一种山楂叶中黄酮类单体的高效制备方法与流程

本发明属于中药有效成分的高效制备技术领域，具体涉及一种从山楂叶中制备高纯度牡荆素、金丝桃苷和2”-o-牡荆素鼠李糖苷的方法。

技术背景

山楂叶(crataegifolium)为蔷薇科(rosaceae)植物山里红(crataeguspinnatifidabge.var.majorn.e.br.)或山楂(crataeguspinnatifidabge.)的干燥叶，具有活血化瘀，理气通脉，化浊降脂等多种功效，在我国山东、陕西、山西等地均广泛分布。山楂叶作为山楂果实的副产物，资源丰富、产量高，具有广泛的开发价值。现代药理研究表明山楂叶具有降血脂、抗心肌缺血缺氧、防治糖尿病、抗炎和镇痛等多种药理活性。并且已广泛的应用于山玫胶囊、益心酮片等多味中药中。牡荆素、金丝桃苷和2”-o-牡荆素鼠李糖苷为黄酮类化合物，为《中国药典》中规定山楂叶、山楂叶提取物及相关制剂中检测指标。该三种成分在山楂叶中含量较低，聚酰胺色谱、硅胶柱色谱和sephadexlh-20等传统制备方法，具有分离时间长、重现性差、死吸附严重、溶剂消耗量大等缺点。虽然制备液相色谱具有分离效率高、重现性好等优势，但是对组分较杂的样品，该方法仍具有分离效率较低，样品前处理严格的弊端。

综上所述，现有技术中对于难以从山楂叶中高效、低成本分离制备高纯度牡荆素、金丝桃苷和2”-o-牡荆素鼠李糖苷的问题，尚缺乏有效的解决方案。

技术实现要素：

针对上述现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种山楂叶中黄酮类单体的高效制备方法，包括如下步骤：

1)将山楂叶粉碎、提取、富集、蒸干，制得粗样品；

2)应用高速逆流色谱法将牡荆素、金丝桃苷和2”-o-牡荆素鼠李糖苷从粗样品中分离纯化出来，得到牡荆素、金丝桃苷和2”-o-牡荆素鼠李糖苷的混合物；

3)利用制备液相色谱对牡荆素、金丝桃苷和2”-o-牡荆素鼠李糖苷的混合物进行纯化，制备得到高纯度牡荆素、金丝桃苷和2”-o-牡荆素鼠李糖苷三种单体。

本发明中将高校逆流色谱法作为富集手段，较常规逆流色谱一次分离得到多个化合物单体的模式，增大了样品上样量，极大提高了富集效率。同时，结合制备液相色谱技术，实现了低含量黄酮类化合物的快速制备。高校逆流色谱法和制备色谱技术联用从山楂叶中制备得到纯度大于98％牡荆素、金丝桃苷和2”-o-牡荆素鼠李糖苷单体的方法具有制备成本低、操作简便、效率高单体纯度大等优势。

进一步的，步骤1)中，所述提取是将一定质量的山楂叶粉末用6-9倍量的50-95％乙醇加热回流提取，得提取液。

采用50-95％乙醇(此处的％为体积分数)可以对山楂叶粉中的牡荆素、金丝桃苷和2”-o-牡荆素鼠李糖苷具有良好的提取效果，有利于这三种单体的制备。

更进一步的，对山楂叶粉末提取的次数为2-4次，每次提取1.5-2.5h。

更进一步的，将所述提取液减压回收乙醇，至无醇味，加入一定量热水，过滤后，得到上柱溶液，将上述溶液用大孔树脂柱富集，洗脱、浓缩，制得粗样品。

大孔树脂柱有利于牡荆素、金丝桃苷和2”-o-牡荆素鼠李糖苷三种单体的富集，避免了这三种单体的损失。

进一步的，步骤2)中，高速逆流色谱法的溶剂系统为氯仿：甲醇：水：正丁醇＝4：2.5-3.5：1.5-2.5：1-2(v/v)。

更进一步的，高速逆流色谱法的溶剂系统为氯仿：甲醇：水：正丁醇＝4：3：2：1.5(v/v)。

进一步的，高效逆流色谱仪的分离参数为：柱体积200-400ml，上样量600-1220mg，转速600-1000rpm，上相为固定相，下相为流动相，流动相的流速1-10ml/min，检测波长254nm。

更进一步的，柱体积300ml，上样量800mg，转速850rpm，流动相的流速5.0-10.0ml/min。

进一步的，步骤3)中，制备液相色谱的制备参数为：watersxbridgebehc18柱(100mm×4.6mmi.d.,2.5μm)，紫外检测波长254nm，柱温：25℃，流速：1.0ml/min，进样量：10μl，洗脱溶剂为乙腈和水，梯度条件为：0-3min，13％-14％乙腈；3-15min，14％-17％乙腈；15-15.1min，17％-13％乙腈；15.1-20min，13％乙腈。

一种具有降血脂、抗心肌缺血缺氧、防治糖尿病、抗炎、抗镇痛药理活性的药物的制备方法，包括利用上述方法从山楂叶中制备高纯度牡荆素、金丝桃苷和2”-o-牡荆素鼠李糖苷的步骤。

本发明的有益效果为：

本发明的制备方法利用大孔树脂柱富集山楂叶中总黄酮，经高速逆流色谱富集含有牡荆素、金丝桃苷、2”-o-牡荆素鼠李糖苷的组分，最后经制备液相色谱分离得到上述三个化合物，成本低于现有技术，操作简便，效率高，可以较大批量分离制备出纯度大于98％的山楂叶黄酮单体化合物。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1为实施例1的工艺流程图；

图2为实施例1山楂叶总黄酮粗提液的高效液相色谱图；

图3为实施例1山楂叶总黄酮粗提液分离的高速逆流色谱图；

图4为实施例1中牡荆素、金丝桃苷、2”-o-牡荆素鼠李糖苷组分的高效液相色谱图；

图5为实施例1中牡荆素、金丝桃苷、2”-o-牡荆素鼠李糖苷组分的液相制备图；

图6为实施例1中牡荆素单体的高效液相色谱图；

图7为实施例1中金丝桃苷单体的高效液相色谱图；

图8为实施例1中2”-o-牡荆素鼠李糖苷单体的高效液相色谱图；

图9为对比例1中的高速逆流色谱图；

图10为对比例2中的高速逆流色谱图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

实施例1

如图1一种山楂叶中黄酮类单体的高效制备方法流程图如图1所示。

1.山楂叶总黄酮的提取

山楂叶总黄酮的提取：将山楂叶粉碎，加8倍量70％乙醇(70％是体积分数)加热回流提取2次，每次提取2h。两次提取液合并，减压回收乙醇，至无醇味，加入适量热水，抽滤或离心，即得上柱溶液。将上柱溶液进行大孔树脂柱富集，先用纯水洗脱，再用70％乙醇洗脱，70％乙醇洗脱物合并收集，减压浓缩至浸膏，得山楂叶总黄酮粗提液，图2为山楂叶总黄酮粗提液的高效液相色谱图，可见，高效液相色谱无法将粗体液中的三种单体分离，这是因为粗提液中含有大量的高含量干扰物质。

2.应用高速逆流色谱分离纯化山楂叶总黄酮单体

溶剂系统为氯仿-甲醇-水-正丁醇(4:3:2:1.5，v/v)，高速逆流色谱仪柱体积为300ml，上样量800mg，转速850rpm，上相为固定相，下相为流动相，流速5.0ml/min，检测波长254nm。

具体的操作步骤是：按上述溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，取800mg富含山楂叶总黄酮样品，溶解于10ml加上相和10ml下相中待用。采用上海同田公司研制的半制备型高速逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300ml)等组成，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵。开启速度控制器，使高速逆流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达850rpm时，将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱。设置流动相流速为5.0ml/min，开始泵流动相，然后根据检测器紫外光谱图(如图3所示)接收目标成分，得含有牡荆素、金丝桃苷、2”-o-牡荆素鼠李糖苷三个峰的混合物98.6mg。

将得到的混合物用高效液相色谱仪进行分离，如图4所示，可以将混合物中的三种单体完全分离，而且混合物中没有其他杂质的干扰。

3.制备液相色谱分离纯化

采用制备液相色谱对上述混合物进行二次制备，流动相为乙腈-水(19:81，v/v)，流速5.0ml/min，检测波长254nm时，三种化合物可以实现基线分离，如图5所示，如图6、图7和图8所示，制备的三种单体中没有其他干燥物质的存在，制备的三种化合物的纯度均高于98％。

利用高效液相色谱分析分离物，液相条件：watersxbridgebehc18柱(100mm×4.6mmi.d.,2.5μm)，紫外检测波长254nm，柱温：25℃，流速：1.0ml/min，进样量：10μl，洗脱溶剂为乙腈和水，梯度条件为：0-3min，13％-14％乙腈；3-15min，14％-17％乙腈；15-15.1min，17％-13％乙腈；15.1-20min，13％乙腈。

结构鉴定：对分离得到的黄酮应用agilent5973n质谱仪和brukerav-400mhz核磁共振波谱仪分别进行ms，nmr谱的测定，所得数据如下：

牡荆素：esi-ms,m/z433.3[m+h]⁺,431.1[m-h]^-.¹h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ:13.16(1h,s,5-oh),6.90(2h,d,j＝6.4hz,h-3',5'),6.77(1h,s,h-3),6.26(1h,s,h-6),4.69(1h,d,j＝9.9hz,h-1”).¹³c-nmr(100mhz,dmso-d6)δ:181.7(c-4),163.7(c-2),162.7(c-7),161.0(c-5),160.3(c-4'),156.5(c-9),129.6(c-2'),128.8(c-6'),121.5(c-1'),115.7(c-3'),115.7(c-5'),104.7(c-8),104.1(c-10),102.4(c-3),98.2(c-6),81.7(c-5”),78.5(c-3”),73.3(c-1”),70.8(c-2”),70.4(c-4”),61.1(c-6”)。

金丝桃苷：esi-ms,m/z465.2[m+h]^-,463.1[m-h]^-.¹h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ:12.64(1h,s,5-oh),10.84(1h,s,7-oh),7.67(1h,dd,j＝2.0,8.4hz,h-6'),7.54(1h,d,j＝2.0hz,h-2'),6.82(1h,d,j＝8.4hz,h-6'),6.41(1h,d,j＝1.6hz,h-8),6.20(1h,d,j＝1.6hz,h-6),5.38(1h,d,j＝8.0hz,h-1”).¹³c-nmr(100mhz,dmso-d6)δ:177.3(c-4),164.5(c-7),161.1(c-5),156.2(c-9),156.1(c-2),148.4(c-4'),144.7(c-3'),133.4(c-3),121.9(c-6'),121.0(c-1'),115.8(c-5'),115.1(c-2'),103.7(c-10),101.8(c-1”),98.7(c-6),93.5(c-8),75.7(c-5”),73.1(c-3”),71.1(c-2”),67.8(c-4”),60.0(c-6”)。

2”-o-牡荆素鼠李糖苷：esi-ms,m/z579.2[m+h]^-,577.2[m-h]^-.¹h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ:13.15(1h,s,5-oh),8.05(2h,d,j＝8.8hz,h-2',6'),6.91(2h,d,j＝8.8hz,h-3',5'),6.79(1h,s,h-3),6.28(1h,s,h-6),4.98(1h,s,h-1”'),4.77(1h,d,j＝10.0hz,h-1”),0.48(3h,d,j＝6.0hz,h-6”').¹³c-nmr(100mhz,dmso-d6)δ:182.5(c-4),164.4(c-2),162.7(c-7),161.5(c-5),161.1(c-4'),156.3(c-9),129.4(c-6'),129.1(c-2'),122.1(c-1'),116.5(c-5'),116.3(c-3'),104.9(c-10),104.7(c-8),103.0(c-3),100.8(c-l”'),98.7(c-6),82.2(c-5”),80.2(c-3”),75.5(c-2”),72.1(c-1”),71.8(c-4”'),71.0(c-2”'),70.8(c-3”'),70.6(c-4”),68.7(c-5”'),61.5(c-6”),18.2(c-6”')。

实施例2

山楂叶总黄酮的提取：将山楂叶粉碎，加9倍量60％(60％是体积分数)乙醇加热回流提取2次，每次2h。两次提取液合并，减压回收乙醇，至无醇味，加入适量热水，抽滤或离心，即得上柱溶液。将上述溶液进行大孔树脂柱富集，先用10％乙醇洗脱，再用70％乙醇洗脱，70％乙醇洗脱物合并收集，减压浓缩至浸膏，得山楂叶总黄酮。

2.应用高速逆流色谱分离纯化山楂叶总黄酮单体

溶剂系统为氯仿-甲醇-水-正丁醇(4:3:2:1.4，v/v)，高速逆流色谱仪柱体积为300ml，上样量760mg，转速850rpm，上相为固定相，下相为流动相，流速6.0ml/min，检测波长254nm。

具体的操作步骤是：按上述溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，取760mg富含山楂叶总黄酮样品，溶解于15ml加上相和15ml下相中待用。采用上海同田公司研制的半制备型高速逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300ml)等组成，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵。开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达850rpm时，将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱。设置流动相流速为6.0ml/min，开始泵流动相，然后根据检测器紫外光谱图接收目标成分，得牡荆素、金丝桃苷、2”-o-牡荆素鼠李糖苷得含有牡荆素、金丝桃苷、2”-o-牡荆素鼠李糖苷三个峰的混合物95.2mg。

3.制备液相色谱分离纯化

采用制备液相色谱对上述混合物进行二次制备，流动相为乙腈-水(20:80，v/v)，流速5.0ml/min，检测波长254nm时，三种化合物可以实现基线分离，最终制备得到三种化合物的纯度均高于98％。

对比例1

条件：氯仿-甲醇-水(4:3:2，v/v)，流速：5mlmin^-1，进样量：800mg，固定相保留：66％，转速：800rpm，其他条件与操作都与实施例1中的一样。分离结果：出峰时间太慢，化合物未能洗脱出来，如附图9。

对比例2

条件：正丁醇-乙酸-水(4:1:5，v/v)，流速：2mlmin^-1，进样量：800mg，固定相保留：12％，转速：800rpm，其他条件与操作都与实施例1中的一样。分离结果：保留值过低，样品同时被洗脱出，仍未得到有效分离，如附图10。

由图9和图10可以看出，对比例1与实施例1是在溶剂系统中将正丁醇去掉，并且溶剂系统的前三种比例不变，就导致出峰时间太慢，化合物未得到分离，对比例2使用其他的溶剂系统同样导致了化合物没有得到有效分离。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。