本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段检测致病菌的方法，具体为一种用于检测水产品中副溶血弧菌的分子标记及其应用。
背景技术：
副溶血弧菌是水产品中引起食物中毒的重要病原菌之一，在海产品中的携带率高达45。7％。在我国沿海地区，由副溶血弧菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒事件首位，其中也包括台湾省；在日本，由该菌引起的食物中毒占第二位。所以，副溶血弧菌是食品安全检测中的一项重要指标。但目前法定的副溶血弧菌检测方法仍然是传统培养方法，操作繁琐、费时、费力，常常需要5～6天才能完成，而且鉴定副溶血弧菌的生化指标非常不稳定，常常需要重复实验才能最终确定是否为副溶血弧菌，此类方法已不能满足目前对大量食品样品快速检测的需求，急切需要建立一种快速、有效的检测方法。
基于聚合酶链式反应的检测方法具有灵敏、特异、快速等优点，因此，日益受到重视，并逐渐开始应用于副溶血弧菌的检测。检测靶点是分子检测方法的关键，目前，用于副溶血弧菌pcr检测的靶点在其他弧菌中也普遍存在，且同源性非常高，极易产生假阳性结果。此外，pcr检测还易出现假阴性结果，这主要是由于抑制剂的存在等因素造成的。pcr技术虽然在不断的得到发展与改进，但目前仍然没有找到消除抑制剂的有效方法，极大程度上限制了该技术在实际检测工作中的应用。
技术实现要素：
本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种能够避免水产品中副溶血弧菌检测过程中出现假阳性或假阴性结果，提高检测结果的准确性，本发明提供了一种用于检测水产品中副溶血弧菌的分子标记及其应用。
技术方案：一种用于检测水产品中副溶血弧菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
优选的，所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰。
表1分子标记序列
所述的分子标记在制备检测水产品中副溶血弧菌试剂盒中的应用。
优选的，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。
优选的，所述试剂盒检测水产品副溶血弧菌的步骤包括：
(1)取样：提取水产品样品的基因组dna；
(2)以步骤(1)提取的dna作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50～500倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；
(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10～50倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；
(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
优选的，所述甘蔗叶片样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。
优选的，所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。
优选的，所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
优选的，所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
优选的，所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
有益效果：(1)本发明所述分子标记具有特异性好的优点，能够避免水产品中副溶血弧菌检测过程中出现假阳性或假阴性结果，提高检测结果的准确性；(2)本发明所述分子标记灵敏度高，提高了pcr检测副溶血弧菌的可信度，为水产品中副溶血弧菌的检测提供方便、准确、有效的方法。
附图说明
图1是实施例1～3检测结果图；
其中，m为分子量为2000bp的maker；1为实施例1pcr产物电泳结果；2为实施例2pcr产物电泳结果；3为实施例3pcr产物电泳结果。
具体实施方式
实施例1
一种用于检测水产品中副溶血弧菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰。
所述的分子标记在制备检测水产品中副溶血弧菌试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。
所述试剂盒检测水产品副溶血弧菌的步骤包括：
(1)取样：提取水产品样品的基因组dna；
(2)以步骤(1)提取的dna作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；
(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释50倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；
(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述甘蔗叶片样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。
所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。
所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
实施例2
一种用于检测水产品中副溶血弧菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰。
所述的分子标记在制备检测水产品中副溶血弧菌试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。
所述试剂盒检测水产品副溶血弧菌的步骤包括：
(1)取样：提取水产品样品的基因组dna；
(2)以步骤(1)提取的dna作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释250倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；
(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释25倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；
(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述甘蔗叶片样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。
所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。
所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
实施例3
一种用于检测水产品中副溶血弧菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰。
所述的分子标记在制备检测水产品中副溶血弧菌试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。
所述试剂盒检测水产品副溶血弧菌的步骤包括：
(1)取样：提取水产品样品的基因组dna；
(2)以步骤(1)提取的dna作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释500倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；
(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；
(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述甘蔗叶片样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。
所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。
所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
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