一种毒死蜱抗原及其制备方法与流程

本发明涉及生物化工技术领域，尤其涉及一种毒死蜱抗原及其制备方法。

背景技术：

毒死蜱[chlorpyrifos，o,o-二乙基-o-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫逐磷酸酯]，商品名为毒死蜱、乐斯本、白蚁清等，毒死蜱原药为白色颗粒状晶体，室温下稳定，有硫醇气味，比重1.398(43.5℃)，熔点41.5～43.5℃，在水中的溶解度为1.2×10^-5g/kg，溶于大多数有机溶剂。通过触杀、胃毒和熏蒸三种作用方式防治粮食、果树、蔬菜和其他经济作物的害虫，经过皮肤、呼吸道以及肠胃吸收等途径进入人体后，可与胆碱酯酶迅速结合，形成磷酰化胆碱酯酶，使其失去催化水解乙酰胆碱的能力，导致大量的乙酰胆碱在体内蓄积，并抑制仅有的乙酰胆碱酯酶活力，使中枢神经系统及胆碱能神经过度兴奋而出现中毒症状，长期作用人体还可引起致畸、致癌、致突变危害。

毒死蜱目前广泛地应用于农业生产上，作为一种广谱型有机磷酸酯类杀虫剂，是甲胺磷和甲基对硫磷等高毒农药的新型高效、低毒替代品种之一，也是安全农产品农药残留监控的重要品种；而且，环境样品中发现毒死蜱残留的情况也日趋严重，对人们的健康构成了潜在的威胁。农药残留对食品安全造成了严重威胁，农药残留量的快速检测技术受到人们越来越广泛的关注。

目前国内检测农残的方法多为气相色谱和液相色谱法，这些方法不仅需要昂贵的仪器，而且样品预处理繁琐，不能满足现场快速测定农残的需要。因此，研究一种农药残留的快速测定方法具有重要的意义。免疫分析技术是近年来发展起来的检测农残新方法，具有简便、快速、灵敏和特异性强等优点。其中，酶联免疫吸附测定技术enzyme-linkedimmunosorbentassay(elisa)，是将免疫技术与现代测试手段相结合而建立的一种超微量的测定方法，具有成本低、速度快、灵敏度高、仪器设备简单的特点，适合大批量样品的快速分析。而免疫学检测方法的基础是相应的高特异性、高亲和力的抗体的制备，而毒死蜱作为小分子化合物，本身不具备免疫原性，因此，其半抗原的结构改造和全抗原合成是建立免疫速测技术的关键和难点之一。

技术实现要素：

鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种毒死蜱抗原及其制备方法，本发明所提供的毒死蜱抗原的合成方法简单，纯度高、产量高，对于毒死蜱抗体的制备以及毒死蜱农药残留检测具有重要价值。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种毒死蜱半抗原，所述毒死蜱半抗原的化学结构式如式(i)所示：

第二方面，本发明还提供了如第一方面所述的毒死蜱半抗原的制备方法，其包括如下步骤：

将毒死蜱与巯基丙酸按照1:(2～2.5)的摩尔比反应，得到所述毒死蜱半抗原。

本发明中所述毒死蜱半抗原的反应路线如下所示：

本发明中，所述毒死蜱与巯基丙酸的摩尔比为1:(2～2.5)，例如1:2、1:2.05、1:2.1、1:2.15、1:2.2、1:2.25、1:2.3、1:2.35、1:2.4、1:2.45或1:2.5。

优选地，所述毒死蜱与巯基丙酸的反应在有机溶剂中进行。

优选地，所述有机溶剂为含有naoh的乙醇溶液。

优选地，所述反应的时间为2～4h，例如2h、2.2h、2.5h、3h、3.2h、3.5h或4h。

优选地，所述毒死蜱半抗原的制备方法可以具体包括如下步骤：

(1)向毒死蜱的乙醇溶液中边搅拌边加入naoh，再加入巯基丙酸的乙醇溶液，毒死蜱与巯基丙酸的摩尔比为1:(2～2.5)，回流反应2～4h；

(2)反应完全后，抽滤出固体，滤液旋转蒸发干，残余物中加入5％的nahco3溶液，用正己烷萃取，弃去有机相，水相用盐酸调ph值至3～4，再用二氯甲烷萃取三次，有机相用无水naso4干燥过夜后，旋转蒸发干，过硅胶柱纯化，得到所述毒死蜱半抗原。

第三方面，本发明还提供了一种毒死蜱抗原，所述毒死蜱抗原由第一方面所述的毒死蜱半抗原与载体蛋白偶联得到。

优选地，所述毒死蜱半抗原与载体蛋白通过酰胺键偶联。

优选地，所述毒死蜱半抗原与载体蛋白偶联的摩尔比为(25～30):1，例如25:1、25.5:1、26:1、26.5:1、27:1、27.5:1、28:1、28.5:1、29:1、29.5:1或30:1，优选为30:1。

优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(bsa)。

优选地，所述毒死蜱抗原的化学结构式如式(ii)所示：

第四方面，本发明还提供了如第三方面所述的毒死蜱抗原的制备方法，其包括以下步骤：

将所述毒死蜱半抗原、载体蛋白、三正丁胺和氯甲酸异丁酯在硼酸盐缓冲液中反应，得到所述毒死蜱抗原。

优选地，所述载体蛋白、毒死蜱半抗原、三正丁胺、氯甲酸异丁酯和硼酸盐缓冲液的配比为：100mg:0.09mol:23μl:11μl:5ml。

优选地，所述硼酸盐缓冲液的ph值为8.5，其浓度为0.1mol/l。

与现有技术方案相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明所提供的毒死蜱抗原的合成方法简单，一步反应即可完成制备，并且制得的毒死蜱抗原纯度高，产量高，其对于毒死蜱抗体的制备以及毒死蜱农药残留检测具有重要价值。

附图说明

图1是实施例1制备得到的毒死蜱半抗原的esi图谱；

图2是实施例1制备得到的毒死蜱半抗原与载体蛋白通过酰胺键偶联后的紫外扫描图。

下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等。如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的ph值为8.5、浓度为0.1mol/l硼酸盐缓冲液的配方如下：称2.84g硼酸、5.15g硼砂，用蒸馏水定容至1l。

下述实施例中所使用的ph值为7.4、浓度为0.01m磷酸盐缓冲液配方如下：称7.9gnacl、0.2gkcl、0.24gkh2po4和1.8gk2hpo4，溶于800ml蒸馏水中，用hcl调节溶液的ph值至7.4，最后加蒸馏水定容至1l。

实施例1毒死蜱半抗原的制备

毒死蜱半抗原的合成过程如下：

毒死蜱半抗原的合成方法，包括以下步骤：

在100ml反应瓶中，称取1.75g(5mmol)毒死蜱溶于25ml乙醇，称取0.53g(5mmol)巯基丙酸溶于25ml乙醇，滴加到毒死蜱溶液中，并加入0.71gnaoh，回流反应3h，tlc监测反应过程。反应完成后，抽滤出白色固体，滤液旋干溶剂后，加入25ml5％nahco3溶解，用2*50ml正己烷萃取，收集水相。水相用6mhcl调ph值至2～3，再用二氯甲烷3*50ml萃取，收集有机相，有机相用无水硫酸钠干燥过夜。抽滤出固体，旋干有机相，过硅胶柱。洗脱液为正己烷:乙酸乙酯＝8:1，收集产品部分，旋干收集液，得到的产品即为毒死蜱半抗原，其化学结构式如式(i)所示。

图1是本实施例制备得到的毒死蜱半抗原的esi图谱，该合成产物的esi分子离子峰为442.1(m+23)，402.3为去掉羟基后的离子峰，由此可以看出毒死蜱半抗原已被成功合成。

实施例2毒死蜱人工抗原的制备

1、毒死蜱人工抗原的制备

取30mg由实施例1制备的毒死蜱半抗原30mg(0.071mmol)，溶于1.5mldmf中，4℃搅拌下加入18μl三正丁胺，反应30min后，加入9μl氯甲酸异丁酯，室温反应1h，反应完毕后成为a液；称取bsa79mg，溶于硼酸盐缓冲液中，称为b液；将a液逐滴加入到b液中，边加边搅拌，置室温(25℃)下磁力搅拌反应过夜(12h)，离心后取上清，4℃0.01m，ph7.4磷酸盐缓冲液中透析3天，每天更换透析液2次，得到毒死蜱人工抗原，冷冻保存。

2、毒死蜱人工抗原的鉴定

将上述产物用0.01m，ph7.4磷酸盐缓冲液配成溶液进行紫外(200～400nm)扫描，完全抗原紫外光谱在277.5nm处有特征吸收峰，牛血清白蛋白(bsa)在264.5nm有特征吸收峰，而半抗原在250nm处有特征吸收峰，完全抗原的紫外吸收图谱不同于原载体蛋白和半抗原的紫外扫描图谱，说明毒死蜱半抗原与载体蛋白成功偶联(见图2)。

通过上述结果可以看出，本发明成功制备得到了毒死蜱人工抗原，其合成方法简单，一步反应即可完成制备，并且制得的毒死蜱抗原纯度高，产量高，其对于毒死蜱抗体的制备以及毒死蜱农药残留检测具有重要价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。