氮杂双环戊萘类荧光分子探针及制备和应用

本发明属于新材料荧光探针领域，具体涉及一种氮杂双环戊萘类荧光分子探针及其制备和应用，适用于对细胞中不同细胞器标记成像。

背景技术：

1、细胞器是细胞正常工作和运转的基本结构基础，其活动与生命过程息息相关。如脂质滴是细胞中脂质储存和代谢的细胞器，其活动与脂质储存代谢、信号转导和细胞凋亡密切相关，脂质滴的运动失调已被证实与病毒感染、炎症、肥胖和癌症等多种疾病密切相关。细胞膜是细胞内外物质交换的屏障，其主要成分为蛋白质和脂质，是维持细胞内环境稳定和细胞间信号传导的结构基础，同时，细胞膜荧光成像是划分细胞边界的最有力手段。线粒体是真核细胞中过氧化磷酸化和脂质氧化反应的主要场所，为细胞活动提供能量，线粒体探针可用于研究线粒体功能或其对细胞代谢的影响。溶酶体可与细胞膜或细胞器膜结合，参与细胞中生物分子降解、细胞凋亡、信号传导等过程。因此，开发特异性的细胞器探针，并用于细胞内细胞器的定位和示踪具有重要的意义。

2、传统的荧光探针通常具有较大的共轭平面，表现出聚集引起淬灭(aggregation-caused quenching，acq)的性质。这些探针面临如斯托克斯位移小、发射半峰宽大、背景干扰等缺陷，在用作细胞器探针时，容易导致对细胞器成像不完全和信息缺失。2001，一类具有聚集诱导发光(aggregation-induced emission，aie)性质的分子被报道，其与acq类荧光材料具有完全相反的发光特点，具体表现为在溶解状态下不发射荧光，聚集之后则表现出强荧光。aie分子的发现解决了传统荧光分子在使用时聚集诱导淬灭的难题，从而拓宽了荧光材料的应用领域。近年来，具有溶液-固体双状态发射(dual-sate emission，dse)的新型荧光材料吸引了众多研究者的注意，dse类荧光分子具有更宽泛的应用范围。相较于传统的acq类荧光分子，aie和dse类荧光分子在细胞器成像表现出更大的优势，如生物相容性好、亮度高、特异性强、光稳定性好。此外，dse分子可以在低浓度到高浓度的一个宽范围内实现细胞器荧光成像。因此，越来越多的有机aie或dse小分子被开发为特异性细胞器荧光探针。

3、目前，在开发具有aie或dse性质的特异性细胞器荧光探针研究中，仍然面临诸多挑战，如：一、合成步骤复杂，大部分细胞器探针需要不同的定位基团，需要从头合成；二、荧光发射半峰宽大，不同探针之间信号相互干扰，不适于复杂细胞环境中的多重标记；三、斯托克斯位移小，激发波长对发射波长的信号形成干扰。

技术实现思路

1、针对现有技术的缺点或改进需求，本发明提供一种氮杂双环戊萘荧光分子探针，是一类氮杂双环戊萘类新型荧光分子探针，所述的氮杂双环戊萘类衍生物的结构如下：

2、

3、本发明的荧光分子探针i-1具有dse性质，探针i-2、i-3和i-4具有aie性质，不同探针对不同细胞器具有特异性的靶向作用，通过激发光作用下，在不同的细胞器中于不同的发射波长处产生相应的荧光信号，实现细胞器成像。其中，i-1可靶向细胞中脂质滴，激发波长为395nm，发射波长为520–580nm，表现为橙色荧光；i-2可靶向细胞中细胞膜，激发波长为374nm，发射波长为480–540nm，表现为绿色荧光；i-3可靶向细胞中线粒体，激发波长为372nm，发射波长为480–540nm，表现为绿色荧光；i-4可靶向细胞中溶酶体，激发波长为369nm，发射波长为480–540nm，表现为绿色荧。

4、本发明的荧光分子探针为dse或aie分子，具有斯托克斯位移大、细胞器专一性强、荧光强度高等优点，此外，本发明中aie分子还表现出特有的窄半峰宽的特点。

5、本发明的另一目的是提供所述氮杂双环戊萘类荧光分子探针的制备方法，通过以下步骤实现：

6、a)在吡啶中，4-叔丁基苯甲酰氯和咪唑在三乙胺的催化下生成m1；

7、b)在乙腈和二氯甲烷的混合溶剂中，中间体m1在碳酸铯的催化下与溴乙腈反应生成中间体m2；

8、c)在四氢呋喃中，中间体m2在叔丁醇钾的催化下生成化合物i-1；

9、d)在乙腈中，化合物i-1与不同的碘化物反应分别得化合物i-2、i-3、i-4。

10、合成路线如下：

11、

12、在步骤a)中，其优选条件为：在氮气保护下，将咪唑(0.68g，0.01mol)溶于4毫升无水吡啶中，并加入三乙胺(4.2ml,0.03mol)，将反应混合物用冰浴冷却，并在冰浴下逐滴加入4-叔丁基苯甲酰氯(5.88g，0.03mol)，然后将混合物在室温下搅拌2小时，小心地加入naoh水溶液(40％，w/w，2ml)，并将混合物回流1小时，将反应混合物倒入冷水(20ml)中并搅拌1小时，过滤得固体，固体用20毫升水洗涤三次并在70℃下干燥，得黄白色中间体m1。

13、在步骤b)中，其优选条件为：将中间体m1(0.912g，4.0mmol)溶于10毫升乙腈和10毫升二氯甲烷的混合溶剂中，室温下加入碳酸铯(1.564g，4.8mmol)并搅拌反应15分钟，然后逐滴加入溴乙腈(0.571g，4.8mmol)，将混合物于室温下再搅拌反应2小时，随后过滤反应液并将所得液体减压下浓缩，所得残留物在乙醇中重结晶得中间体m2。

14、在步骤c)中，其优选条件为：在氮气保护下，将中间体m2(0.801g，3mmol)溶于10毫升无水四氢呋喃中，在室温下加入叔丁醇钾(0.672g，6mmol)，将该混合物在室温下搅拌反应30分钟，然后再减压浓缩反应混合物，残留物经硅胶柱层析纯化得黄色固体i-1。

15、在步骤d)中，其优选条件为：将化合物i-1(50mg，0.1mmol)和1-碘十八烷(77mg，0.2mmol)或(4-碘丁基)三苯基碘化鏻(114mg，0.2mmol)或4-(2-碘乙基)吗啉(48mg，0.2mmol)溶于5毫升乙腈中，将混合液至于耐压管中于120℃下搅拌反应12小时，随后减压浓缩反应混合物，残留物中加入5毫升乙酸乙酯并超声30分钟，过滤，所得固体用5毫升乙酸乙酯淋洗两次，分别得黄色固体i-2、i-3和i-4。

16、本发明的再一个目的是提供所述氮杂双环戊萘类荧光分子探针在细胞器荧光标记和成像中的应用，其中所述细胞器为细胞膜、脂质滴、线粒体和溶酶体。

17、在含有活细胞的培养基中(dulbecco改良培养基，dmem)，直接加入本发明所述的荧光分子探针或加入溶解在如二甲亚砜、1，3-丙二醇、生理盐水等溶剂中本发明所述荧光分子探针的溶液，所述荧光探针被细胞摄取并在不同的细胞器如细胞膜、脂质滴、线粒体或溶酶体中聚集，在紫外光激发下发出荧光信号，从而完成对细胞中不同细胞器的标记，并实现细胞器的荧光成像。

18、所述荧光探针在培养基(dulbecco改良培养基，dmem)中的工作浓度为0.1μmol/l至1mol/l，优选为，1μmol/l至100μmol/l。

19、一些实施例中，所述紫外光波长为200nm至500nm，优选为350nm至450nm。

20、本发明提供的氮杂双环戊萘类荧光分子探针，具有dse或aie发光的特性，且半峰宽窄、斯托克斯位移大、光稳定性好、荧光强度高。此外，本发明中的氮杂双环戊萘类衍生物合成方法简单、操作简便。同时，该类荧光探针分子能特异性结合细胞中不同的细胞器，实现对特异性细胞器的标记和荧光成像。