一种短读长测序检测目标基因突变位点的引物及其设计方法和应用与流程

本技术涉及基因突变检测领域，具体涉及一种短读长检测基因突变位点的引物及其设计方法和应用。

背景技术：

1、基因检测是指通过血液、其他体液、组织、脱落细胞等对被检测者细胞中的dna分子信息作检测，通过与数据库对比，分析它所含有的各种基因情况，在精准医疗的时代，

2、基因检测应用于肿瘤基因检测、单基因遗传病、药物基因组、大健康等很多领域，多种疾病的诊断和治疗都离不开基因的检测。基因检测主要是对单核苷酸变异(snp)、单碱基突变(snv)、短片段插入/缺失突变(indel)、拷贝数变异(cnv)、重排(融合)等的检测。

3、基因检测最常用的方法之一是二代测序，二代测序也叫高通量测序，具有读长短、通量高的特点，可以实现对大批量基因序列的测序，大幅度降低了测序成本，让医学检测成为了可能，不过二代测序目前成本还不低，测序时间也长，还达不到qpcr的速度。对于基因突变位点的检测，由于位点的连续性及结构的复杂性，目前不管是用多重pcr测序还是用杂交捕获测序的方法，多用pe100、pe150或更长的长度进行测序，需要2-3天的测序时间，测序时间长、成本高，急需更短的读长来缩减检测周期，让患者更快的拿到检测结果，为用药做参考。

技术实现思路

1、本技术提供一种短读长测序检测目标基因突变位点的引物设计方法，在引物设计方面做特殊设计，让突变位点靠近测序端，控制pcr引物起点到突变点距离在50bp内，测序长度大于等于se50则可，采用多重pcr富集捕获的方法，可缩短三分之二到四分三的测序时间，用于测序检测时可在特异性引物的5’端接上illumina或mgi测序仪接头序列，以便与测序仪匹配。

2、本发明提供一种用于短读长测序检测目标基因突变位点的引物的设计方法，其特征在于，选自如下方法中的任一一种或多种的组合：

3、针对一般snv、snp位点：上下游各一条引物，上游引物到突变位点距离在50bp以内(参见图1)；

4、针对连续snv、snp位点：一条下游引物，连续的突变位点分别对应一条上游引物，上游引物到对应的突变位点距离在50bp以内(参见图2)；

5、针对固定位置indel位点：对于indel发生位置固定的位点，上下游各一条引物，上游引物到indel距离在45bp以内(参见图3)；

6、针对区域内变动indel位点：对于indel发生位置在一定区域内变动的位点，下游设计一条引物，上游引物设计连续的f端引物，覆盖完可能发生的区域，每对引物检测45bp内范围(参见图4)；

7、针对融合基因：在rna水平上设计引物，一段引物靠近融合断点位置，一般上游引物设计在主基因一侧，下游在融合基因位置，引物距离断点40bp内，保证足够的序列去比对下游基因(参见图5)。

8、本发明还提供一种用于短读长测序检测多种目标基因突变位点的引物组合，所述引物组合由seq id no：1～seq id no：31所示的序列组成或由seq id no：32～seq id no：52所示的序列组成。

9、本技术还提供一种所述引物组合在制备用于短读长测序检测肺癌致癌基因突变位点的产品中的用途。

10、可选的，所述产品为试剂盒。

11、可选的，所述肺癌致癌基因为egfr基因、alk基因、kras基因、braf基因、ros1基因、erbb2、ret基因和met基因中的至少一种；或所述肺癌致癌基因为egfr基因、alk基因、kras基因、braf基因、ros1基因、erbb2、ret基因或met基因作为主基因与各自对应的伴侣基因组成的融合基因。

12、可选的，所述egfr基因的突变位点为g719、s768、t790、l858、l861、19del和20dup中的至少一个。

13、可选的，所述braf基因的突变位点为v600。

14、可选的，所述alk基因的突变位点为g1202和l1196中的至少一个。

15、可选的，所述kras基因的突变位点为g12、g13、q61和a146中的至少一个。

16、可选的，所述ros1基因的突变位点为g2032、d2033和s1986中的至少一个。

17、可选的，所述met基因的突变位点为y1003和d1010中的至少一个。

18、可选的，所述erbb2基因的突变位点为20dup。

19、所述肺癌致癌基因可以是选自上述致癌基因的单个基因或多个基因的组合，也可以是选自上述基因的致癌基因作为主基因与对应伴侣基因的融合基因。可选的，肺癌致癌基因为包含alk、ret、ros1或met作为主基因与各自对应伴侣基因的融合基因，即所述致癌基因可以是alk与其伴侣基因的融合基因、ret与其伴侣基因的融合基因、ros1与其伴侣基因的融合基因及me t与其伴侣基因的融合基因。

20、本技术还提供一种用于短读长测序检测多种肺癌致癌基因突变位点的试剂盒，包括由seq id no：1～seq id no：31所示的序列组成的引物组合或由seq id no：32～seq idno：52所示的序列组成的引物组合。

21、本技术还提供一种所述引物组合或所述试剂盒在制备肺癌致癌基因文库中的用途，可选的，所述肺癌致癌基因为egfr基因、alk基因、kras基因、braf基因、ros1基因、erbb2、ret基因和met基因中的至少一种；或所述肺癌致癌基因为egfr基因、alk基因、kras基因、braf基因、ros1基因、erbb2、ret基因或met基因作为主基因与各自对应的伴侣基因组成的融合基因。

22、本技术还提供一种基于短读长测序构建肺癌致癌基因文库的方法，包括：

23、(1)多重pcr扩增：以待检测样本的基因组dna为模板并以seq id no：1～seq idno：31所示序列组成的引物组合为引物或以待测样本的反转录dna为模板并seq id no：32～seq id no：52所示序列组成的引物组合为引物，进行多重pcr扩增，获得第一轮pcr产物；

24、(2)index pcr扩增：将第一轮pcr产物纯化后用接头引物进行pcr扩增，得到测序文库。

25、可选的，所述接头引物为mgi测序仪或illumina测序仪测序文库构建的接头引物。

26、针对单个基因点突变检测时，第一轮扩增直接以检测样本的基因组dna为模板，针对融合基因的多个突变位点检测时，以检测样本的反转录dna为模板进行扩增。

27、可选的，第一轮多重pcr扩增时，可在融合基因的检测引物中加入gapdh基因的引物作为内参，监控整个实验过程，保证实验的有效性。

28、本技术设计的引物组合可在rna层面检测融合基因或在dna层面检测点突变；在dna层面检测点突变时，建库方法包括多重pcr和index pcr；在rna层面检测融合基因时，建库方法依次包括rna反转录、多重pcr和index pcr步骤。

29、与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果之一：

30、(1)在引物设计方面做特殊设计，让突变位点靠近测序端，控制pcr引物起点到突变点距离在50bp内，测序长度大于等于se50则可，可缩短三分之二到四分三的测序时间的测序时间，同时降低测序成本。

31、(2)仅需使用se50测序即可，不需用pe100或pe150测序，大大降低测序时间及测序成本。

32、(3)连续引物覆盖突变区域，多条f端引物对应单条r端引物。