本发明涉及生物医用材料技术领域，特别涉及一种水溶性胶原的提取方法。
背景技术：
胶原种类较多，常见类型为ⅰ型、ⅱ型、ⅲ型、ⅴ型和ⅺ型，胶原因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，而广泛应用于食品、保健品、医用生物材料、组织工程、化妆品等领域。在医学领域中，胶原由于具有低免疫原性、纤维的再形成性、机械性能高和生物可降解性等优点，先后制成了医用胶原海绵、膜性生物补片、人工皮肤、美容填充植入剂、化妆品等。
目前胶原提取方法提出的胶原溶解性多为酸溶或碱溶，这给制备适合人体需要的中性生物材料的制备带来不小的麻烦。因此需要一种能在不破坏胶原原有三螺旋结构的情况下，能溶解于水的胶原。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供一种水溶性胶原的提取方法，能够保证完整的三股螺旋结构的情况下去除末端肽，且通过此方法制备的胶原能溶解于水。技术方案如下：
本发明提供了一种水溶性胶原的提取方法，包括以下步骤，
先对富含iii型胶原的组织进行切片；
再将切片组织清洗浸泡在0.1%~40%(w/v)的碱溶液中，浸泡0.5~24h。清洗至ph为5~8后生理盐水浸泡约0.5-48h，沥去多余水分，2~8℃组织捣碎后分散进酶解液中，2~40℃环境酶解1~72h；酶解完毕后调ph值至7~13，2-40℃静置2~24h；30~150目滤网过滤，去除未酶解物。20%-50%(w/v)盐溶液盐析，收集固形物，截留分子量为4000~8000的透析袋透析，去除多余离子和杂质，获得多型胶原，最后将多型胶原混合物分散至水中，调ph值至1~5，30~150目滤网过滤，去除析出物，将滤液盐析后透析，得目的胶原。
在本发明的一种优选实施方式中，所述富含iii型胶原的组织为海参、小牛皮、胎牛皮、小猪皮、胎猪皮的一种或几种；小牛皮、小猪皮动物年龄在0~3个月。
在本发明的一种优选实施方式中，所述浸泡用碱溶液的质量分数为0.1%~40%(w/v)。
在本发明的一种优选实施方式中，所述浸泡用碱溶液的溶质为氢氧化钠、碳酸氢钠、柠檬酸钠中的一种或几种；ph为8~14。
在本发明的一种优选实施方式中，所述生理盐水溶质为氯化钠，浓度为0.7~0.9%。
在本发明的一种优选实施方式中，所述酶解液为酸性蛋白酶，效价为1:1500~1:12000，酸性蛋白酶：组织切片为1:50~1:1000(w/w);酶解液ph值为2~6。
在本发明的一种优选实施方式中，所述盐析用盐溶液的溶质为氯化钠、硫酸钠、硫酸铵、氯化钾、氯化钙中的一种或几种，浓度为20%~50%(w/v)。
在本发明的一种优选实施方式中，所述首次盐析前待盐析物的ph为7~13，再次盐析前盐析物的ph为1~5；调ph所用碱液为氢氧化钠溶液、碳酸氢钠溶液、柠檬酸钠溶液中的一种或几种；调ph所用酸液为盐酸溶液、柠檬酸溶液、硫酸溶液、磷酸、醋酸溶液的一种或几种，碱液浓度为0.01~5mol/l,酸液浓度为0.01~10mol/l。
在本发明的一种优选实施方式中，在对动物组织进行胶原提取之前，先对所述组织进行预处理；所述预处理为用水对组织进行反复冲洗，之后切片，再用质量分数为0.05%~20%醋酸氯己定溶液浸泡0.5~24h，再用水反复冲洗。
在本发明的一种优选实施方式中，所述切片为冷冻切片。
具体实施方式
需要说明的是，本发明所使用的水均为医药行业所用的纯化水或注射用水，满足药典标准。
试剂和仪器
试剂均市售可得。
实施例1
选取新鲜的小牛皮组织0.5kg，水清洗至无肉眼可见异物；用剪刀剔除脂肪，水洗后，-20℃冷冻过夜；切片机切片，切片厚度约1mm，备用；
称取100g切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡0.5h，纯化水浸泡清洗5次，沥去多余水分备用。再将切片组织清洗浸泡在0.3%(w/v)的碳酸钠溶液中，浸泡6h。纯化水清洗至ph为8，然后用0.7%生理盐水浸泡约2h，沥去多余水分，2~8℃组织捣碎；
配制酶解液，按酸性蛋白酶：组织切片为1:150的比例称取酸性蛋白酶，蛋白酶效价为1:3000，溶解到摩尔浓度为0.02mol/l的4000ml盐酸溶液中，搅拌均匀。调溶液ph为4。
将捣碎组织分散进酶解液中，最终定容到5000ml。4℃环境酶解72h；酶解完毕后，氢氧化钠溶液调ph值至13，4℃静置10h；
100目滤网过滤，去除未酶解物；20%(w/v)氯化钠溶液盐析，收集固形物，装入透析袋透析，检测氯离子浓度为生理盐水水平，获得多型胶原，最后将多型胶原混合物分散至水中，调ph值至3，100目滤网过滤，去除析出物，将滤液用20%(w/v)氯化钠溶液盐析，收集固形物，装入透析袋透析，检测氯离子浓度为纯化水水平，得目的胶原。
实施例2
选取新鲜的小牛皮组织0.5kg，水清洗至无肉眼可见异物；用剪刀剔除脂肪，水洗后，-20℃冷冻过夜；切片机切片，切片厚度约1mm，备用；
称取100g切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡5h，纯化水浸泡清洗5次，沥去多余水分备用。再将切片组织清洗浸泡在0.3%(w/v)的碳酸钠溶液中，浸泡6h。纯化水清洗至ph为7，然后用0.7%生理盐水浸泡约2h，沥去多余水分，2~8℃组织捣碎；
配制酶解液，按酸性蛋白酶：组织切片为1:300的比例称取酸性蛋白酶，蛋白酶效价为1:6000，溶解到摩尔浓度为0.02mol/l的4000ml盐酸溶液中，搅拌均匀。调溶液ph为3。
将捣碎组织分散进酶解液中，最终定容到5000ml。4℃环境酶解48h；酶解完毕后，氢氧化钠溶液调ph值至9，4℃静置16h；
100目滤网过滤，去除未酶解物；20%(w/v)氯化钙溶液盐析，收集固形物，装入透析袋透析，检测氯离子浓度为生理盐水水平，获得多型胶原，最后将多型胶原混合物分散至水中，调ph值至3，100目滤网过滤，去除析出物，将滤液用20%(w/v)氯化钙溶液盐析，收集固形物，装入透析袋透析，检测氯离子浓度为纯化水水平，得目的胶原。
实施例3
选取新鲜的小猪皮组织0.5kg，水清洗至无肉眼可见异物；用剪刀剔除脂肪，水洗后，-20℃冷冻过夜；切片机切片，切片厚度约1mm，备用；
称取100g切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡1h，纯化水浸泡清洗5次，沥去多余水分备用。再将切片组织清洗浸泡在3.0%(w/v)的碳酸钠溶液中，浸泡6h。纯化水清洗至ph为8，然后用0.7%生理盐水浸泡约2h，沥去多余水分，2~8℃组织捣碎；
配制酶解液，按酸性蛋白酶：组织切片为1:80的比例称取酸性蛋白酶，蛋白酶效价为1:1500，溶解到摩尔浓度为0.01mol/l的4000ml盐酸溶液中，搅拌均匀。调溶液ph为5。
将捣碎组织分散进酶解液中，最终定容到5000ml。37℃环境酶解1h；酶解完毕后，氢氧化钠溶液调ph值至10，4℃静置12h；
100目滤网过滤，去除未酶解物；30%(w/v)氯化钠溶液盐析，收集固形物，装入透析袋透析，检测氯离子浓度为生理盐水水平，获得多型胶原，最后将多型胶原混合物分散至水中，调ph值至4，100目滤网过滤，去除析出物，将滤液用30%(w/v)硫酸钠溶液盐析，收集固形物，装入透析袋透析，检测硫酸根离子浓度为纯化水水平，得目的胶原。
实施例4
选取新鲜的小牛皮组织0.5kg，水清洗至无肉眼可见异物；用剪刀剔除脂肪，水洗后，-20℃冷冻过夜；切片机切片，切片厚度约1mm，备用；
称取100g切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡30min，纯化水浸泡清洗5次，沥去多余水分备用。再将切片组织清洗浸泡在5%(w/v)的碳酸钠溶液中，浸泡6h。纯化水清洗至ph为8，然后用0.7%生理盐水浸泡约2h，沥去多余水分，2~8℃组织捣碎；
配制酶解液，按酸性蛋白酶：组织切片为1:150的比例称取酸性蛋白酶，蛋白酶效价为1:3000，溶解到摩尔浓度为0.1mol/l的4000ml磷酸溶液中，搅拌均匀。调溶液ph为4。
将捣碎组织分散进酶解液中，最终定容到5000ml。30℃环境酶解72h；酶解完毕后，氢氧化钠溶液调ph值至13，4℃静置24h；
100目滤网过滤，去除未酶解物；50%(w/v)氯化钠溶液盐析，收集固形物，装入透析袋透析，检测氯离子浓度为生理盐水水平，获得多型胶原，最后将多型胶原混合物分散至水中，调ph值至5，100目滤网过滤，去除析出物，将滤液用50%(w/v)氯化钠溶液盐析，收集固形物，装入透析袋透析，检测氯离子浓度为纯化水水平，得目的胶原。
实施例5
选取新鲜的小牛皮组织0.5kg，水清洗至无肉眼可见异物；用剪刀剔除脂肪，水洗后，-20℃冷冻过夜；切片机切片，切片厚度约1mm，备用；
称取100g切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡30min，纯化水浸泡清洗5次，沥去多余水分备用。再将切片组织清洗浸泡在0.3%(w/v)的碳酸钠溶液中，浸泡6h。纯化水清洗至ph为8，然后用0.7%生理盐水浸泡约2h，沥去多余水分，2~8℃组织捣碎；
配制酶解液，按酸性蛋白酶：组织切片为1:100的比例称取酸性蛋白酶，蛋白酶效价为1:3000，溶解到摩尔浓度为0.02mol/l的4000ml盐酸溶液中，搅拌均匀。调溶液ph为4。
将捣碎组织分散进酶解液中，最终定容到5000ml。4℃环境酶解72h；酶解完毕后，氢氧化钠溶液调ph值至13，4℃静置10h；
100目滤网过滤，去除未酶解物；20%(w/v)氯化钠溶液盐析，收集固形物，装入透析袋透析，检测氯离子浓度为生理盐水水平，获得多型胶原，最后将多型胶原混合物分散至水中，调ph值至3，100目滤网过滤，去除析出物，将滤液用20%(w/v)氯化钠溶液盐析，收集固形物，装入透析袋透析，检测氯离子浓度为纯化水水平，得目的胶原。
实施例6
选取新鲜的小牛皮组织0.5kg，水清洗至无肉眼可见异物；用剪刀剔除脂肪，水洗后，-20℃冷冻过夜；切片机切片，切片厚度约1mm，备用；
称取100g切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡6h，纯化水浸泡清洗5次，沥去多余水分备用。再将切片组织清洗浸泡在0.3%(w/v)的碳酸钠溶液中，浸泡6h。纯化水清洗至ph为8，然后用0.7%生理盐水浸泡约2h，沥去多余水分，2~8℃组织捣碎；
配制酶解液，按酸性蛋白酶：组织切片为1:300的比例称取酸性蛋白酶，蛋白酶效价为1:6000，溶解到摩尔浓度为0.02mol/l的4000ml盐酸溶液中，搅拌均匀。调溶液ph为4。
将捣碎组织分散进酶解液中，最终定容到5000ml。4℃环境酶解72h；酶解完毕后，氢氧化钠溶液调ph值至8，4℃静置10h；
100目滤网过滤，去除未酶解物；20%(w/v)氯化钠溶液盐析，收集固形物，装入透析袋透析，检测氯离子浓度为生理盐水水平，获得多型胶原，最后将多型胶原混合物分散至水中，调ph值至3，100目滤网过滤，去除析出物，将滤液用20%(w/v)氯化钠溶液盐析，收集固形物，装入透析袋透析，检测氯离子浓度为纯化水水平，得目的胶原。
实施例7
选取新鲜的小牛皮组织0.5kg，水清洗至无肉眼可见异物；用剪刀剔除脂肪，水洗后，-20℃冷冻过夜；切片机切片，切片厚度约1mm，备用；
称取100g切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡30min，纯化水浸泡清洗5次，沥去多余水分备用。再将切片组织清洗浸泡在0.3%(w/v)的碳酸钠溶液中，浸泡6h。纯化水清洗至ph为8，然后用0.7%生理盐水浸泡约2h，沥去多余水分，2~8℃组织捣碎；
配制酶解液，按酸性蛋白酶：组织切片为1:150的比例称取酸性蛋白酶，蛋白酶效价为1:3000，溶解到摩尔浓度为0.02mol/l的4000ml盐酸溶液中，搅拌均匀。调溶液ph为6。
将捣碎组织分散进酶解液中，最终定容到5000ml。4℃环境酶解72h；酶解完毕后，氢氧化钠溶液调ph值至9，4℃静置10h；
100目滤网过滤，去除未酶解物；30%(w/v)氯化钠溶液盐析，收集固形物，装入透析袋透析，检测氯离子浓度为生理盐水水平，获得多型胶原，最后将多型胶原混合物分散至水中，调ph值至2，100目滤网过滤，去除析出物，将滤液用30%(w/v)硫酸钠溶液盐析，收集固形物，装入透析袋透析，检测硫酸根离子浓度为纯化水水平，得目的胶原。
实施例8
选取新鲜的小牛皮组织0.5kg，水清洗至无肉眼可见异物；用剪刀剔除脂肪，水洗后，-20℃冷冻过夜；切片机切片，切片厚度约1mm，备用；
称取100g切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡0.5h，纯化水浸泡清洗5次，沥去多余水分备用。再将切片组织清洗浸泡在0.3%(w/v)的碳酸钠溶液中，浸泡6h。纯化水清洗至ph为8，然后用0.7%生理盐水浸泡约2h，沥去多余水分，2~8℃组织捣碎；
配制酶解液，按酸性蛋白酶：组织切片为1:150的比例称取酸性蛋白酶，蛋白酶效价为1:3000，溶解到摩尔浓度为0.01mol/l的4000ml盐酸溶液中，搅拌均匀。调溶液ph为3。
将捣碎组织分散进酶解液中，最终定容到5000ml。4℃环境酶解72h；酶解完毕后，氢氧化钠溶液调ph值至9，4℃静置10h；
100目滤网过滤，去除未酶解物；40%(w/v)氯化钠溶液盐析，收集固形物，装入透析袋透析，检测氯离子浓度为生理盐水水平，获得多型胶原，最后将多型胶原混合物分散至水中，调ph值至4，100目滤网过滤，去除析出物，将滤液用40%(w/v)氯化钠溶液盐析，收集固形物，装入透析袋透析，检测氯离子浓度为纯化水水平，得目的胶原。
实施例9
选取新鲜的小牛皮组织0.5kg，水清洗至无肉眼可见异物；用剪刀剔除脂肪，水洗后，-20℃冷冻过夜；切片机切片，切片厚度约1mm，备用；
称取100g切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡0.5h，纯化水浸泡清洗5次，沥去多余水分备用。再将切片组织清洗浸泡在0.3%(w/v)的碳酸钠溶液中，浸泡6h。纯化水清洗至ph为8，然后用0.8%生理盐水浸泡约16h，沥去多余水分，2~8℃组织捣碎；
配制酶解液，按酸性蛋白酶：组织切片为1:150的比例称取酸性蛋白酶，蛋白酶效价为1:10000，溶解到摩尔浓度为0.02mol/l的4000ml盐酸溶液中，搅拌均匀。调溶液ph为3。
将捣碎组织分散进酶解液中，最终定容到5000ml。35℃环境酶解48h；酶解完毕后，氢氧化钠溶液调ph值至12，4℃静置16h；
100目滤网过滤，去除未酶解物；20%(w/v)氯化钠溶液盐析，收集固形物，装入透析袋透析，检测氯离子浓度为生理盐水水平，获得多型胶原，最后将多型胶原混合物分散至水中，调ph值至5，100目滤网过滤，去除析出物，将滤液用20%(w/v)氯化钠溶液盐析，收集固形物，装入透析袋透析，检测氯离子浓度为纯化水水平，得目的胶原。
实施例10
选取新鲜的小牛皮组织0.5kg，水清洗至无肉眼可见异物；用剪刀剔除脂肪，水洗后，-20℃冷冻过夜；切片机切片，切片厚度约1mm，备用；
称取100g切片，浸泡在0.05%的醋酸氯己定溶液中浸泡30min，纯化水浸泡清洗5次，沥去多余水分备用。再将切片组织清洗浸泡在0.3%(w/v)的碳酸钠溶液中，浸泡6h。纯化水清洗至ph为8，然后用0.7%生理盐水浸泡约2h，沥去多余水分，2~8℃组织捣碎；
配制酶解液，按酸性蛋白酶：组织切片为1:150的比例称取酸性蛋白酶，蛋白酶效价为1:5000，溶解到摩尔浓度为0.02mol/l的4000ml盐酸溶液中，搅拌均匀。调溶液ph为4。
将捣碎组织分散进酶解液中，最终定容到5000ml。4℃环境酶解72h；酶解完毕后，氢氧化钠溶液调ph值至10，4℃静置10h；
100目滤网过滤，去除未酶解物；20%(w/v)硫酸钠溶液盐析，收集固形物，装入透析袋透析，检测硫酸根离子浓度为生理盐水水平，获得多型胶原，最后将多型胶原混合物分散至水中，调ph值至3，100目滤网过滤，去除析出物，将滤液用20%(w/v)氯化钠溶液盐析，收集固形物，装入透析袋透析，检测氯离子浓度为纯化水水平，得目的胶原。
以上所述仅是为了便于本领域的技术人员理解本发明的技术方案，并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。