一种高产高活性HRP的菌株及其快速筛选方法和应用与流程

本发明属于基因工程和微生物工程，具体涉及一种高产高活性hrp的菌株及其快速筛选方法和应用。

背景技术：

1、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,hrp)，是临床检验试剂中的常用酶。该产品广泛用于生化检测项目和免疫类(elisa)试剂盒中。hrp广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。市场上现有的hrp大多从植物辣根中提取，分离提取的天然hrp为含42种同工酶的混合物，虽然它们都是以铁卟啉为辅基的血红素蛋白，但是彼此之间的分子量、含糖量和等电点差别较大。想要获得较纯的hrp，需对同工酶混合物进行提纯。纯度不同的hrp应用范围也不相同，工业上通常用逐级分离的方式对其进行提纯。传统hrp的制备及提纯方法大致分为水提取、硫酸铵分级分离、丙酮分级分离、精制四大步骤，提取后需进行活力测定和蛋白质含量的测定，再按照不同纯度级别应用至不同场所。该传统的提纯方法步骤复杂，耗时耗力，在提取过程中酶量损失大，且纯化过程中容易导致酶活性丧失。因此，针对无法一次性获得大量高纯度的活性酶的问题，需要对hrp的提纯方法进行改进。

2、随着重组表达系统的发展和完善，有许多研究者对hrp进行了重组表达的尝试。有研究者将hrp在大肠杆菌中进行了异源重组表达，但因为大肠杆菌不能糖基化，不能形成正确折叠形成二硫键桥，所以未能获得可溶性表达，重组酶基本全部存在于无活性的、不可溶包涵体中，需要进行体外增溶和重折叠重新变复性，且包涵体复性过程复杂。也有在研究过程中检测到活性表达的，但是表达量与活性非常低，需要利用western blot才能检测到，检测耗时耗力。还有研究者将hrpc3基因用重组大肠杆菌ppic9k在巴斯德毕赤酵母中进行表达，但是表达酶活性非常低。还有研究者将其导入到甲醇酵母中表达，但是表达量及活性都很低，且检测方式原始而复杂。还有学者进行了一系列突变，使hrp在酵母中的表达活性有所上升，但是突变体的质粒提取、验证、测序筛选等工作耗时耗力，无法快速筛选出突变体库中的最佳菌株。

3、此外，现有的辣根过氧化物酶活性检测方法基本一致，都是在含有0.5mmol/labts(2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)和2.9mmol/l h2o2的150μl 0.2mmol/l柠檬酸钠缓冲液(ph＝4.5)中，加入10μl培养液上清，于25℃在96孔板上进行反应，测量405nm处的光吸收增加值，每分钟分解1μmol abts的酶活性为一个iu。也可以用tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)为底物代替abts进行检测。再有表达量超低的，则需要用抗hrp多克隆抗体进行western blot才能检测，可见检测活性方式较为复杂、检测速度慢。在进行大量筛选高活性菌株时耗时耗力，这也成为了hrp高活性菌株筛选的一个障碍点。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供一种高产高活性hrp的菌株的快速筛选方法。该方法摒弃传统的植物提取方法，改用微生物表达发酵方法，筛选出产单一的辣根过氧化物酶的菌株，避免了从多种同工酶中不断纯化的复杂步骤，且降低了酶量损失和酶活性丧失的可能性。

2、具体地，为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种高产高活性hrp的菌株的快速筛选方法，包括以下步骤：

4、(1)合成hrp表达基因，构建包含hrp表达基因的重组载体ppiczαa-ipa0130，以所述重组载体ppiczαa-ipa0130为模板进行易错pcr扩增；

5、(2)将载体ppiczαa酶切，与步骤(1)中得到的易错pcr扩增片段连接，转化至第一感受态细胞，培养后进行质粒抽提，得到ppiczαa/mtipa0130随机突变质粒；

6、(3)将所述ppiczαa/mtipa0130随机突变质粒进行线性化，转化至第二感受态细胞中进行扩大培养；

7、(4)采用深孔板培养的方式将步骤(3)中培养得到的菌液进行挑菌诱导培养，通过凝胶电泳筛选出hrp高表达的菌株，并检测表达得到的hrp的活性；筛选出高表达hrp且hrp具有高活性的菌株。

8、在优选的实施方案中，步骤(1)合成hrp表达基因时进行酵母密码子优化，得到的核苷酸序列如seq id no.2所示。

9、在优选的实施方案中，根据权利要求1所述的高产高活性hrp的菌株的快速筛选方法，其特征在于，步骤(1)中进行易错pcr扩增时的引物如下：

10、正向引物：tctcgagaaaagagaggctgaagct；

11、反向引物：atgatgatgatgatgatgatgatgaatagaagaaac。

12、在优选的实施方案中，步骤(2)中转化完成后，将长出的菌落直接全部刮板至低盐lb培养基培养，无需通过pcr验证来筛选出正确的单克隆。

13、在优选的实施方案中，步骤(4)中采用深孔板培养的方法包括以下步骤：

14、向已灭菌的深孔板中加入bmgy培养基，同时在zeocin抗性的ypd平板上画1cm×1cm方格；将点入所述深孔板中的菌液同时点在所述ypd平板上；将所述ypd平板放置于29℃恒温培养箱静置培养，待后期检测后用于下一步培养或者保藏菌种；从所述深孔板中挑好相应克隆后，用透气封板膜封住，在相应孔的膜上标记与所述ypd平板一致的克隆号，放入29℃摇床培养；培养结束后将所述深孔板中的菌液离心，去掉所述bmgy培养基，加入bmmy培养基重悬菌液，并在每个孔中加入甲醇诱导；分别在培养24h、48h后在每个孔中继续加入甲醇诱导；培养72h后离心，取上清液进行sds-page凝胶电泳。

15、在优选的实施方案中，步骤(4)中检测表达得到的hrp的活性的方法包括以下步骤：

16、在nc膜上的蓝色纸上画1cm×1cm小方格，让所述nc膜上留下印记；揭开所述蓝色纸，取步骤(4)中筛选出的hrp高表达的菌株的菌液的上清点在每个所述小方格的中心；以hrp标记的二抗做阳性对照；以诱导前的菌液做阴性对照；点样完成后，将所述nc膜及所述蓝色纸烘干；然后将鲁米诺ecl化学发光试剂均匀地加在每张所述nc膜的表面并覆盖待测样品，放入显影仪，进行曝光。

17、在优选的实施方案中，所述第一感受态细胞为dh5α；或/和所述第二感受态细胞为gs115。

18、根据本发明所述的高产高活性hrp的菌株的快速筛选方法筛选得到的菌株，用于大批量制备高活性的hrp。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明弃去传统的植物提取方法，改用微生物表达发酵方法，直接以含有hrp基因的重组质粒为模板进行易错pcr扩增来产生突变体，并将转化生长的菌株进行全部刮板提取质粒，直接进行转化筛选；减少了对突变体库的损耗，且省去了复杂的突变体质粒提取及验证过程；这样可以筛选出产单一辣根过氧化物酶的菌株，避免了从多种同工酶中不断纯化的复杂步骤，且降低了酶量损失和酶活性丧失。本发明选择用毕赤酵母进行表达，产生的酶直接进行纯化即可，不需要像原核包涵体一样进行变复性处理，节约了大量的试剂及时间；而且由于背景蛋白少，产生的hrp活性酶存在于上清中，易于后期纯化。本发明中用深孔板培养的方法代替原始的摇瓶培养方法，因而单人可同时操作大量培养板，可高速筛选出所需菌株，避免了对突变体库的筛选遗漏，且节约了大量的时间及人力成本。本发明中直接用nc膜和显影液检测hrp活性，简单、快速、有效，同批次可进行大量筛选，并减少实验中出错的可能。