本发明涉及一种在离子液体介质中进行的微波辅助的脂肪酶催化合成曲酸月桂酸单酯的方法，属于食品生物技术领域。
背景技术：
曲酸(kojicacid)是由曲霉属中某些菌株利用葡萄糖、果糖、山梨糖和糖醉等原料，好氧发酵产生的一种弱酸化合物。曲酸具有抑菌能力、抗氧化性、与金属离子鳌合等性质，并具有抑制酪氨酸酶减少黑色素生成的作用，因此在食品中可作为防腐剂、保鲜剂、护色剂。可安全应用于食品、护肤品及医疗行业。目前对于曲酸的开发研究，大多数集中在寻找能够保留甚至提高曲酸抑制酪氨酸酶活力的性能，又可以克服曲酸易变性的缺点的曲酸衍生物。因而，曲酸衍生物的制备成为近年来的研究应用上的焦点和相关产品开发的新动向。
ariff等人(jbiomedbiotechnol.2012；2012:952452.)通过研究曲酸酯对细胞及mushroom酪氨酸酶的抑制活性，结果表明，曲酸酯是安全无毒的除色剂，能有效抑制b16f1黑色素瘤细胞的酪氨酸酶活性。人们尝试通过其与脂肪酸的酯化反应，以期提高曲酸的脂溶性，尤其是通过利用生物转化法获得更为安全可靠的曲酸脂肪酸酯衍生物(jamoilchem-soc.1998,75:1507–1511；enzymeandmicrobtechnol.2014,55:128–132；enzymeandmicrobtechnol.2005,37:739–744.)，进一步扩大其在疏水性食品中的应用范围。
我们的前期研究结果表明，曲酸月桂酸单酯(kojicmonolaurate，kml)具有良好的抑菌能力、抗氧化性能，有望被开发成为防腐剂、保鲜剂、护色剂，应用于果蔬及甲壳类水产品保鲜领域。合成kml的方法主要有化学合成与生物催化法。化学合成法使用大量有机溶剂和价格昂贵的金属催化剂，通过复杂的保护与去保护步骤，提高产物的单酯选择性。分离纯化复杂、投资成本大、易污染环境等缺点。而生物催化法具有条件温和、能耗低、无有害副产物、分离纯化操作简便等特点。此外生物催化剂可以重复利用，降低了成本。
酶促法制备kml，主要利用脂肪酶作为催化剂，使曲酸与月桂酸发生直接酯化反应。但从国内外的研究发现，常规脂肪酶在有机溶剂(叔戊醇、叔丁醇等)介质中催化酯化反应仍存在反应活性低、时间过长、产率低、酶用量大等问题。基于以上研究现状，如何缩短反应时间、提高转化率，同时减少脂肪酶及挥发性有机溶剂的使用成为制备kml亟待解决的问题。
自1986年gedye等利用微波辐射有效地加速有机反应以来，人们对微波的研究越来越深入。目前微波加速有机反应主要用微波的热效应和非热效应来解释。微波的热效应表现在其高效加热特性使反应速率加快。微波的非热效应表现在微波辐射还起到催化剂的作用，改变了反应的动力学，降低了反应活化能，提高反应速率。1990年以来，微波被应用于生物催化领域特别是在非水相酶催化方面。微波辐射对生物催化反应的影响主要表现在：适宜强度的微波辐射能使酶分子的活性部位更加“裸露”，便于更好地与底物结合，结果表现出酶活升高。微波辐射能增加反应体系及底物分子的能量，加强底物分子的有效碰撞，从而实现加快反应速率的目的。
离子液体因具备对环境友好的特性而被称为“绿色”溶剂，己经在有机合成与生物化学、电化学、分离过程、催化等领域得到广泛的应用。离子液体具有优异的化学和热力学稳定性，有很好的底物溶解性，较宽的温度适用范围，且几乎无蒸汽压，是绿色的反应介质。同时，其自身结构的“可调节性”，使得离子液体可对微波能量有着较好的吸收效果。并且已经有研究表明，与有机溶剂相比，脂肪酶在一些离子液体中较有机溶剂中表现出更高的催化活性和反应立体及区域选择性。
本发明是利用脂肪酶在离子液体中催化合成曲酸月桂酸单酯。该方法以固定化状脂肪酶为生物催化剂，离子液体作为反应介质，曲酸与月桂酸为底物，在微波反应装置中利用微波加热促进脂肪酶催化合成食品添加剂曲酸月桂酸单酯。提高了脂肪酶的催化活性及选择性，缩短了反应时间，避免环境污染，为生物法制备kml提供了又一成功范例
技术实现要素：
本发明目在于提供一种脂肪酶在离子液体中催化合成kml的方法，缩短反应时间、减小环境污染，提高产物得率。
本发明的技术方案如下：
一种微波辅助的离子液体中酶促合成kml的方法，包括以下步骤：
将曲酸、月桂酸、分子筛、脂肪酶与离子液体加入生物反应器中，将反应器移入微波反应装置中，启用微波辐射进行反应。反应结束后反应体系进行离心分离，并用乙酸乙酯洗涤固体相两次，收集有机相，减压除溶剂得白色固体粗产物；再经过色谱分离，收集样品组分，合并有机相，干燥，减压除溶剂，得白色产物。
本发明是在微波加热条件下，利用脂肪酶在离子液体中催化合成kml，不仅提高的脂肪酶的催化反应活性及选择性，反应条件温和、工艺条件简单，缩短反应时间，更减小了环境污染。
其中，上述脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶、褶皱假丝酵母脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶、猪胰脂肪酶、根霉脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶、洋葱布克氏菌脂肪酶；或上述一种或多种的脂肪酶。
其中，上述固定化脂肪酶的用量为2.0-3.0％(w/v)。
其中，上述离子液体为三辛烷基甲基季铵盐、氯化-1-烯丙基-3-甲基咪唑盐、1-乙基-3-甲基咪唑乙酸正离子、1-丁基-3-甲基咪唑鎓氯化物、1-羟乙基-3-甲基咪唑四氯硼酸盐、1-羟乙基-3-甲基咪唑十二烷基磺酸盐、1-羟乙基-3-甲基咪唑氯盐、1-羟乙基-3-甲基咪唑硫酸氢盐、1-羟乙基-3-甲基咪唑硝酸盐；或上述一种或多种的混合离子液体。
其中，上述曲酸的用量为5-8g/l,且与月桂酸的摩尔比为1:1-1:8。
其中，上述酶促反应温度为50-70℃。
其中，上述催化反应时间为0-3h。
其中，上述分子筛为3a，且分子筛的用量为10-12％(w/v)。。
对反应进行微波加热的辐射功率为30～200w，优选30～80w，辐射频率2000mhz。
本发明中，最佳的反应条件为：反应温度62℃，辐射功率60w，辐射频率为2000mhz，反应时间为1h。
本发明还提供了一种曲酸月桂酸单酯在制备食品添加剂中的应用，所述的食品添加剂用于抑菌或者抗氧化。
作为优选，所述的曲酸月桂酸单酯用于抑制金黄色葡萄球菌。
同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：本发明采用微波辅助下在绿色离子液体介质中脂肪酶催化合成kml，不仅操作简便，反应迅速，而且提高了脂肪酶的选择性，提高产物得率。同时采用了绿色离子液体作为反应介质，即提高了对微波的吸收效果，促进微波效应，又减少环境污染，符合绿色化学的要求。
附图说明
图1为实施例4中曲酸月桂酸酯对金黄色葡萄球菌的生长曲线的影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但本发明不限于此。
气相色谱(gc)分析条件：不同时间从反应器中取出适量样品用色谱纯甲醇稀释并置于样品瓶中。立刻加样入gc色谱仪(agilent6890n)中，以防止样品的分解。色谱柱：ht-5fusedsilicacapillarycolumn(0.15μm,0.53mm,0.30m),检测器：fid，进样口及检测器温度340℃和350℃，柱温采用程序升温：70℃到340℃，升温速率20℃/min。载气为n2，流速：1.0ml/min，进样量：2μl。kml得率(摩尔转化率)＝曲酸月桂酸单酯摩尔数/初始曲酸摩尔数×100％。
样品处理条件：反应结束后，反应体系进行离心分离，并用乙酸乙酯洗涤固体相两次，收集有机相，减压除溶剂得白色固体粗产物；再经过色谱分离，收集样品组分，合并有机相，干燥，减压除溶剂，得白色产物。
实施例1
本实施例探究有机溶剂中常规加热和微波加热的脂肪酶催化反应的差异。
用常规加热的脂肪酶催化反应：
在生物反应器中加入20mm曲酸、100mm月桂酸、300mg3a分子筛和60mg脂肪酶novozym435(candidaantarcticalipaseimmobilizedonmacroporouspolyacrylicresin)，3ml叔丁醇，水浴恒温62℃，反应10h后的kml产率为20.3％。
微波加热的脂肪酶催化反应：
在微波反应器中加入0.2mm曲酸、1.0mm月桂酸、24mg/ml3a分子筛和1.2mg/ml脂肪酶novozym435，3ml叔丁醇，将微波反应器移入微波反应装置中，启用微波辐射，设定反应温度62℃，辐射功率30w，辐射频率为2000mhz，反应1h后的kml产率为22.3％。
实施例2
与实施例1对比，本实施例探究了微波加热脂肪酶催化反应在离子液体中的反应情况。
在微波反应器中加入20mm曲酸、100mm月桂酸、300mg3a分子筛和160mg脂肪酶novozym435与3ml离子液体[peg350im]pf6，将微波反应器移入微波反应装置，启用微波辐射，设定反应温度62℃，辐射功率30w，辐射频率为2000mhz，反应1h后的kml产率为35.1％。
实施例3
与实施例2相较，本实施例探究在离子液体中用不同功率微波加热脂肪酶催化反应的差异。
在离子液体中用60w功率微波加热脂肪酶催化反应：在微波反应器中加入20mm曲酸、100mm月桂酸、300mg3a分子筛和160mg脂肪酶novozym435与3ml离子液体[peg350im]pf6，将微波反应器移入微波反应装置，设定反应温度62℃，辐射功率60w，辐射频率为2000mhz，反应为1h的kml产率为37.3％。
实施例4
本实施例探究了曲酸月桂酸酯对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响。选取金黄色葡萄球菌作为代表菌属，研究抑制剂对它们生长曲线的影响。固定菌液的初始浓度，将1mic，2mic，4mic,6mic的浓度的曲酸月桂酸酯加入含菌液体培养基中。然后定期取样用无菌水稀释至适当浓度，涂布，进行平板计数。总时间取微生物的一个生长周期24h。从图1看出，浓度为2mic时，2h内可以将109cfu/ml的金黄色葡萄球菌抑制到小于104cfu/ml左右，并能持续作用到4h。浓度大于4mic时，在4h内对金黄色葡萄球菌直接杀死。
实施例5
本实施例探究了曲酸月桂酸酯的体外模拟脂质过氧化的抑制作用。于比色管中加入3.0mlhci溶液(1.2mol/l)，3.0mltba溶液和0.2ml油酸，60℃水浴共热1h，水冷至室温，吸出油酸，用10.0ml正丁醇萃取，静置5min，测量上层溶液荧光强度i1。加入不同浓度的曲酸月桂酸酯0.5ml，于ex＝543nm处测量其荧光强度is，未加清除剂的空白体系荧光强度为io，实验选择激发波长为543nm，光谱带宽为10nm.按以下公式计算抑制率i：
i＝[(i1-is)/(i1-io)]×100％
表1抗氧化剂抑制脂质过氧化能力
丙二醛可用来反映生物体内脂质过氧化状态及机体受损伤的程度。根据上述实验结果，曲酸不具有抑制脂质过氧化能力，而曲酸月桂酸酯具有较强的脂质过氧化抑制能力，且随着浓度的增大，抑制作用不断增强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应该视为本发明的保护范围。