2‑氨基‑4‑(3‑氟甲基苯)‑3‑氰基‑5‑氧代‑4H,5H‑吡喃酮及其应用的制作方法

本发明涉及2-氨基-4-(3-氟甲基苯)-3-氰基-5-氧代-4h,5h-吡喃酮化合物及其抗细菌生物膜应用。

背景技术：

以金黄色葡萄球菌等形成的生物膜是具有机体构造的细菌菌落粘附在物体表面，包裹在自分泌的含水聚合性基质中，形成膜状的结构。由生物膜相关的病原体引起的感染难以根除，容易引发严重的并发症。美国疾病控制与预防中心研究表明，约80％的细菌感染与细菌生物膜相关，在美国每年约新增加1700万生物膜相关的感染患者。在医疗环境中，常见的细菌生物膜主要有心脏瓣膜等体内医疗移植物和埋植剂、气管导管和透析机等诊疗设备、慢性病伤口、外科病房和医院物表、换气系统和供水系统等。在细菌生物被膜的保护下，病原菌难以彻底清除，导致临床感染迁延不愈。

吡喃酮是吡喃的酮类衍生物，是一类六元的含氧杂环化合物，具有广泛的药理活性，如抗氧化、抗肿瘤、抗真菌活性等。在医药领域，吡喃酮类化合物治疗效果明确、毒副作用低、是一类潜在的重要先导化合物，目前对此类化合物的化学结构修饰和改造已经成为全球新药研发的重要研究热点之一，正不断被开发和应用，具有巨大的临床应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供2-氨基-4-(3-氟甲基苯)-3-氰基-5-氧代-4h,5h-吡喃酮，该化合物的结构式如式ⅰ所示：

本发明的另一目的在于提供上述化合物用于制备抗金黄色葡萄球菌生物膜制剂的应用。

本发明的化合物对金黄色葡萄球菌生物膜形成具有较强的抑制作用。

附图说明

图1为本发明的化合物1的核磁共振图谱；

图2为本发明的化合物2的核磁共振图谱；

图3为本发明的化合物3的核磁共振图谱；

图4为本发明的化合物4的核磁共振图谱；

图5为本发明的化合物5的核磁共振图谱；

图6为本发明的化合物6的核磁共振图谱；

图7为本发明的化合物7的核磁共振图谱；

图8为本发明的化合物8的核磁共振图谱；

图9为化合物4体外抗金黄色葡萄球菌生物膜活性结晶紫染色结果；

图10为化合物4体外抗金黄色葡萄球菌生物膜活性荧光染色；

图11为化合物4体内抗金黄色葡萄球菌生物膜活性作用。

具体实施方式

发明人合成了的系列新型吡喃类化合物，并针对临床容易形成生物膜的金黄色葡萄球菌，评价化合物抑制细菌生物膜形成的活性。

本发明化合物的合成路线及方法为：

a：将适量的4-羟基香豆素，丙二腈和不同取代基的芳香醛按照1:1:1摩尔混合后加热至溶解；

b：加入催化量的4-二甲氨基吡啶,加热回流3-4小时；

c：冷却后固体析出，抽滤，固体再用无水乙醇重结晶，最终得纯品。

实施例：

该实施例合成通式如式ⅱ所示的化合物：

其中：r＝3-f,2-cn,3-pho,3-cf3,2-no2,4-no2,2-och3,4-sch3。

合成方法为：

a：在250ml三口烧瓶中将适量的4-羟基香豆素，丙二腈和不同取代基的芳香醛按照1:1:1摩尔混合后加热至溶解；

b：加入催化量的4-二甲氨基吡啶,加热回流3-4小时；

c：冷却后固体析出，抽滤，固体再用无水乙醇重结晶，最终得纯品。

结构鉴定：

利用质谱(ms)、核磁共振波谱(nmr)、红外吸收光谱(ir)和紫外吸收光谱(uv)等有机波谱，对上述合成的系列新型吡喃类化合物进行分子量、结构和纯度等鉴定。

鉴定结果为：

化合物1：

2-amino-4-(3-fluorophenyl)-3-cyano-5-oxo-4h,5h-pyrano[3,2c]chromene:

¹hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.893-7.916(q,1h),7.707-7.751(m,1h),7.465-7.524(m,4h),7.340-7.395(m,1h),7.081-7.146(m,3h),4.522(s,1h).

化合物2：

2-amino-4-(2-cyanophenyl)-3-cyano-5-oxo-4h,5h-pyrano[3,2c]chromene:

¹hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.908-7.931(q,1h),7.814-7.836(q,1h),7.728-7.771(m,1h),7.642-7.683(m,1h),7.451-7.584(m,6h),4.822(s,1h).

化合物3：

2-amino-4-(3-phenoxyphenyl)-3-cyano-5-oxo-4h,5h-pyrano[3,2c]chromene:

¹hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.879-7.899(d,1h),7.707-7.747(t,1h),7.451-7.519(m,4h),7.300-7.392(m,3h),7.112-7.149(t,1h),6.978-7.041(m,4h),6.821-6.841(d,1h),4.477(s,1h).

化合物4：

2-amino-4-(3-trifluoromethylphenyl)-3-cyano-5-oxo-4h,5h-pyrano[3,2c]chromene:

¹hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.902-7.926(q,1h),7.713-7.756(m,1h),7.467-7.659(m,8h),4.654(s,1h).

化合物5：

2-amino-4-(2-nitrophenyl)-3-cyano-5-oxo-4h,5h-pyrano[3,2c]chromene:

¹hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.898-7.917(d,2h),7.707-7.750(m,1h),7.641-7.679(q,1h),7.588(s,2h),7.456-7.562(m,4h),5.248(s,1h)

化合物6：

2-amino-4-(4-nitrophenyl)-3-cyano-5-oxo-4h,5h-pyrano[3,2c]chromene:

¹hnmr(dmso-d6,δ,ppm):8.175-8.196(d,2h),7.910-7.933(q,1h),7.723-7.766(m,1h),7.475-7.611(m,6h),4.682(s,1h).

化合物7：

2-amino-4-(3-methoxyphenyl)-3-cyano-5-oxo-4h,5h-pyrano[3,2c]chromene:

¹hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.890-7.913(q,1h),7.697-7.736(q,1h),7.424-7.516(m,4h),7.219-7.259(t,1h),6.800-6.841(q,3h),4.432(s,1h),3.726(s,3h).

化合物8：

2-amino-4-(4-methylsulfanylphenyl)-3-cyano-5-oxo-4h,5h-pyrano[3,2c]chromene:

¹hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.889-7.913(q,1h),7.701-7.744(m,1h),7.427-7.521(m,4h),7.204(s,4h),4.425(s,1h),2.451(s,3h).

实施例合成化合物体外抗金黄色葡萄球菌生物膜活性的测定：

试验中所用金黄色葡萄球菌菌株来自美国模式培养物研究所(americantypeculturecollection,atcc)。

(1)结晶紫染色实验过程如下：

a：分别从划线培养的m-h琼脂培养基上挑取不同实验菌株的单克隆菌落，接种于4ml的tsb培养基中，以220r/min，37℃的条件培养至对数生长期。

b：在96孔板每孔中加入100μl的m-h肉汤培养基，吸取100μl的菌液加入第1孔中吹打混匀后吸取100μl加入第2孔中，依次类推，最后1孔混匀后吸取100μl弃去。

c：在酶标仪上选定630nm检测，记录od630值为0.1时菌液所稀释的倍数(此时菌液浓度约为10⁸cfu/ml)，将菌液用含2％葡萄糖的tsb培养基稀释至相对应的倍数后再按1：100的比例向菌液稀释至10⁶cfu/ml。

d：向96孔板每孔分别加入tsb溶解的浓度为4μg/ml上述各化合物100μl后，加入已制备的浓度为10⁶cfu/ml的菌液100μl，取一排孔加入200μl含2％葡萄糖的tsb培养基作为空白对照，将96孔板放入37℃孵箱恒温孵育24h。

e：吸去上清，用0.01m的pbs洗三遍，每孔加入150μl甲醇固定30min，轻柔弃去甲醇，加入150μl1％的结晶紫溶液染色15min。

f：轻柔吸去结晶紫溶液，用0.01m的pbs轻洗3遍，放入烘箱烘干，每孔加入33％冰醋酸溶液150μl，使用酶标仪在630nm处测吸光度。

将没有经过化合物处理的细菌作为空白对照组(control)，和对照组相比，化合物4在浓度为4μg/ml时，对生物膜的形成具有显著的抑制作用(**p<0.01)，如图9所示。

(2)荧光染色实验过程如下：

a：取指数生长期耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)usa300，用含有0.5％葡萄糖的tsb培养基稀释后接种到24孔板，每孔1ml。

b：向24孔板每孔中加入2μg/ml、4μg/ml和8μg/ml的化合物4，对照孔不加化合物，培养24h。

c：向每孔中加入10mg/ml异硫氰酸荧光素(fitc)染料孵育细菌2h,离心后弃上清液，用pbs缓冲液漂洗细菌3次。

d：荧光显微镜488mm波长处观察细菌生物膜的形态。

和空白对照组相比，化合物4呈浓度依赖性抑制生物膜的形成，如图10所示。a:空白对照组，b:2μg/ml化合物4处理组，c:4μg/ml化合物4处理组，d：8μg/ml化合物4处理组。

实施例合成化合物体内抗金黄色葡萄球菌生物膜活性的测定：

(1)扫描电镜观察化合物对细菌体内生物膜影响的过程如下：

a：挑取细菌单克隆于肉汤培养基中37℃，220rpm摇菌过夜。

b：次日使用含有0.5％葡萄糖的tsb培养基稀释到10⁶cfu备用。

c：sd大鼠使用戊巴比妥钠麻醉后固定进行腹部脱毛。剪开腹直肌暴露膀胱后，将无菌塑料插管置于膀胱中并向膀胱中注射1×10⁶cfu/ml菌液200μl。

d：金黄色葡萄球菌感染后3h分别对阴性对照组和实验组腹腔注射tsb培养基与化合物4(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg)进行治疗。

e：感染后第三天将大鼠麻醉处死，对其腹部消毒后剪开膀胱取出植入插管。使用无菌pbs清洗2遍，洗去浮游菌和杂质。将插管置于500μl3％戊二醛中20-24h以上，完成后续样本处理后使用jem-2000ex扫描电镜进行生物膜的观察。

和空白对照组相比，化合物4呈剂量依赖性抑制膀胱植入性塑料插管上金黄色葡萄球菌生物膜的形成，如图11所示，a:空白对照组，b:1mg/kg化合物4处理组，c:2mg/kg化合物4处理组，d：4mg/kg化合物4处理组。