聚酰胺‑胺树状大分子与纳米金颗粒的复合物作为非病毒载体进行基因转染的应用方法与流程

本发明涉及一种聚酰胺-胺树状大分子与纳米金颗粒的复合物作为非病毒载体进行基因转染的应用方法，特别涉及一种聚乙二醇和叶酸修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒作为非病毒载体进行基因转染及免疫安全性研究的应用方法，属于功能化高分子纳米材料基因转染载体技术领域。

背景技术：

基因治疗是指通过基因水平的操作而达到治疗或预防疾病的方法。目前，基因治疗主要是针对严重威胁人类健康的疾病进行治疗，癌症是其主要应用领域。基因治疗技术如今发展迅速，部分基因治疗方案已经进入临床试验阶段。在临床试验时，发现了很多安全隐患，比如其安全性、靶向性、转移效率较低等问题尚未解决。

目前，在基因载体系统中主要分为两部分，病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体由于其高效的转染效率从而应用于临床上的基因治疗。但是由于其体积小，所以运载基因的数量有限，而且容易产生基因突变和免疫原性。然而，非病毒载体的生物安全性好，免疫原性低。其与脂质体、多聚物和dna复合物等产品的相继出现，促使非病毒载体在基因治疗中的广泛应用。

非病毒载体系统中，树状大分子能作为一种理想的纳米材料应用于基因传递系统。其区别于传统的线性聚合物类纳米材料，具有独特的高度支化三维立体结构，有良好的单分散性。树状大分子经过各种表面化修饰，如聚乙二醇化、乙酰化和烷基化等，产生了不同的理化性质。研究表明，第五代树状大分子有一定的细胞毒性，但是与纳米金颗粒形成复合物[shany.，luot.，pengc.，etal.，genedeliveryusingdendrimer-entrappedgoldnanoparticlesasnonviralvectors[j].biomaterials，2012，33(10)：p.3025-3035.]会降低载体的毒性。xiao等[xiaot.，houw.，caox.，etal.，dendrimer-entrappedgoldnanoparticlesmodifiedwithfolicacidfortargetedgenedeliveryapplications.biomaterialsscience，2013，1(11)：p.1172.]将叶酸修饰到第五代树状大分子(pamam)表面，与基因在特定比例下产生了更高的基因转染效率。

从分子生物学角度分析基因转染的免疫安全性，其中实时荧光定量反转录pcr技术是基因转录水平上检测基因表达量的重要检测手段，在生物医学领域应用广泛。实时荧光定量反转录pcr技术一般采用2^-△△ct法，计算实验组与对照组中基因的相对表达量。公式是△△ct＝(ct目的基因-ct对照基因)实验组-(ct目的基因-ct对照基因)对照组，ct值是荧光信号达到阈值时的体系循环数目。

检索国内外相关文献和专利结果表明：聚乙二醇和叶酸共同修饰聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒作为基因载体进行基因转染，运用实时荧光定量反转录pcr技术对基因转染后的免疫安全性检测尚未见报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种聚酰胺-胺树状大分子与纳米金颗粒的复合物作为非病毒载体进行基因转染的应用方法，得到的复合物能具有良好生物相容性、细胞免疫安全性以及高效基因转染效率，在恶性肿瘤的基因治疗等方面有较好的应用前景。

为了解决上述问题，本发明提供了一种聚酰胺-胺树状大分子与纳米金颗粒的复合物作为非病毒载体进行基因转染的应用方法，其特征在于，所述树状大分子的表面是氨基末端，对其进行化学修饰可降低其毒性并提高转染效率；其末端连接靶向基团包括叶酸，rgd，透明质酸，能高效地进行基因传递。

优选地，所述化学修饰的方法为修饰聚乙二醇、修饰环糊精、乙酰化和烷基化的方法中的任意一种或几种。

优选地，所述复合物中au与g5.nh2摩尔比为25∶1及以上。

更优选地，所述复合物中au与g5.nh2摩尔比为25∶1、50∶1、75∶1或100∶1。

优选地，所述复合物在基因转染体系中的浓度为1.0～2.0mg/ml。

优选地，所述基因传递的传递外源治疗基因包括pdna，cpgdna，反义核苷酸，sirna及ssdna中的任意一种或几种。

更优选地，所述基因传递的外源治疗基因的目标细胞包括癌细胞及体细胞。

更优选地，所述癌细胞包括hela，u87及a549；所述体细胞包括巨噬细胞，t淋巴细胞，b淋巴细胞，树突状细胞。

更优选地，所述复合物与dna的n/p比为0.5∶1及以上。

更优选地，所述复合物与dna的n/p比为0.5∶1、1∶1、2.5∶1、5∶1或7∶1。

更优选地，所述pdna是从大肠杆菌(e.colidh5α菌株)中提取的，质粒为携带卡那霉素抗性基因并带有绿色荧光蛋白报告基因的质粒；所述cpgdna是由人工合成，序列为5’-tccatgacgttcctgatgct-3’。

优选地，所述基因转染的转染时间为4～12h。

优选地，所述聚酰胺-胺树状大分子与纳米金颗粒的复合物的制备方法包括以下具体步骤：

步骤1)：{(au⁰)50-g5.nh2-mpeg10}的合成：将mpeg(相对分子质量为2000)溶解于dmso中，edc与mpeg按照摩尔比10∶1的比例均匀混合，反应30-40min，再加入与edc等比例的nhs反应3-4h；将活化好的mpeg与g5.nh2的dmso溶液按照摩尔比10∶1的比例混合72-84h；在上述反应的产物中按照树状大分子与金摩尔比为1∶50的量加入氯金酸haucl4反应30min；然后加入nabh4使其还原，搅拌条件下反应3-4h；将反应液透析3-4天，最后经冷冻干燥得到样品{(au⁰)50-g5.nh2-mpeg10}，记作s1；

步骤2)：{(au⁰)50-g5.nh2-peg10-fa5}的合成：将fa和edc按照摩尔比1∶0.9比例均匀混合，反应30-40min，再加入与edc等比例的nhs反应3-4h；将peg与活化好的fa按照摩尔比1∶2比例加入到g5.nh2中，避光搅拌72-84h；再按照树状大分子与金摩尔比为1∶50加入haucl4反应30min，再迅速加入5倍量的nabh4使其还原，避光条件下搅拌3-4h；将反应液透析3-4天，最后经过冷冻干燥得到样品2{(au⁰)50-g5.nh2-peg10-fa5}，记作s2；其中haucl4溶液的浓度为30.15mg/ml；nabh4溶液的浓度为10mg/ml；edc浓度为9.7mg/ml；nhs浓度为5.05mg/ml；mpeg的浓度为4mg/ml；g5.nh2溶液的浓度为0.44μmol/ml，fa浓度为2mg/ml。

更优选地，所述步骤1)与步骤2)合成的两种样品作为载体应用于hela的基因转染的方法是按照聚酰胺-胺树状大分子与纳米金颗粒的复合物与pdna按照不同的n/p(树状大分子的伯氨基与pdna分子中的磷酸基团摩尔比)分别为1∶1、2.5∶1、5∶1制备载体与pdna的复合物；在37℃、5％co2条件下培养hela细胞，再加入前述三种n/p比的复合物/pdna复合体在细胞中基因转染4h。

优选地，采用实时荧光定量pcr仪或酶联免疫吸附法测定基因转染后的复合物或复合物与dna刺激免疫细胞分泌细胞因子的相对表达量。

更优选地，所述实时荧光定量pcr仪中pcr扩增的细胞因子为ifn-α、ifn-β、ifn-γ、il-1β、il-6、il-10、tnf-α和il-12中的任意一种或几种细胞因子。

更优选地，所述复合物在raw264.7(巨噬细胞)中基因转染4h后进行细胞因子il-6和tnf-α细胞因子检测，步骤1)与步骤2)制备的两种样品分别与pdna和cpgdna复合物进行基因转染，运用实时荧光定量反转录pcr检测raw264.7的细胞因子tnf-α和il-6的基因表达水平，用以检测基因转染是否引起细胞免疫反应。

更优选地，所述检测基因转染是否引起细胞免疫反应的具体步骤如下：

步骤a)：巨噬细胞总核酸的提取：以每1×10⁶个巨噬细胞种到6孔板中，向每孔加入复合物或复合物/dna复合体转染4h后，分别加入totalrnaextractor1ml；裂解的样品在室温下放置5-10min，加入0.2ml氯仿，剧烈振荡后放置3min，然后在12000rpm条件下离心10min；取上层水相至离心管，加入等体积异丙醇，混匀放置20min；在12000rpm条件下离心10min，移除上清液；再加入1ml75％的乙醇洗涤沉淀，在12000rpm离心3min，移除上清液；最后加30～50μlrnase-freeddh2o充分溶解rna，得到rna溶液；

步骤b)：制备反转录样品：参照市售反转录试剂盒说明书将以下试剂加入冰浴的pcr管：1μlrna模板，1μl引物，1μldntp(0.5mm)，rnase-freeddh2o10μl，轻轻混匀后离心5s；反应混合物在65℃温浴5min后，冰浴2min，然后离心3～5s；将pcr管冰浴，再加入试剂4μl的5倍反转录缓冲液，0.5μl核糖核酸酶抑制剂和1μl逆转录酶；再轻轻混匀后离心3～5s；在pcr仪上进行反转录反应：25℃孵育10min，50℃反应30min进行cdna合成，85℃反应5min进行终止反应，得到反转录样品；

步骤c)：pcr扩增：在冰浴条件下加入如下反应混合物，10μl2×superrealpremixplus，0.6μl上游引物(10μm)，0.6μl下游引物(10μm)，2.5μlcdna模板(稀释至10pm)，0.4μl50×rox，rnase-freeddh2o加至20μl；在95℃预变性15min，95℃变性10s，62℃退火及延伸32s，反应40个循环；最后仪器分析出扩增产物的标准动力学曲线和溶解曲线。

本发明以两种聚酰胺-胺树状大分子及其纳米金颗粒复合物为载体，携带质粒dna对hela细胞进行基因转染。通过核磁、紫外吸收测定、透射电子显微镜对复合物的物理化学特征进行表征；利用末端氨基定量试剂盒测定载体的末端氨基数目；cck-8检测载体与pdna复合物的细胞毒性；琼脂糖凝胶电泳技术确定载体完全结合基因的氮磷比；通过表面电势与水动力学粒径对载体与pdna复合物的电势和粒径进行了分析；绿色荧光蛋白的表达用来研究载体传递质粒dna的效率；流式细胞技术及激光共聚焦显微镜技术用来研究载体与基因复合物的细胞内吞效率和细胞定位；利用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应方法检测载体与基因复合物的免疫原性。本发明将mpeg与g5pamam表面氨基基团共价结合，可以通过中和其部分表面氨基以降低复合物的细胞毒性，并提高复合物的生物相容性。通过连接上叶酸，可以使复合物具有靶向性，提高了基因转染效率。

本发明制备的聚酰胺-胺树状大分子及其纳米金颗粒复合物具有良好的基因转染效果；转染过程易于操作，生物相容性好，免疫原性低，为非病毒基因载体在基因传递上的应用提供参考。

附图说明

图1为实施例2中的复合物的核磁图谱；

图2为实施例3中的复合物的紫外吸收图谱；

图3为实施例4中的复合物的透射电子显微镜图及平均粒径尺寸图。3a为复合物s1(左上)和s2(左下)的透射电子显微镜图片；3b为复合物s1(右上)和s2(右下)的平均粒径尺寸图；

图4为实施例6中的复合物/pdna复合体的hela细胞毒性检测图；

图5为实施例7中的复合物/pdna复合体的琼脂糖凝胶电泳图谱；

图6为实施例8中的复合物/pdna复合体的表面电势图；

图7为实施例8中的复合物/pdna复合体的水动力学粒径图；

图8为实施例9中的复合物/pdna复合体对hela细胞的绿色荧光蛋白表达检测图；

图9为实施例10中的复合物/pdna复合体对hela细胞的细胞吞噬效率图；

图10为实施例11中的复合物/pdna复合体对hela细胞的胞内定位结果图；

图11为实施例12中的复合物/pdna复合体对raw264.7细胞毒性检测图；

图12为实施例13中的复合物/pdna复合体对raw264.7免疫原性检测标准动力学曲线；

图13为实施例13中的复合物/pdna复合体对raw264.7免疫原性检测溶解曲线；

图14为实施例13中的复合物对raw264.7细胞对raw264.7的免疫原性检测图；

图15为实施例13中的复合物和复合物/pdna复合体对raw264.7细胞的免疫原性检测图；

图16为实施例13中的复合物和复合物/cpgdna复合体对raw264.7细胞的免疫原性检测图；

图17为实施例1中的复合物合成步骤示意图，a为复合物s1的合成步骤，b为复合物s2的合成步骤。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

实施例1

称取20.25mg的mpeg(分子量为2000)溶解于dmso中，9.59mgedc与mpeg溶液按照摩尔比10∶1的比例均匀混合，再加入5.25mgnhs反应3h。将47.34mg的g5.nh2溶解于dmso溶液按照摩尔比10∶1的比例充分混合，反应72h。在上述反应的产物中按照树状大分子与金摩尔比为1∶50的量加入41.39mghaucl4反应30min，再加入18.9mgnabh4搅拌条件下反应3h。透析3天后经冷冻干燥得到{(au⁰)50-g5.nh2-mpeg10}，记录为s1(如图17a)。称取11.26mg的fa，4.4mg的edc和2.64mg的nhs按照1∶0.9∶0.9比例均匀混合。将20.25mg的peg与活化好的fa按照摩尔比1∶2比例加入到47.34mg的g5.nh2中，避光搅拌72h。再加入haucl4反应30min，迅速加入5倍量的nabh4使其还原，避光条件下搅拌3h。将反应液透析3天，最后经冷冻干燥得到{(au⁰)50-g5.nh2-peg10-fa5}，记录为s2(如图17b)。

实施例2

分别称取5mg的s1和s2分别溶于700ml的d2o中，对两种溶液进行超声，然后使用核磁共振波谱仪测定两种复合物的核磁氢谱。核磁结果如图1所示，¹hnmr图谱用于表征接到g5.nh2上的碳链的个数，g5.nh2特征基团的质子峰在化学位移2.0-3.5ppm之间，在3.4-3.6ppm之间出现的质子吸收峰，说明mpeg被成功的连接到g5.nh2上，在6.6-8.5ppm之间出现的质子吸收峰说明了fa被成功接到g5.nh2上。利用origin软件计算出质子峰的积分面积，得到平均每个g5.nh2表面连接大约10个mpeg，大约3.2个fa。结果表明按照预设的目标合成了{(au⁰)50-g5.nh2-mpeg10}和{(au⁰)50-g5.nh2-peg10-fa5}。

实施例3

将材料s1和材料s2分别溶解于超纯水中，配制成浓度为200μg/ml溶液，利用紫外-可见分光光度计检测在300nm-800nm波段范围内的紫外吸收值。紫外-可见分光光度检测结果如图2所示，复合物中g5.nh2在520nm处左右均有吸收峰，说明纳米金颗粒被成功包裹。在280nm处有吸收峰说明fa成功接到了g5.nh2上。

实施例4

将配制好的s1和s2水溶液(1mg/ml)滴到有碳膜的铜网表面，置于室温下干燥，制得样品。然后采用jem-2010f型透射电子显微镜在200kv下检测样品(图3a)。采用imagej软件进行测量并计算出样品尺寸，s1的平均尺寸(图3b)约2.9nm和s2的平均尺寸(图3b)约3.1nm。图中可看出制备的复合物呈球形，分散性较好。

实施例5

以宫颈癌细胞(hela)为模式细胞，实施例1制备得到的两种复合物末端氨基定氮检测。将s1和s2分别溶解于水中配制成2mg/ml的溶液，再根据初级氨基检测试剂盒(panopa)的实验方法测定复合物的表面氨基数目。实验步骤为：从试剂1中取一粒片状药品，用3ml超纯水溶解，配成溶液1。对照组中取50μl超纯水加入溶液1充分混匀，实验组中取待测复合物s1或s250μl加入溶液1充分混匀，反应3min后在吸光度为340nm处测量，分别记录吸光度a0和a1；再分别加入100μl溶液2充分混匀并反应15min，在吸光度为340nm处记录数据a2和a3。根据公式计算出样品中末端氨基氮的浓度(mg/l)。结果显示，经mpeg修饰后，末端氨基的数目为29.9。而在修饰mpeg再连接fa之后，末端氨基的数目为21.6，这可能是由于fa与氨基共价连接，从而减少pamam表面氨基的数目，以降低复合物的毒性。

实施例6

以宫颈癌细胞(hela)为模式细胞，实施例1制备得到的两种复合物/pdna复合体的细胞毒性检测。培养瓶中处于指数生长期的hela细胞用胰酶消化后收集，以6×10³细胞每孔的密度将hela细胞种于96孔板中。在含有10％fbs的200μldmem培养基中在37℃和5％co2条件下培养12h，换成含有50nm，100nm，500nm，1000nm，2000nm，3000nm不同浓度复合物的培养基，再加入1μgpdna复合物继续培养4h。将培养基换成无血清培养基培养24h，培养结束后，每孔加入10μlcck-8(5.0mg/ml)溶液，并在培养箱中孵育4h。孵育结束后，用酶联免疫检测仪测量450nm波长处各孔的吸光度。图4结果显示，随着复合物的浓度增加，细胞活力逐渐降低。但是载体与pdna复合物在hela细胞内的细胞存活率均在75％以上，表明两种复合物/pdna复合体的细胞毒性很低，有利于后续实验。

实施例7

以宫颈癌细胞(hela)为模式细胞，实施例1制备得到的复合物与质粒dna的结合能力一般采用琼脂糖凝胶电泳实验进行测定。按照氮磷比为0.25，0.5，1，2.5，5，7制备载体与pdna复合物，单独的pdna作为对照。称取0.5g琼脂糖加入至50mltris-硼酸电泳缓冲液(0.5×tbe)中混合。在微波炉中反复加热三次，每次约1min，直至琼脂糖溶解，且瓶中无气泡。待瓶中温度降低至50-60℃，往胶中加入4μl浓度为1mg/ml的溴化乙锭(eb)染料，摇匀倒入摆好梳子的胶槽内，等待约15min后拔掉梳子，准备上样。将载体与pdna复合物与上样缓冲液(6×loadingbuffer)混匀后分别加到琼脂糖凝胶的孔中，电压80v，时间30min。跑胶结束后用凝胶成像仪分析pdna在凝胶中的迁移情况。在不同n/p条件下，每个泳道中条带的分离状况表示不同浓度的复合物包裹基因的能力，图5是载体与pdna复合物的琼脂糖凝胶电泳图谱，图中显示复合物/pdna复合体在n/p为2.5时观察不到明显的dna条带，说明复合物/dna复合体没有向正极移动，具有较强的包裹能力，能压缩质粒dna。

实施例8

以宫颈癌细胞(hela)为模式细胞，将质粒dna与实施例1的方法制备的复合物按照三种氮磷比为1∶1，2.5∶1，5∶1，分别与1μgpdna共孵育得到载体与pdna复合物。复合物s1和s2与pdna复合体作为实验组，复合物s1和s2作为对照组。在室温条件下孵育30min后加入1毫升pbs缓冲液，然后采用激光粒度仪(malvern，uk)测定复合物的水动力学粒径和表面电势。测试是以he-ne为激光源，激光波长是633nm，入射角为90°，测量温度为25℃为实验条件，对复合物进行表征。结果显示，载体与pdna复合物的表面电势(图6)均为正，pdna的负电荷中和了复合物正电荷，正如图中两种载体与dna复合物的电势分别小于两种载体的电势。随着氮磷比的增加，复合物的表面电势也有增加的趋势，电势范围均在正常范围内，有利于复合物和细胞间相互作用，便于载体对目的基因的传递。载体与pdna复合物随着氮磷比增加，相互作用增强，粒径依次减小(图7)。当氮磷比为2.5时，粒径范围处于200nm与300nm之间，此时复合物容易进入细胞，利于细胞内基因传递。

实施例9

以宫颈癌细胞(hela)为模式细胞，实施例1制备得到的复合物传递含有egfp(增强型绿色荧光蛋白)基因的质粒dna的效率检测，荧光强度的大小反映出egfp基因的转染效率。

在24孔板上种密度为3.5×10⁴hela细胞每孔，在37℃和5％co2条件下培养12h，弃去旧培养基，加入新鲜无血清培养基培养。质粒和复合物按照n/p为1，2.5，5条件下混合，室温下避光放置20min，再加入孔板中进行基因转染4h。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。图8是复合物与pdna复合体在hela细胞中的绿色荧光蛋白表达检测图。结果显示，s2在上述三种n/p条件下，绿色荧光蛋白的表达量都比s1多。说明连接叶酸的靶向机制能有效的提高复合物的基因转染能力。在n/p为2.5时比n/p为5时细胞转染效率高，可能是由于n/p增大时，复合物与pdna的相互作用增大，从而导致pdna在细胞内难从复合物中释放出来，无法表达出相应的蛋白产物。当连接fa时，绿色荧光蛋白表达量增多，可以初步推测是fa靶向作用的结果。

实施例10

以宫颈癌细胞(hela)为模式细胞，实施例1的方法制备得到的复合物传递pdna的细胞内吞效率。以5×10⁴hela细胞每孔的密度种于24孔板中，在37℃和5％co2条件下培养12h。在实施例8上述三个n/p条件下，按照每孔加1gcy3标记的pdna和复合物进行混合，室温下避光放置20min，再加入孔板中进行基因转染4h，使载体与cy3-pdna复合物充分进入细胞。然后，用1ml灭菌的pbs重新悬浮细胞，并将待检测样品放在冰上。每组设定三个平行实验，用流式细胞仪对每个样品进行检测。每次测定细胞数量为1×10⁴每管，检测细胞释放的红色荧光，设定fsh-h/ssc-h为细胞门，设定fl2-h为cy3荧光通道，每组样品重复测定三次。图9是复合物与cy3标记pdna复合体在hela细胞中的细胞内吞实验，结果显示在n/p为2.5条件下，cy3激发的红色荧光信号强度最强。表明s1，s2在n/p为2.5时，显示出良好的细胞内吞效率。

实施例11

以宫颈癌细胞(hela)为模式细胞，实施例1的方法制备得到复合物s1，s2。通过胞内的共定位实验可以对audenps在作为基因转染载体时在胞内的传递途径与胞内定位情况进行研究，用cy3染料特异性标记pdna，与复合物形成复合体来转染hela细胞，从而可以确定他们是否具有相同的胞内传递途径以及进入细胞内以后的去向。以1×10⁵细胞每个孔的密度种在12孔板上，在37℃和5％co2条件下培养24h。换成无血清培养基，加入复合物与pdna复合体，孵化4h。孵化后，将复合物与pdna复合体吸出，用无菌pbs洗2遍，加入2.5％的戊二醛，在4℃下固定30min，dapi染料标记细胞核7min。然后用pbs清洗细胞三遍后，用激光共聚焦显微镜来观察和记录实验结果。图10是各复合物与cy3-pdna复合体在hela细胞中的细胞定位图。结果显示复合物与细胞经过4h的基因转染后，通过胞内传递途径将基因传递到细胞核周围，尤其是在n/p条件为2.5条件下，s2与cy3标记的pdna复合体大量集中在细胞质的细胞核周围，表明修饰了peg和fa没有影响复合物的生物学功能，还提高了基因转染效率。整体上，s2比s1的细胞内吞效率略高，与实施例10的结果一致。

实施例12

以巨噬细胞(raw264.7)为模式细胞，检测实施例1制备得到的复合物与pdna形成的复合体的细胞毒性。以6×10³细胞每孔的密度将raw264.7细胞种于96孔板中，在含有10％fbs的200μldmem培养基中在37℃和5％co2条件下培养12h，换成含有50nm，100nm，500nm，1000nm，2000nm，3000nm不同浓度梯度复合物的新鲜培养基，再加入1μgpdna复合物继续培养4h，每个梯度设定3个复孔。将培养基换成无血清培养基培养24h，培养结束后，每孔加入10μlcck-8(5.0mg/ml)溶液，并在培养箱中孵育4h。孵育结束后，用酶联免疫检测仪测量450nm波长处各孔的吸光度。图11结果显示，随着复合物的浓度增加，细胞活力逐渐降低。整体上，复合物与pdna复合体在巨噬细胞内的细胞存活率均在75％以上，表明复合物与pdna复合体的细胞毒性很低，有利于后续实验。

实施例13

巨噬细胞培养到指数生长期，用胰酶消化后收集，计数器计数后以6×10⁵细胞个/孔的密度种到6孔板中，加入培养基dmem约2ml；按照预设的n/p值为2.5配制两种复合物和dna的复合体。脂质体加入无血清培养基的细胞作为阳性对照组。实验步骤主要分为总rna提取、反转录、两步法pcr扩增反应。具体包括：

(1)巨噬细胞总核酸的提取：以每1×10⁶个巨噬细胞种到6孔板中，向每孔加入复合物或复合物/dna复合体转染4h后，分别加入totalrnaextractor1ml。裂解的样品在室温下放置5-10min，加入0.2ml氯仿，剧烈振荡后放置3min，然后在12000rpm条件下离心10min。取上层水相至离心管，加入等体积异丙醇，混匀放置20min。在12000rpm条件下离心10min，移除上清液。再加入1ml75％的乙醇洗涤沉淀，在12000rpm离心3min，移除上清液。最后加30～50μlrnase-freeddh2o充分溶解rna，得到rna溶液。

(2)制备反转录样品：将冰浴的pcr管中加入以下试剂：提取的rna，1μl引物，1μldntp(0.5mm)，rnase-freeddh2o约10μl，轻轻混匀后离心5s。反应混合物在65℃温浴5min后，冰浴2min，然后离心3～5s。将pcr管冰浴，再加入试剂4μl的5倍反转录缓冲液，0.5μl核糖核酸酶抑制剂和1μl逆转录酶。再轻轻混匀后离心3～5s。在pcr仪上进行反转录反应：25℃孵育10min，50℃反应30min进行cdna合成，85℃反应5min进行终止反应，得到反转录样品。

(3)pcr扩增：在冰浴条件下加入如下反应混合物，10μl2×superrealpremixplus，0.6μl上游引物(10μm)，0.6μl下游引物(10μm)，2.5μlcdna模板(稀释至10pm)，0.4μl50×rox，rnase-freeddh2o加至20μl。在95℃预变性15min，95℃变性10s，62℃退火及延伸32s，反应40个循环。最后用abi7500仪器对产物进行分析，系统根据荧光值的变化规律生成标准动力学曲线(图12)和溶解曲线(图13)。其中标准曲线呈现规则的s型。三组溶解曲线分别检测内参gapdh，细胞因子il-6和tnf-α，每个溶解曲线呈现出一个峰且无杂峰，表明扩增产物均一。结果采用△△ct法计算出实验组与对照组的相对荧光强度。图14是用qrt-pcr检测复合物作用于免疫细胞中细胞因子mrna表达量。未作处理的正常细胞作为对照组。两种复合物与巨噬细胞共培养，再用反转录实时定量pcr试剂盒采用两步法反应程序扩增出pcr产物。图中结果表明单独复合物不会引起免疫细胞分泌出以上两种细胞因子，说明制备的复合物不会引起相应的免疫应答，免疫安全性高。图15是qrt-pcr检测复合物与pdna复合体作用于巨噬细胞中细胞因子mrna表达量。巨噬细胞中加入pdna作为阴性对照组。在n/p为2.5条件下，复合物和pdna孵育4h进行转染，转染结束后再用反转录实时定量pcr扩增出pcr产物，计算出相对荧光强度。结果表明经过质粒dna基因转染后，巨噬细胞也没有产生细胞因子，说明复合物与pdna复合体的基因转染过程免疫安全性高，免疫原性好。图16是qrt-pcr检测复合物与cpgdna复合体作用于巨噬细胞中细胞因子mrna表达量。巨噬细胞中加入cpgdna作为阴性对照组。复合物和cpgdna孵育4h进行转染，转染结束后再用反转录实时定量pcr扩增出pcr产物。因为cpgdna是强免疫激活剂，所以与上述两组实验相比，相对荧光表达量高，进一步说明复合物与pdna复合体基因转染过程的免疫原性低，生物安全性高。