行电泳分离蛋白并转膜，用HRP-conjugated goat anti-human immunoglobulin G-Fc抗体进行孵育并显色。结果如图1E所示，CPTK-hESCs在蛋白水平上表达了CLTA4-Ig，同时野生型hECCs不表达CLTA4-Ig。

2.4流式细胞术检测PD-L1及hESCs表面标记物

应用BD LSR-II流式细胞仪对CPTK-hESCs细胞进行表面人类PD-L、SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60和TRA1-81蛋白的表达分析。数据通过FACS Diva(Becton Dickinson公司)和FlowJo软件进一步分析。1x10⁶细胞使用PBS洗涤，室温下，使用DAPI，PE anti-PD-L1、PE anti-SSEA-3、PE anti-SSEA-4、PE anti-TRA1-60、PE anti-TRA1-81染色45分钟。染色后将细胞用PBS洗涤两次，并重新悬浮于FACS缓冲液，然后上机分析。图1F和图2A结果表明CPTK-hESCs表面高表达PD-L1蛋白及SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81这些人胚胎干细胞的表明标记物蛋白。

2.5畸胎瘤实验

CPTK-hESCs培养密度至90％以上，TrypLE消化细胞，PBS重悬并洗涤一遍，细胞计数后选取2X10⁶细胞/注射。在一个注射中，用100ul PBS重悬细胞后加入50ul Matrigel(BD公司)，皮下注射至NSG小鼠。等待约4-6周后，畸胎瘤长至1-2cm直径时收取畸胎瘤进行常规的H&E染色分析。图2C可见畸胎瘤具有三个胚层的细胞类型。

2.6qPCR检测CPTK-hESCs的全能性

CPTK-hESCs和野生型hESCs培养密度至90％以上，收取细胞，根据试剂生产商的说明提取RNA并进行cDNA逆转录，再进行qPCR检测相关人胚胎干细胞全能性基因表达量，结果如图2B所示。CPTK-hESCs具有全能性基因表达。

2.7TK表达检测

CPTK-hESCs和野生型hESCs长至密度约60％时加入不同浓度的GCV(0nM、10nM、20nM、40nM、80nM和160nM)培养三天，随后根据试剂商说明书对细胞用4％多聚甲醛PBS溶液进行固定，然后用结晶紫染色，结果如图2D所示，CPTK-hESCs对GCV的敏感性呈浓度梯度依赖性。

CPTK-hESCs和野生型hESCs传代至24孔板，第3天后开始加入终浓度为160nM的GCV培养4天，前7天中每天进行细胞计数，另外第14天和21天再次进行细胞计数。结果如图2E，CPTK-hESCs能被GCV彻底消除。

实施例3：CPTK-hESCs的体内功能检测

3.1CPTK-hESCs在人源化小鼠体内的免疫耐受实验

CPTK-hESCs和野生型hESCs培养密度至90％以上，TrypLE消化细胞，PBS重悬并洗涤一遍，细胞计数后选取一定数量的细胞进行皮下注射，其中NSG小鼠每个注射的细胞数为2X10⁶，人源化小鼠每个注射的细胞数为4X10⁶。在一个注射中，用100ul PBS重悬细胞后加入50ul Matrigel(BD公司)，随后进行皮下注射。等待约4-6周后，畸胎瘤长至1-2cm直径时收取畸胎瘤进行拍照、流式细胞术分析、免疫荧光染色分析、H&E染色分析及统计畸胎瘤被排斥的比例。结果如图3(包括图3A、B、C、D、E)所示。可以看出在无免疫力的NSG小鼠中CPTK-hESCs和野生型hESCs均能形成无差别的畸胎瘤，而在具有人类免疫系统的人源化小鼠中，野生型hESCs畸胎瘤被明显排斥，可见大量CD3阳性细胞的存在，具有T淋巴细胞浸润的特征；CPTK-hESCs畸胎瘤没有被排斥的迹象。H&E染色也进一步验证了该结论。

3.2GCV体内消除CPTK-hESCs畸胎瘤的功能验证

CPTK-hESCs和野生型hESCs培养密度至90％以上，TrypLE消化细胞，PBS重悬并洗涤一遍，细胞计数后选取一定数量的细胞进行皮下注射，其中NSG小鼠每个注射的细胞数为2X10⁶，人源化小鼠每个注射的细胞数为4X10⁶。在一个注射中，用100ul PBS重悬细胞后加入50ul Matrigel(BD公司)，随后进行皮下注射。3周后，半数的小鼠进行每天1次的剂量为30mg/kg的GCV腹腔注射，注射持续3周，每天进行拍照记录畸胎瘤大小。随后，收取畸胎瘤进行免疫荧光染色分析。图4A与野生型畸胎瘤相比较，可见CPTK畸胎瘤随时间变化而缩小，最后解剖时CPTK-hESCs畸胎瘤体积极小，为了验证残留部位是否来源于CPTK-hESCs，我们进行了免疫荧光染色分析，使用人类特异性抗体anti-human nuclei antibody进行染色，参见图4B,结果显示残留的组织不来源于CPTK-hESCs，分析可能是畸胎瘤生成过程中小鼠体内成纤维细胞的迁移形成的。图4C对重复试验进行了统计。

3.3GCV体内消除CPTK-hESCs分化的心肌细胞的功能验证

根据文献报道[Lian X,Hsiao C,Wilson G et al.Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America.2012；109:E1848-1857]方法进行心肌细胞的分化.CPTK-hESCs和野生型hESCs培养于覆盖了Matrigel的6孔板之中至密度约100％，此后开始分化，第1天加入含有12μMCHIR99021的RPMI1640/B27(不含胰岛素)培养24小时，然后撤去CHIR99021。第3天加入含有5μM IWP4的RPMI1640/B27(不含胰岛素)培养48小时，然后撤去IWP4。第7天把培养液换为RPMI1640/B27(含胰岛素)。培养直至细胞开始跳动，隔天换液。

对分化的心肌细胞进行qPCR检测其心肌细胞基因表达量、流式细胞术检测其表明心肌细胞标记物的表达。结果如图5A、B所示，分化的细胞具有心肌细胞的特征。随后收取细胞，取6X10⁶细胞进行肌肉注射，用50μl的PBS重悬细胞，加入50μl的Matrigel混匀，注射入小鼠后腿肌肉。次日开始半数的小鼠进行每天1次的剂量为30mg/kg的GCV腹腔注射，注射持续2周，然后收取肌肉组织进行免疫荧光染色分析。结果如图5C所示，GCV能有效消除CPTK-hESCs分化而成的心肌细胞，同时CPTK-hESCs分化而成的心肌细胞能在人源化小鼠体内耐受免疫系统的攻击。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东圣赛生物科技有限公司

南方医科大学

<120> hESCs-TK细胞系及其构建方法和应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat 34

<210> 2

<211> 1722

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 60

cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 120

caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 180

gactttccat tgacgtcaat gggtggacta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 240

tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 300

ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 360

attagtcatc gctattacca tgggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca 420

tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag 480

cgatgggggc gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg 540

ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt 600

ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg 660

ggagtcgctg cgttgccttc gccccgtgcc ccgctccgcg ccgcctcgcg ccgcccgccc 720

cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg 780

ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg ctcgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc 840

cttaaagggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt 900

gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg cccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc 960

gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 1020

gtgccccgcg gtgcgggggg gctgcgaggg gaacaaaggc tgcgtgcggg gtgtgtgcgt 1080

gggggggtga gcagggggtg tgggcgcggc ggtcgggctg taaccccccc ctgcaccccc 1140

ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtgcg gggcgtggcg 1200

cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 1260

cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg ccccggagcg ccggcggctg 1320

tcgaggcgcg gcgagccgca gccattgcct tttatggtaa tcgtgcgaga gggcgcaggg 1380

acttcctttg tcccaaatct ggcggagccg aaatctggga ggcgccgccg caccccctct 1440

agcgggcgcg ggcgaagcgg tgcggcgccg gcaggaagga aatgggcggg gagggccttc 1500

gtgcgtcgcc gcgccgccgt ccccttctcc atctccagcc tcggggctgc cgcaggggga 1560

cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg tgaccggcgg 1620

ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc tcctgggcaa 1680

cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt tggcaaagaa tt 1722

<210> 3

<211> 2009

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc 120

cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg 180

aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc 240

gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg 300

ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct 360

gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg 420

aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat 480

ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc 540

atgcccgacg gcgatgatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg 600

gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc 660

tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct 720

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cccctaacgt tactggccga agccgcttgg aataaggccg gtgtgcgttt gtctatatgt 900

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tcttgacgag cattcctagg ggtctttccc ctctcgccaa aggaatgcaa ggtctgttga 1020

atgtcgtgaa ggaagcagtt cctctggaag cttcttgaag acaaacaacg tctgtagcga 1080

ccctttgcag gcagcggaac cccccacctg gcgacaggtg cctctgcggc caaaagccac 1140

gtgtataaga tacacctgca aaggcggcac aaccccagtg ccacgttgtg agttggatag 1200

ttgtggaaag agtcaaatgg ctctcctcaa gcgtattcaa caaggggctg aaggatgccc 1260

agaaggtacc ccattgtatg ggatctgatc tggggcctcg gtgcacatgc tttacatgtg 1320

tttagtcgag gttaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac ggggacgtgg ttttcctttg 1380

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ccacccgcga cgacgtcccc agggccgtac gcaccctcgc cgccgcgttc gccgactacc 1500

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gcctcctggc gccgcaccgg cccaaggagc ccgcgtggtt cctggccacc gtcggcgtct 1800

cgcccgacca ccagggcaag ggtctgggca gcgccgtcgt gctccccgga gtggaggcgg 1860

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ggtgcatgac ccgcaagccc ggtgcctga 2009

<210> 4

<211> 4387

<212> DNA

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acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240

gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300

gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360

gagctcatgt acccaccgcc atactacctg ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420

attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480

acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc 540

ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600

gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660

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gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900

ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960

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taactga 4387

<210> 5

<211> 303

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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